Abstract

O fator de transcrição elemento repressor silenciando (REST) ​​é uma coordenada regulador da transcrição e epigenética, que funciona como um supressor de tumor ou um oncogene dependendo do contexto celular, e uma variante de splicing REST4 truncado tem sido associada a vários tipos de cancro. Foi realizada uma análise abrangente de splicing alternativo (AS) do

RESTO

por amplificação rápida de cDNA termina e amplificação por PCR de ADNc de vários tecidos e linhas celulares com primers específicos. Foram identificados 8 novos exons alternativos incluindo um suplente último exão que dobra o

RESTO

limite gene, juntamente com inúmeros sites 5 splicing ‘/3’ e termina nos exons constitutivos. Com a combinação de diferentes padrões de splicing (por exemplo, exon pular e uso alternativo dos primeiros e últimos exões) que são preditivos de actividade DESCANSO alterada, pelo menos, 45 alternativamente variantes de ARNm de codificação e não codificantes splicing foram expressos numa célula e de espécies forma -type /específica para um tecido com diferenças individuais. Ao examinar o repertório de

RESTO

splicing de pré-mRNA em 27 pacientes com insuficiência renal, hepática e câncer de pulmão, descobrimos que todos os pacientes, sem exceção, mostraram expressão diferencial de vários

RESTO

variantes de processamento entre emparelhado tumor e tecidos normais adjacentes, com impressionante do tipo de células /tecidos e as diferenças individuais. Além disso, revelou que exon 3, que não causa nenhuma mudança de enquadramento, mas a perda de um domínio essencial para a translocação nuclear, foi afectada pela pioglitazona, um activador altamente selectiva do peroxissoma do receptor gama activado por proliferador (PPAR) que contribui para a diferenciação celular e tumorigênese além de suas ações metabólicas. Assim, este estudo demonstra uma extensa partir de

RESTO

pré-mRNA que redefine

RESTO

limite gene e estrutura, juntamente com um link geral, mas diferencial entre

RESTO

pré splicing do mRNA e de vários tipos de cancro. Esses achados avançam nossa compreensão do contexto-dependente complexa regulação do,

RESTO

expressão e função do gene, e fornecer potenciais biomarcadores e alvos terapêuticos para o cancro

Citation:. Chen GL, Miller GM ( 2013) Extensive splicing alternativo do Elemento de silenciamento Fator de Transcrição repressor foi relacionado ao câncer. PLoS ONE 8 (4): e62217. doi: 10.1371 /journal.pone.0062217

editor: Emanuele Buratti, Centro Internacional de Engenharia Genética e Biotecnologia, Itália |

Recebido: 14 de fevereiro de 2013; Aceito: 18 de março de 2013; Publicação: 16 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chen, Miller. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health concede DA025697 (GMM), DA030177 (GMM), e OD11103 (NEPRC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O splicing alternativo (AS), um processo para diferencialmente exons de link em um único precursor mRNA (pre-mRNA) para produzir dois ou mais diferentes mRNAs maduros, é um dos principais contribuintes para transcriptoma e diversidade proteoma, com 90% dos genes humanos submetidos COMO de uma maneira específica para tecidos e estágios de desenvolvimento [1], [2]. Reconhece-se agora que o acoplamento entre a transcrição e a emenda é crucial para como a regulação [3], [4], e que as junções exão-intrão ou os locais de junção (ss) são especificados por modificações epigenética dependentes do contexto celular [4], [ ,,,0],5]. Por conseguinte, modificações epigenética afectar não só a transcrição, mas também o splicing de co-transcricional [6], [7]. regulação epigenética de pré mRNA-splicing, em linha com a seleção espaço-temporal da SS, sugerem que como cross-conversações com estímulos ambientais para contribuir para adaptativa respostas e fisiopatologia da doença. De facto, como é modulada pelo relógio circadiano, stress psicológico, e numerosas hormonas e produtos químicos [8] – [10], enquanto que um valor estimado de 15-60% de doenças genéticas humanas, que vão desde a desordens neurológicas tumorigénicas e metabólicas, envolvem mutações de splicing [2], [11] – [14]

