Abstract

Crescimento evidência biológica e genética molecular sugere que o rompimento do equilíbrio entre secretada Frizzled-relacionadas Protein-1 ( SFRP1) e β-catenina desempenha um papel importante na iniciação e desenvolvimento de vários cancros. O objetivo deste estudo foi examinar se a expressão de SFRP1 e β-catenina está associada com as características clínico-patológico de pacientes com câncer de próstata (PCA), e avaliar seus papéis potenciais como biomarcadores preditivos e prognósticos. Neste estudo, um total de 61 pacientes com CaP e 10 pacientes com hiperplasia benigna da próstata foram incluídos, e que demonstraram que a expressão de SFRP1 e β-catenina foi correlacionada com o resultado, a taxa de sobrevivência de Gleason e resposta para a terapia endócrina de CaP. As taxas de sobrevivência de pacientes APC com baixa expressão SFRP1 (P = 0,016) ou expressão alta β-catenina (P = 0,004) foram significativamente mais pobre. A correlação negativa (r = -0,275, P = 0,032) entre SFRP1 e β-catenina foi observada pelo teste do qui-quadrado. A análise multivariada sugeriu que SFRP1 (hazard ratio, 0,429; intervalos de confiança de 95%, 0.227-0.812; p = 0,009) pode servir como um fator preditivo e prognóstico independente para CaP. Nós também mostrou que os níveis de proteína e mRNA de SFRP1 em linha de células CaP andrógeno-dependentes LNCaP foram significativamente maiores do que aqueles em linhas celulares de CaP andrógeno-independente DU145 e PC3. No entanto, o nível de proteína de β-catenina em células LNCaP foi significativamente mais baixa do que em células DU145 e PC3, e não se observou qualquer diferença significativa do nível de ARNm β-catenina em células LNCaP, células DU145 e PC3. PCR seqüenciamento bissulfito revelou significativamente menor nível de metilação do

SFRP1

promotor em células LNCaP do que em células DU145 e PC3. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que SFRP1, expressão que inversamente correlacionada com a de β-catenina, é um biomarcador preditivo e prognóstico favorável

Citation:. Zheng L, Sun D, ​​Fan W, Zhang Z, Li Q , Jiang T (2015) Valor diagnóstico da SFRP1 como favorável preditivo e prognóstico de biomarcador em pacientes com câncer de próstata. PLoS ONE 10 (2): e0118276. doi: 10.1371 /journal.pone.0118276

Editor do Academic: Craig N. Robson, Instituto Norte para Pesquisa do Câncer, REINO UNIDO

Recebido: 02 de agosto de 2014; Aceito: 12 de janeiro de 2015; Publicação: 26 de fevereiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios (21272032 para TJ) do National Science Foundation Natural da China (https://www.nsfc.gov.cn/publish /portal1 /). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) é um tumor maligno comum do sistema urinário, que é a sexta principal causa de morte relacionada com cancro nos homens [1-3], afeta gravemente a qualidade de vida do paciente. A história familiar da doença, etnia e idade avançada são reconhecidos como os principais fatores que impulsionam APC, enquanto patogênese detalhada desta doença ainda é inconclusiva [4]. Atualmente, a ressecção cirúrgica radical, radioterapia e terapia endócrina são usados ​​como tratamentos de CaP [5-8]. No entanto, esta doença é geralmente fatal para a maioria dos pacientes diagnosticados em estágios avançados. Portanto, é muito importante identificar biomarcadores preditivos e prognósticos valiosos para o diagnóstico precoce e para esclarecer a patogênese da CaP.

proteínas Wnt são secretadas proteínas glicosiladas e lípidos modificados ricos em cisteína, que desempenham papéis importantes em vários processos celulares, incluindo a diferenciação celular, proliferação, migração, actividade sináptica e desenvolvimento embrionário [9-14]. Estas proteínas de exercer as suas funções fisiológicas, através da via de sinalização Wnt. As proteínas Wnt ligam-se aos receptores de sete transmembranar (7-TM) da família frizzled, e, em seguida, activar uma complexa cascata de sinalização, por último conduzem à activação de genes alvo a jusante, tais como o

c-myc, c-jun, fibronectina

e

ciclina D1

[15,16]. β-catenina é um importante componente da via de sinalização Wnt, cuja localização alterada tem sido reconhecido como um marcador da activação da via de sinalização Wnt [16]. Na ausência de ligando de Wnt, citoplasmática β-catenina é degradada pelo complexo de destruição β-catenina composto de proteína andaime axina, caseína-quinase 1 (CK1), polipose adenomatosa coli (APC) e glicogénio sintase quinase 3 (GSK3), através da ubiquitina via -proteasome. No entanto, na presença do ligando de Wnt, ligando Wnt se liga ao seu receptor, resultando na inibição do complexo destruição β-catenina. Subsequentemente, as moléculas-catenina p não fosforilados acumular-se no citoplasma, uma parte do qual entrar no núcleo e exercer a sua função como um co-activador de factores LEF /TCF de transcrição, finalmente conduzem à activação de Wnt expressão de genes-alvo [9]. Atualmente, a evidência crescente sugere que a desregulação da via de sinalização Wnt está intimamente associada com PCA tumorigênese em adultos [17-20].

Secretado relacionados com frizzled proteína-1 (SFRP1), também conhecido como SARP-2, foi isolado pela primeira vez a partir de células osteoblásticas humanas, que pertence à família de glicoproteína secretada SFRP. Abriga dois domínios estruturais distintos, a saber, domínio netrin e domínio CRD. domínio CRD é homólogo aos receptores frizzled [16,21]. Estudos mostram que SFRP1 é um antagonista da via de sinalização Wnt, e pode ligar-se a proteínas Wnt via o seu domínio CRD de uma forma competitiva com o receptor transmembranar frizzled, que conduz à inibição da via de sinalização Wnt [22-25]. SFRP1 é necessária para o desenvolvimento da próstata, e exerce o seu papel como um modulador do estroma-a-epitelial parácrino do crescimento epitelial, ramificação morfogénese, e a expressão de genes epiteliais [26]. Também é reconhecido como um mediador candidato de estroma-a-epitelial de sinalização em CaP [27]. Inactivação de SFRP1 foi avaliado devido à alta metilação de

SFRP1

promotor do gene numa variedade de malignidades, incluindo CaP [28-35]. Além disso, SFRP1 inibe a actividade de transcrição do receptor de androgénio (AR) e a proliferação de células LNCaP dependente de androgénios [36]. O objetivo deste estudo foi examinar o papel de SFRP1 e expressão β-catenina na patogênese CaP humano.

Neste relatório, que mostrou que havia uma correlação negativa entre SFRP1 e β-catenina em tecidos humanos CaP avaliando as características clínicas-patológica. A análise multivariada revelou que SFRP1 pode servir como um fator preditivo e prognóstico independente para CaP. Os níveis de proteína e mRNA de SFRP1 em linha de células CaP andrógeno-dependentes LNCaP foram significativamente maiores do que aqueles em linhas celulares de CaP andrógeno-independente DU145 e PC3. No entanto, o nível de proteína de β-catenina em células LNCaP foi significativamente mais baixa do que em células DU145 e PC3, e não se observou qualquer diferença significativa do nível de ARNm β-catenina em células LNCaP, células DU145 e PC3. Também mostrou que o nível de metilação de

SFRP1

promotor foi significativamente menor em células LNCaP do que em células DU145 e PC3. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem que SFRP1 é provável que seja um biomarcador preditivo e prognóstico favorável.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo envolvendo participantes humanos foi aprovado pelo comitê de ética da Universidade de Medicina de Dalian. consentimento escrito foi obtido de todos os participantes humanos. Toda a pesquisa foi realizada de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki.