O fator elemento repressor silenciar transcrição (REST, também conhecido como NRSF para o factor de silenciamento neurônio restritiva), originalmente identificado como um repressor de genes neuronais não. células neuronais [15], [16], é agora reconhecida como uma coordenada regulador da transcrição e epigenéticos que orquestra o epigenoma celular tanto em células neuronais e não neuronais [17]. DESCANSO se liga a amplamente distribuído sequências reguladoras genómicas incluindo o repressor elemento-1 (RE1) por um domínio de ligação a DNA (DBD), que compreende 8 motivos dedo de zinco (ZFMs), enquanto que o seu efeito sobre a expressão do gene é mediada por dois domínios de repressão independentes ( RD1 e RD2) que directa ou indirectamente recrutar numerosos co-factores de transcrição e epigenética. Resumidamente, o N-terminal de RD1 recruta mSin3, um andaime de histona desacetilases (HDACs), enquanto os parceiros RD2 C-terminal com o co-repressor de repouso (COREST) ​​que, adicionalmente, recruta HDAC, proteína de ligação a metil-CpG 2 (MeCP2), histona H3K4 desmetilase lisina (LSD1) e metiltransferases H3K9 (G9a), bem como um componente da cromatina SWI /SNF-remodelação complexo Brg1. Através do recrutamento de vários co-factores para atingir loci de genes, DESCANSO promove dinâmica, organização dependente do contexto da cromatina e repressão /activação de milhares de genes envolvidos em muitos processos celulares, incluindo a tumorigénese, para que ele funciona como um supressor de tumor ou um oncogene dependendo do contexto celular [ ,,,0],18], [19]. A função diversificada, dependente do contexto de descanso é especificado por mecanismos múltiplos, incluindo a degradação proteossómica, translocação nuclear e o pre-mRNA splicing [20] – [23], bem como a modulação por RNAs não-codificantes (ncRNAs) e a afinidade de ligação de REST para diversificada RE1 e sites não-RE1 [24], [25].

em REST

sofre AS com um número limitado de variantes de processamento tendo sido relatados, dos quais um C-terminal truncado REST4 variante, que contém RD1 e ZFMs 1-5, tem sido bem documentado [20], [21]. Como um negativo dominante, REST4 está ligada a câncer de pulmão de pequenas células (CPPC), neuroblastoma e câncer de mama [26] – [28], e isso contribui para a programação de início da vida da resposta ao estresse, neuroproteção e regulação hormonal da glutamina synthethase [ ,,,0],29] – [31]. Outras duas variantes de processamento, REST1 que contém RD1 e ZFMs 1-4 [16], e REST 5FΔ com uma deleção do ZFM-5 [27], também foram documentados. Notavelmente, REST4 com ZFM-5 é transportado para o núcleo enquanto REST1 sem ZFM-5 não é [32], e que mais tarde foi demonstrado que ZFM-5 é essencial para o direccionamento nuclear de DESCANSO [33].

neste estudo, foi realizada uma análise abrangente dos aS do

RESTO

pré-mRNA e examinou sua relevância para o câncer. Nós demonstramos que: 1)

RESTO

sofre um extenso AS em um limite de gene dobrado agora por uma novela última exão (E

5), com numerosos codificação e mRNAs não codificante a ser formada com uma de espécies e célula de tipo /expressão específica de tecido; 2) numerosos

DESCANSO

variantes de processamento, que são causadas por vários padrões de splicing exão (por exemplo preditivo da actividade alterada DESCANSO pular e uso alternativo dos primeiros e últimos exões), mas geralmente são diferencialmente ligado a vários tipos de cancro ; e 3) o exão 3 (E

3) pular, o que provoca nenhum deslocamento quadro, mas a perda de ZFM-5 essencial para translocação nuclear, é extremamente afetada pela pioglitazona, um agonista altamente seletivo para o PPARy que modula a diferenciação celular e tumorigênese além de sua acções metabólicas. Esses achados avançam nossa compreensão da complexidade da

RESTO

regulação e função do gene, e fornecer potenciais biomarcadores e alvos terapêuticos para o cancro.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

o uso de tecidos humanos foi aprovado pela Harvard Institutional Review Board, e os projetos relacionados para o qual macacos e ratos foram sacrificados foram aprovados pelo Comitê Cuidado e uso Institucional animal para Harvard Medical School. O programa de gestão de animais Harvard Medical School é credenciada pela Associação Americana para o Acreditação do Laboratório Animal Care (AAALAC) e atende Institutos Nacionais de normas de saúde, conforme estabelecido no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Publicação DHHS n ° ( NIH) 85-23 Revised 1985). A instituição também aceita como obrigatória a Política PHS na Humane Cuidado e Uso de Animais de Laboratório pelas instituições premiado e Princípios NIH para a Utilização e Cuidados dos Animais Vertebrados Usados ​​em Testes, Pesquisa e Formação.