Cultura de Células e Experimento Reagentes

linhas de células CaP humano LNCaP, DU145 e PC3 foram obtidos a partir do banco de células do filial de Xangai da Academia chinesa de Ciências. As células LNCaP foram cultivadas em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Gibco, EUA), 100 ug /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. células DU145 foram cultivadas em meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Gibco, EUA), 100 ug /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. células PC3 foram cultivadas em DMEM /F12 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Gibco, EUA), 100 ug /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. Todas as células foram incubadas a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO

2.

coelho monoclonal anti-SFRP1 (ab126613) e monoclonal de rato anti-β-catenina (ab22656) foram obtidos a partir de Abcam (Cambridge, Reino Unido). Monoclonal de rato anti-β-actina (C4) (SC-47778), anticorpos de cabra anti-IgG de ratinho e IgG de cabra anti-coelho foram obtidos de Santa Cruz Biotech (CA, EUA). mistura de inibidores da protease foi adquirido a partir de Roche Applied Science (Basileia, Suíça). 5Aza foi obtido a partir de Sigma (Santa Clara, EUA). SmartPool siRNAs (Controle e β-catenina) com quatro siRNA individuais destinada a um único gene foram obtidos a partir Thermo (EUA).

amostras de tecido PCA para ensaio imuno-histoquímico

Foi obtido um total de 71 amostras do primeiro Hospital Afiliado da Universidade de Medicina de Dalian, Liaoning, China de 2002 a 2008, incluindo 61 amostras de pacientes que foram adenocarcinoma da próstata e 10 amostras de hiperplasia prostática benigna patologicamente ou citologia verificados. Todas as amostras de CaP foram de pacientes com idades variando de 44 a 84 (média de idade de 72 anos). Os graus de tumor foram registrados como pontuação de Gleason 7 (34 amostras), e Gleason score≤7 (27 espécimes). De acordo com o sistema do nó tumor metástase (TNM) desenvolvido pela Comissão Americana conjunta sobre Câncer (AJCC), todos os pacientes participaram desta pesquisa estavam em T

3 /T

4 /N

x-1 M

0 palco. amostras de hiperplasia benigna da próstata foram obtidas de pacientes para o tratamento de doenças não-tumorais, com idades entre 48-81 (média de idade de 71,8 anos). Todos os pacientes foram acompanhados até dezembro de 2013. O tempo de sobrevida variou de 3 a 60 meses, com um tempo médio de 38 meses. Durante este período, 38 pacientes morreram devido à recorrência do câncer

Os critérios de avaliação da resposta para a terapia endócrina:. (1) terapia endócrina eficaz. Após tratamento endócrino (medicamentos ou castração cirúrgica), retorna o nível de PSA ao normal e 2 ng /ml dentro de três anos. Não há novas lesões metastáticas aparecem no osso através de tomografia computadorizada, ressonância magnética ou digitalização ECT; (2) terapia endócrina ineficaz. Após o tratamento endócrino, o nível de PSA não reduz, ou transitoriamente diminui e depois aumenta. agrava a doença e novas lesões metastáticas aparecem no osso em dois anos.

imuno-histoquímica Ensaio

Todas as amostras foram analisadas por imuno-histoquímica. Os espécimes excisados ​​por operação foram fixados em formalina a 10% tamponada, durante 24 h, e em seguida, os tecidos fixados foram embebidos em parafina. Quatro secções micrômetros de amostras embebidas em parafina foram cortadas sucessivas para análise imuno-histoquímica com o auxílio de um kit de Histostain-Plus (Invitrogen, Camarilo, CA). Todas as secções foram desparafinados com xileno e reidratadas com solução de etanol graduada. H

2O

2 (3%) foi usada para extinguir as peroxidases endógenas das amostras, e, em seguida, as secções foram incubadas em soro de bloqueio durante 10 minutos a 37 ° C. As secções foram então coradas com tampão citrato (pH 6,0) contendo anticorpos anti-SFRP1 ou anti-β-catenina, a uma diluição de 1: 100 durante a noite a 4 ° C. As secções foram então incubadas com imunoglobulina de cabra biotinilada anti-coelho a uma diluição de 1: 200 durante 10 min à temperatura ambiente, e depois incubadas com avidina-biotina peroxidase complexo durante 10 min à temperatura ambiente. Finalmente, as secções foram incubadas com DAB (diaminobenzidina), utilizado como cromógeno.

casos de coloração SFRP1-positivos apresentaram grânulos marrom amarelo claras no citoplasma. β-catenina positiva casos de coloração exibiu claras grânulos marrom amarelo em cytomembrane e núcleo. Pontuação da coloração foi feita de acordo com os seguintes critérios: (1) de pontuação com base na intensidade de coloração. 0, nenhuma coloração de células; 1, as células com amarelo pálido; 2, as células com castanho claro; 3, as células com marrom. (2) Pontuação base na percentagem de células positivas. As amostras foram observadas sob ampliação de alta potência (400 ×). Foram seleccionados 10 campos aleatórios, e 100 células por campo foram contadas. coloração de células 25%; 0, 1, 25% -50% de coloração de células; 2, 51% coloração celular -75%; A coloração celular 75%, 3, . 3 foi reconhecida como amostras positivas, ao passo que (1) + (2) ≤3 foi reconhecido como amostras negativas

Western Blot Assay

LNCaP, DU145 e células PC3 tratadas com ou sem 5Aza (ADN inibidor metilação) foram colhidas e lisadas num tampão a frio (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, e mistura de inibidor de protease). Após centrifugação a 12.000 rpm durante 10 min a 4 ° C, as amostras de sobrenadante foram sujeitos a SDS-PAGE. Em seguida, as bandas de proteína no gel foram transferidas para poli fluoreto de vinilideno (PVDF) de membrana (Millipore), e sondados com anticorpo primário indicado durante a noite a 4 ° C. Em seguida, a membrana de PVDF foi incubada com o anticorpo secundário adequado durante 4 h à temperatura ambiente. Os resultados foram analisados ​​por detecção por quimioluminescência. Os dados foram quantificados por digitalizar as bandas apropriadas de interesse e plotados como a densidade relativa de escala de cinza. O experimento foi repetido três vezes.

RT-PCR quantitativo Ensaio

O RNA total de cada linha de células (LNCaP, DU145 e PC3) foi extraído usando o reagente RNAiso Plus (Takara, Dalian, China) de acordo com as instruções do fabricante. A transcrição reversa foi realizada com o auxílio de um kit de transcrição reversa (Takara, Dalian, China). PCR em tempo real foi realizado com o sistema em tempo real LightCycler de PCR (Roche Diagnostics, Basileia, Suíça). Foram utilizados os seguintes iniciadores concebidos por Primer Premier 5.0: 5′-CCCGAGATGCTTAAGTGTGACAA-3 ‘(sentido) e 5′-ACTCGCTGGCACAGAGATGTTC-3’ (anti-sentido) para

SFRP1

; 5′-AGAAAAGCGGCTGTTAG-3 ‘(sentido) e 5′-ATACAGGACTTGGGAGGT-3’ (anti-sentido) para

β-catenina

; 5′-CAGGTCATCACTATCGGCAA-3 ‘(sentido) e 5′-CAAAGAAAGGGTGTAAAACGC-3’ (anti-sentido) para

β-actina

. As amostras contendo ADNc, o par apropriado de iniciadores e os máximos SYBR Green qPCR Mistura Principal (Thermo) foram sujeitos a reacção seguinte: passo de desnaturação inicial de 95 ° C durante 10 min; e 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 15 s, e 72 ° C durante 20 s. O 2

– △△ método CT foi utilizado para análise de dados. Os níveis de mRNA de

SFRP1

e

β-catenina

foram normalizados para

β-actina

, que é servido como controle endógeno.

seqüenciamento bissulfito Ensaio de PCR (BSP)

ADN a partir de cada linha celular (LNCaP, DU145 e PC3) foi extraído usando um kit de purificação de ADN (Tiangen, Pequim, China) de acordo com as recomendações do fabricante. O ADN isolado foi tratada com bissulfito de sódio utilizando o kit de ADN CpGenome rápida modificação (Millipore) de acordo com as recomendações do fabricante. O ADN tratado com bissulfito de sódio foi amplificado por um GeneAmp 9600 PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Foram utilizados os seguintes iniciadores concebidos por Primer Premier 5.0: 5′-GGTTAAGGTAGGAGTATTATTTGAGGT-3 ‘(sentido) e 5′-AACCTAAATCATACTTACAAACCCAT-3’ (anti-sentido) com os de CpG Island 1 de