Animals (macacos e camundongos) envolvidos neste estudo foram tratados em conformidade com os Institutos Nacionais de Saúde, Departamento de Agricultura dos Estados Unidos e com as diretrizes da Harvard Medical School para a pesquisa animal. Macacos foram alojados individualmente e todos os esforços foram feitos para reduzir o desconforto e proporcionar oportunidades de enriquecimento (por exemplo, variou suplementos alimentares, forragem e métodos de alimentação orientados para a tarefa, e interação com profissionais de saúde e pessoal de investigação). Especificamente, os macacos foram alimentados duas vezes ao dia (AM and PM) com uma equilibrada disponível comercialmente Old Primate Diet Mundial (por exemplo Harlan Teklad 8714 Macaco Diet). De frutas e /ou vegetais suplementos foram fornecidos a todos os animais diariamente, e água potável foram fornecidas ad libitum por lixits de água automáticos ou garrafas de água de plástico. As amostras de tecidos foram recolhidos a partir de cinco macacos que tinham sido utilizadas em outras experiências no momento da sua necropsia. Os macacos foram sacrificados depois de ser anestesiado com HCl cetamina por uma overdose de pentobarbital por via intravenosa, e sangrados. Os ratos foram sacrificados com a inalação de gás dióxido de carbono seguido por deslocamento cervical, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Os tecidos humanos e animais

As amostras de cDNA derivadas de tecidos humanos adultos normais (rim, fígado, pulmão, hipófise, hipocampo, a amígdala e Pons, um para cada um) foram adquiridas a partir do Instituto BioChain®, Inc (Newark, CA). 27 pares de tumor e tecidos normais adjacentes de pacientes diagnosticados clinicamente com cancros de rim, fígado e pulmão (9 pares de cada) foram obtidos a partir do Centro de Cancro UMass Banco de Tecidos (5 pares para cada cancro do tecido como na RNAlater) e o Instituto BioChain® Inc (4 pares para cada cancro como ARN total). A informação demográfica dos pacientes mostrado brevemente na Tabela 1. As células mononucleares do sangue periférico humano (PBMC), que foram purificados como descrito anteriormente [34], foram gentilmente oferecida por Dr. Fred Wang no Brigham Hospital da Mulher. Nós também recolheu tecidos de macacos rhesus e camundongos sacrificados para outros projectos.

As linhas celulares e tratamento da toxicodependência

Um total de 18 linhas de células derivadas de humano (HEK293, HEK293T, HepG2, NCCIT, SH-SY5Y, A549, MCF7, K562, SK-N-MC, HeLa, Raji, TE671, Jurkat, estaminal pluripotente induzida Sup-T1 e (iPS)), primata não-humano (COS-7) e roedores (RN46A e PC12) foram utilizados neste estudo. Exceto para RN46A e iPS, todas as outras linhas 16 celulares foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). células RN46A foram gentilmente cedidas pelo Dr. Scott Whittemore [35], enquanto que as células iPS foram originados a partir de Dr. Stephen J. Haggarty [36]. Para examinar o efeito da pioglitazona na

DESCANSO

splicing pré-ARNm, o NCCIT, células HEK293T e HepG2 foram tratadas com 10? M de pioglitazona (Sigma-Aldrich) ou uma concentração correspondente de o solvente (0,04% de DMSO ), e as células foram colhidas 48 horas após o tratamento. Os tratamentos foram realizados em duplicado em 3 ocasiões independentes.

Isolamento de ARN e ADNc síntese |

O RNA total foi extraído usando o reagente Trizol® (Invitrogen). Uma alíquota de RNA total foi transcrito de forma inversa em ADNc utilizando o Kit de Transcrição Reversa QuantiTect® (Qiagen), enquanto a outra aliquota foi transcrito de forma inversa em ADNc utilizando um iniciador oligo-dT (sequência de âncora dada na Tabela 2) ancorado. cDNA sintetizado foi diluída para 50 ng /mL para uso.