SFRP1

promotor; 5′-TTGTTTTTTAAGGGGTGTTGAGT-3 ‘(sentido) e 5′-TACCACAAACTTCCAAAAACCTC-3’ (anti-sentido) com os de CpG Island 2 de

promotor SFRP1

. Foram realizadas as seguintes condições reaccionais: 10 ciclos de 95 ° C durante 5 min, 95 ° C durante 30 s, 60 ° C-50 ° C durante 45 s (com início a 60 ° C para o primeiro ciclo, mas com a temperatura decrescente por 1 ° C durante cada ciclo subsequente), e 72 ° C durante 45 s; 33 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 50 ° C durante 45 s, e 72 ° C durante 45 s; e 60 ° C durante 30 min. Os produtos de PCR foram purificados utilizando um kit de purificação de ADN (Tiangen, Pequim, China), e foram clonados no vector de PMD-19T (Takara, 6013). Após a transformação, 10 clones positivos de cada amostra BSP foram escolhidos para sequenciação utilizando um analisador de DNA 3730xl (Applied Biosystems).

Análise Estatística

A qui-quadrado (

χ

2) teste foi usado para esclarecer a correlação entre SFRP1 e expressão β-catenina e características clínico-patológicas em tecidos CaP de 71 pacientes. as taxas de sobrevivência de pacientes foram analisadas pelo método de Kaplan-Meier. Spearman foi realizado para avaliar a relação entre SFRP1 e expressão β-catenina. Os dados foram expressos em média ± SDs. As diferenças entre os valores médios foram analisados ​​por ANOVA seguido por vários testes de comparação Student-Neuman-Keuls e analisa relação bi-variante. A significância estatística foi considerada em

P

. 0,05

Resultados

A expressão de SFRP1 e β-catenina está associado às características clínico-patológicas de CaP humano

expressão aberrante de SFRP1 e β-catenina desempenha um papel importante no desenvolvimento de uma gama de cânceres, como câncer de vias biliares, carcinoma mucoepidermóide, tumores adrenocorticais e câncer cervical [16,37-39]. No entanto, o papel de SFRP1 e β-catenina em CaP não tem sido elucidado. A fim de investigar seus papéis na APC, examinamos se a expressão de SFRP1 e β-catenina correlacionada com características clínicas-patológica entre as 61 amostras de CaP por

χ

2 de teste. Foram observadas diferenças estatisticamente significativas na pontuação de Gleason, a taxa de sobrevivência e de resposta para terapia endócrina para as duas proteínas, enquanto que foi observada nenhuma diferença estatisticamente significativa na idade, metástases antes da cirurgia e nível de PSA (Tabela 1). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a SFRP1 expressão e β-catenina correlacionada com a pontuação, a taxa de sobrevivência Gleason e de resposta para terapia endócrina de pacientes APC, enquanto não se correlacionou com a idade, metástase antes da cirurgia e nível de PSA.

o efeito de expressão SFRP1 na taxa de sobrevivência em pacientes CaP

Para determinar a relação entre a expressão SFRP1 /β-catenina e sobrevida global em APC, curvas de sobrevida foram atraídos pela Kaplan-Meier Método. Os resultados revelaram que os pacientes SFRP1 negativos apresentaram uma taxa de sobrevivência global significativamente mais pobres do que os pacientes SFRP1-positivos (p = 0,016, Fig. 1A). Em contraste, os pacientes β-catenina-positivos apresentaram uma taxa de sobrevivência global significativamente mais pobre do que pacientes de p-catenina negativo (p = 0,004, Fig. 1B). Estes resultados sugerem que a expressão SFRP1 negativa e expressão β-catenina positiva seriamente afetado a taxa de sobrevida global de pacientes com PCA.

A, A relação de expressão SFRP1 com a sobrevida global em pacientes com PCA (P = 0,016). B, A relação de expressão β-catenina com a sobrevida global em pacientes com PCA (P = 0,004).

Para avaliar a contribuição de características clínico-patológicas como potenciais biomarcadores preditivos e prognósticos, analisamos 6 variáveis ​​clínico-patológicas em 61 pacientes CaP de análise multivariada. Como mostrado na Tabela 2, a apenas expressão SFRP1 foi estatisticamente factor significativo (P = 0,009), e podia ser identificada como um indicador de previsão e de prognóstico independentes, indicando que a expressão SFRP1 pode servir como o melhor biomarcador preditivo e prognóstico de taxa de sobrevivência em CaP entre essas variáveis.

a expressão de SFRP1 e β-catenina está negativamente correlacionada em CaP

Para determinar a correlação entre SFRP1 expressão /β-catenina e ocorrência de APC, a expressão da proteína de SFRP1 e β-catenina em amostras de tumor da próstata, hiperplasia prostática benigna e foram comparados por imuno-histoquímica (Fig. 2). Analisou-se um total de 71 amostras de tecido (10 hyperpslasia prostática benigna e 61 tumores da próstata). De acordo com os critérios de classificação, 8 (80%) das 10 amostras de hiperplasia prostática benigna foram classificados como positivo para a expressão SFRP1 e 2 (20%) foram classificados como negativos, enquanto que em amostras de tumor, expressão SFRP1 diminuiu significativamente, com 36 (59% ) positivo e 25 (41%) negativo. Em contraste, em amostras de hiperplasia prostática benigna, 9 (90%) foram classificados como negativos para a expressão β-catenina e um (10%) foi classificada como expressão positiva, enquanto que a expressão β-catenina aumentou significativamente com 29 (47,5%) positivo e 32 (52,5%) negativo em amostras de tumor (Tabela 3). Para provar a especificidade do anticorpo β-catenina, siRNA knockdown experimento foi conduzido usando células PC3. A expressão β-catenina endógena foi reduzida em 86% em células PC3 transfectadas com piscina siβ-catenina em comparação com células PC3 transfectadas com siControl (Fig S1). Estes resultados indicam que a expressão SFRP1 foi diminuída, enquanto a expressão de β-catenina foi aumentada em CaP.

A, resultados representativos mostrando a coloração imuno-histoquímica de SFRP1 e β-catenina em uma seção de tecidos hiperplasia prostática benigna humanos. No painel da esquerda, as setas mostram que a localização de SFRP1 uniformemente distribuído no citoplasma. No painel da direita, as setas mostram que a localização de β-catenina foi membrana celular predominantemente. B, A coloração imuno-histoquímica de SFRP1 e β-catenina em uma secção de tecidos de cancro da próstata humanas (SFRP1 negativo e positivo β-catenina). No painel da direita, as setas mostram que β-catenina localizada principalmente no citoplasma e núcleo de ambos. C, A coloração imuno-histoquímica de SFRP1 e β-catenina em uma secção de tecidos de cancro da próstata humanas (SFRP1 positivo e negativo β-catenina). No painel à esquerda, setas mostram que a localização de SFRP1 era predominantemente no citoplasma.

Para examinar a relação entre SFRP1 e β-catenina em tecidos APC, os níveis de proteína de SFRP1 e β-catenina em amostras tumorais de próstata foram analisados ​​por testes de qui-quadrado. De acordo com nossos critérios de classificação, 36 amostras foram identificadas como expressão SFRP1-positivo, e 25 foram identificados como expressão SFRP1-negativos nas amostras de CaP 61. 23 (63,9%) das amostras SFRP1-positivas mostraram expressão β-catenina negativo, ao passo que apenas 9 amostras (36%) mostraram expressão β-catenina negativo em amostras SFRP1-negativas (Tabela 4). Estes resultados mostraram que houve uma correlação negativa entre SFRP1 e β-catenina em PCA (r = -0,275, P = 0,032).

Para determinar a mudança de SFRP1 e expressão β-catenina em diferentes linhas celulares de CaP, a proteína e os níveis de ARNm de SFRP1 e β-catenina em células LNCaP, células DU145 e PC3 tratadas com ou sem 5Aza foram examinados. Entre eles, LNCaP é uma linha celular de cancro humano da próstata dependente de androgénios, enquanto DU145 e PC3 são linhas de células humanas de cancro da próstata, os quais são mais altamente maligna de células LNCaP-independentes de androgénios. Com o grau maligna aumentou gradualmente, os níveis de proteína e ARNm de SFRP1 nas células CaP tratados sem 5Aza diminuiu significativamente, ao passo que ambos os níveis de mRNA de SFRP1 proteína e foram sobre-regulada nas células CaP tratados com 5Aza (Fig 3A . 3B) . No entanto, o nível de proteína de β-catenina aumentou significativamente nas células tratadas sem CaP 5Aza, e foi regulada para baixo nas células tratadas com CaP 5Aza (Fig. 3C). Não se observou qualquer diferença significativa do nível de ARNm β-catenina em células LNCaP, células DU145 e PC3 (Fig. 3D). Tomados em conjunto, estes resultados confirmaram que havia uma correlação inversa entre SFRP1 e expressão β-catenina em linhas de células APC, o que é consistente com os dados obtidos a partir de amostras de tecido do tumor.