PCR amplificação e seqüenciamento de DNA

Um protocolo de PCR aterragem foi empregada para ambos os PCRs padrão e aninhadas, e amplificações foram realizadas em um termociclador MJ Research PTC-200 Peltier térmica (GMI) num volume total de 20 ul contendo 1 ul de molde (50 ng /ul de cDNA para um padrão ou

r passo de PCR, e 1:20 produto diluído de 1

r passo de PCR para 2

ND passo de PCR interno), 10 pmoles de cada iniciador (Tabela 2), e 10 ul de GoTaq® master Mix verde (Promega). A primeira etapa de PCR interna foi realizada utilizando ADNc feitas por ancorada de oligo-dT como molde e o oligo-dT âncora emparelhado com E

1af

2, E

1BF

2 e E

1CF

2 como os conjuntos de iniciadores. Para tecidos humanos normais adultos sem cDNA feitas por ancorado oligo-dT disponíveis, a âncora oligo-dT foi substituído por E

4R

3 e E

5R

2 (fora E

4R

1 e e

5R

1, respectivamente). Primers para macaco rhesus e roedores foram modificadas, se necessário. As condições de amplificação envolveu um 2,5 min de desnaturação inicial a 95 ° C, seguido de 28 (por 1

r passo de PCR) ou 40 (para o padrão ou 2

ND passo de PCR interno) ciclos de 30 s de desnaturação a 95 ° C, 30 s de emparelhamento (temperatura a partir de 61 ° C e diminuiu de 0,5 ° C /ciclo, para os 12 ciclos iniciais, em seguida, fixado em 55 ° C), e extensão 60~180 s a 72 ° C, com uma última extensão de 5 min a 72 ° C. Os produtos de PCR foram carregadas num gel de agarose a 2% e amplicões de tamanho distinto foram excisadas, purificadas e sequenciadas. A sequenciação de ADN foi realizada como serviço comercial pela Funcional Biosciences Inc (Madison, WI). Os produtos da PCR com os dados de sequenciamento de má qualidade foram clonados no vector pGEM®-T (Promega) para posterior sequenciamento.

5 ‘/3’ amplificação rápida de extremidades de cDNA (RACE)

O RNA total gerado a partir de células HEK293, HEK293T, HepG2 e SH-SY5Y foram usadas para executar a RACE 5 ‘e 3’, que foram realizadas por dois conjuntos comerciais, o estojo RACE 5 ‘/3’ (2

ND Geração) a partir de Roche ( Indianapolis, IN) e GeneRacer® de Invitrogen, os quais diferem em estratégias de 5 ‘RACE. Para 5 ‘RACE com kit GeneRacer®, um RNA Oligo foi primeiramente ligado a RNA, seguida de síntese de cDNA usando Oligo-dT e nested PCR utilizando

RESTO

espec�icos reverter primers (ex E

4R

1 e e

4R

2) emparelhado com o iniciador um GeneRacer® 5 ‘(homólogo ao RNA Oligo). Para 5 ‘RACE com kit da Roche, cDNA foi sintetizado pela primeira vez a partir de RNA total usando um

RESTO

iniciador inverso espec�ico (por exemplo, E

4R

2, fora), seguido de rejeito com dATP e terminale transferase e subsequente PCR utilizando ancorado Oligo-dT ou âncora iniciador emparelhado com um

RESTO

espec�ico iniciador inverso (por exemplo, e

4R

1, no interior). Para executar 3 ‘RACE, cDNA foi sintetizado a partir do ARN total utilizando ancorado Oligo-dT, seguido por PCR usando

em REST

iniciadores directos espec�icos (por exemplo, E

1af

1 e E

1af

2) emparelhado com o iniciador de ancoragem.

quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR)

Usando os iniciadores listados na Tabela 2, desenvolvemos SYBR Green I e /ou a hibridação da sonda de qRT-PCR para junções exão-exão específicas e o exão 2 (e

2, representa presumivelmente expressão geral de codificação de ARNm, independentemente dos primeiros e últimos exões), bem como o gene de manutenção

GAPDH

. Os ensaios de qRT-PCR foram realizados como previamente descrito em um sistema Roche LightCycler 2.0 [37], com o ciclo limiar (Ct) valoriza a ser empregue para avaliar a mudança de expressão entre os tecidos ou células emparelhados pela 2