A, LNCaP, DU145 e células PC3 tratou-se com ou sem 5Aza foram recolhidas e em seguida submetido a análise de transferência de Western com anticorpo anti-SFRP1. B, LNCaP, DU145 e PC3 células tratadas com ou sem 5Aza foram recolhidos e, em seguida, submetido a ensaio quantitativo de RT-PCR. O

SFRP1

nível de ARNm de células LNCaP foi definido como 1. C, LNCaP, células DU145 e PC3 tratadas com ou sem 5Aza foram recolhidas e em seguida submetido a análise de transferência de Western com anticorpo anti-β-catenina. D, LNCaP, DU145 e PC3 células tratadas com ou sem 5Aza foram recolhidos e, em seguida, submetido a ensaio quantitativo de RT-PCR. O

β-catenina

nível de mRNA de células LNCaP foi definido como 1. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes. Os dados apresentados nos gráficos são as médias ± desvios-padrão de três experiências. *,

P Art 0,05. ns, não significativo. A mancha de corpo inteiro da Fig. 3A é apresentado em S2 Fig.

As mudanças de

SFRP-1

gene de metilação em linhas celulares de CaP

A metilação do

SFRP1

promotor do gene foi relatado de conduzir a diminuição da regulação da proteína SFRP1 e os níveis de ARNm, e para desempenhar papéis importantes na iniciação e desenvolvimento de tumores. Dado que os níveis de proteína e ARNm de SFRP1 diminuiu significativamente com o aumento do grau de malignidade, e 5Aza, um inibidor de metilação do DNA, supra-regulados a proteína e os níveis de ARNm de SFRP1 em linhas de células APC, especulamos que SFRP1 silenciamento era susceptível de ser induzido pela

SFRP1

metilação do gene. Para investigar esta possibilidade, a metilação de

SFRP1

promotor do gene em células LNCaP, células DU145 e PC3 tratadas com ou sem 5Aza foi examinado por ensaio de BSP. Metilação geralmente ocorre em regiões promotoras CpG-ricos, ilha CpG nomeado com tamanho 100, GC% 50, Obs /Exp 0,6. análise bioinformática mostraram que 2 ilhas CpG pode ser metilado no

SFRP1

promotor do gene (regiões, de cor azul Fig. 4A). ensaio BSP mostrou que ambas as ilhas CpG no

SFRP-1 | promotor foram metilados em LNCaP, DU145 e células PC3. As taxas de metilação de ilhas CpG 1 e 2 em células LNCaP tratadas sem 5Aza eram 32,5% e 2,7%, respectivamente, ao passo que ambas as taxas de metilação caiu para 9,3% e 1,1% após o tratamento 5Aza (Fig. 4B). Em células DU145, as taxas de metilação de ilhas CpG 1 e 2 diminuiu de 36,7% e 85,6% para 12,6% e 47,9%, respectivamente, após tratamento 5Aza (Fig. 4C). Em células PC3, ambas as taxas de metilação diminuiu de 85% e 71% para 38,3% e 44,1% após o tratamento 5Aza (Fig. 4D). Estes resultados correspondeu com os dados obtidos a partir de análise de transferência de Western (Figura 3A . 3B), o que sugere que a sub-regulação dos níveis de mRNA de SFRP1 proteína e foi induzida por

SFRP1

metilação do gene com o aumento do grau de malignidade de linhas de células CaP

a, diagrama esquemático da região do promotor de SFRP-1 (regiões de cor azul: ilhas CpG.). CpG island 1 foi a partir de 1454 bp para 1613 bp. CpG Island 2 foi de 1831 pb para 2257 bp. B-D, A metilação de CpG Island 1 (painel da esquerda) e ilha CpG 2 (painel da direita) em células LNCaP, células DU145 e PC3, respectivamente, tratados com ou sem 5Aza. Cada círculo representa um metilado (preto) ou não metilado (branco) dinucleótido CpG. Cada linha representa um clone diferente.

Discussão

PCA é o câncer de pele não-mais comumente diagnosticado em homens com aumento da taxa de incidência a cada ano [40-42]. As características patológicas da ACP são imensamente complexos [43]. Tumores em muitos pacientes com PCA estão em uma forma indolente, que não têm efeito sobre a sobrevida dos pacientes e são frequentemente mantidos sob vigilância em vez de tratamento imediato, enquanto que uma pequena proporção de tumores pertencem a progredir rapidamente tumores malignos, que ameaçam seriamente a vida dos pacientes [44,45]. Além disso, devido às características fisiológicas e anatómicas de CaP, é difícil de observar os primeiros sintomas evidentes de pacientes, levando a um grande número de doentes diagnosticados numa fase avançada [46]. Portanto, é importante para melhorar o diagnóstico precoce para CaP através da identificação de biomarcadores preditivos e prognósticos. Neste estudo, foi demonstrado que o antagonista de Wnt SFRP1 era um biomarcador preditivo e prognóstico favorável e a sua expressão foi inversamente correlacionada com a expressão β-catenina.

via de sinalização Wnt desempenha um papel importante em vários processos celulares, tais como a diferenciação celular, proliferação e migração, e a sua desregulação correlaciona-se com várias doenças, incluindo o cancro [47]. A via de sinalização /β-catenina Wnt é anormalmente activado em uma ampla gama de malignidades humanas [48-54]. Esta activação aberrante contribui para tumorigênese de up-regulação da expressão de vários genes alvo a jusante, tais como

MDR-1, Vivendo, ciclina D1

e

c-Myc

[15,55]. β-catenina é um componente essencial da via de sinalização Wnt, e a sua localização alterada é reconhecido como um marcador da activação da via. Os dados da coloração imuno-histoquímica mostrou que a localização β-catenina em amostras humanas com hiperplasia prostática benigna foi predominantemente localizada na membrana celular com baixos níveis de expressão de proteína (Fig 2A painel direito.); No entanto, em amostras humanas de CaP, β-catenina localizada principalmente no citoplasma e núcleo com maior quantidade de expressão de proteína em comparação com a que em amostras de hiperplasia prostática benigna (Fig. 2B painel da direita). Tem sido relatado que β-catenina interage com AR e aumenta a actividade de transcrição estimulada-androgénio de AR, sugerindo que o papel do β-catenina em carcinogénese da próstata não pode ser limitado a activação da transcrição de TCF /LEF [56]. Neste estudo, mostraram que a expressão β-catenina foi positiva em 47,5% de amostras de APC, enquanto que apenas 10% foi observada (10/01) expressão positiva em amostras de hiperplasia prostática benigna (Tabela 2). A expressão positiva da β-catenina em CaP também foi significativamente correlacionada com pontuação de Gleason, a taxa de sobrevivência e de resposta para terapia endócrina (Tabela 1). Nós demonstramos que os pacientes APC com a expressão β-catenina positiva tiveram uma taxa de sobrevivência global significativamente mais pobres (Fig. 1B). Além disso, a expressão de β-catenina significativamente regulada para cima com o aumento do grau de malignidade (Fig. 3C). Estes resultados sugerem que a expressão de β-catenina está intimamente relacionado com prognóstico pior, e que a activação aberrante da via de sinalização Wnt contribui para o desenvolvimento de CaP.

SFRP1 exerce a sua função na via de sinalização Wnt como um antagonista do receptor frizzled bem conhecida, e tem sido sugerido para ser um supressor do tumor em vários cancros humanos [57,58]. Os dados da coloração imuno-histoquímica mostrou que a localização de SFRP1 uniformemente distribuído no citoplasma (Fig. 2A painel da esquerda), consistente com a sua expressão em vários outros tecidos [34,59]. No entanto, SFRP1 localização é predominantemente perinuclear citoplasmática em cânceres do trato biliar e da bexiga [16,60]. A diferença na distribuição de SFRP1 pode ser devido à expressão específica de tecido.