-ΔΔCt abordagem [ ,,,0],38]. As reações de PCR foram realizados em duplicado. Para o E

1a /E

4 junção que é expresso em níveis baixos na maior parte dos casos, apenas ensaio de SYBR Green I está disponível e os valores de Ct são provavelmente confundidos por dímero de iniciadores formados por iniciadores remanescentes excessivas, de modo que realizada qRT -PCR, utilizando o produto do 1

r passo de PCR como molde. Devido à elevada identidade de sequências entre as extremidades 3 ‘do E

2 e E

3, qRT-PCR específica para o ensaio E

2 /E

4 junção não era possível.

Bioinformática e análise de dados

Previsão do quadro de leitura aberta (ORF) de específico

em REST

variantes foi realizada utilizando o programa StarORF (https://star.mit.edu/orf /runapp.html), ea informação epigenética no

RESTO

lócus foi recuperado a partir do navegador UCSC Genome (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway). As comparações dos níveis de expressão de qRT-PCR-ensaiadas de junções exão-exão específicas entre tecidos ou células emparelhados foram realizadas pelo 2

-ΔΔCt abordagem utilizando de referência adequado, e a mudança de duas vezes foi considerado como significativo.

Resultados

identificação de e

2 /e

3 pular expressa em uma forma dependente da espécie

Foram realizadas PCRs padrão e aninhadas com amostras de cDNA derivadas de vários tecidos humanos (fígado, rim, pulmão, pituitária, hipocampo, amígdala e ponte) e linhas celulares (HEK293, HEK293T, HepG2, NCCIT, SH-SY5Y, A549, MCF7 e iPS). Usando um primer reverso E

4R

1 visando o exão proximal 4 (E

4) emparelhado com o primers E frente

1af

1 e E

2F

1 segmentação exons 1A (e

1a) e 2 (e

2) (Figura 1A e Tabela 2), respectivamente, foram identificados vários

RESTO

variantes de processamento com e

2 e /ou e

3 ignorado (Figura 1B e 1C). A variante com E

2 ignorado é abundantemente expressa em todas as linhas celulares testadas e os tecidos, excepto amígdala, enquanto que as variantes com e

3 sozinho ou mais E

2 ignorados foi expressa a níveis baixos em um subconjunto de tecidos e linhas de células. Notavelmente, E

2 /E

3 skipping é predominantemente associada a E

1a, mas raramente com E

1b e E

1c (Figura 1B). Além disso, E

2 /E

3 skipping foi observado em mais de 7 linhas de células humanas e das células mononucleares do sangue periférico (PBMC) (Figura S1).

(A) Ilustração de anotada

RESTO

exons e locais dos iniciadores utilizados para a identificação de

em REST

variantes de processamento. Os exons constitutivos (1a, 2, 3 e 4) e exons alternativos (1B, 1C e N) são mostrados em caixas abertas e cinza, respectivamente, enquanto o descendente e ascendente iniciadores são indicados por setas direita e esquerda, respectivamente. (B) Detecção de E

2 /E

3 pular em tecidos humanos e linhas celulares por PCRs aninhadas com conjuntos de primers específicos. E

2 /E

3 skipping é comumente associado com E

1a, mas raramente associada a E

1b e E

1-C. cromatogramas (C) de rastreio para junções exão-exão envolvidos em E

2 /E

3 ignorando. (D) Detecção de E

2 /E

3 pular em tecidos e linhas de células de primatas não-humanos e roedores por PCR aninhada. Dos numerosos tecidos rhesus, E

2 pular sozinho só foi observada na amígdala (a) e pineal (b).

Testamos se E

2 /E

3 salto é expresso em primatas não humanos e roedores tecidos e linhas celulares. Tal como mostrado na Figura 1D, saltando de E

2 sozinho foi apenas observada na amígdala e pineal de 17 tecidos obtidos a partir de um macaco rhesus, enquanto saltando de ambos E

2 e E

foi observada apenas 3 em PBMC de macaco e células COS-7 (derivadas de rim de macaco verde Africano); No entanto, foi observado sozinho saltando de E

3 na maioria dos tecidos de macacos e de linha de células COS-7. Em roedores, saltando de E

2 (sozinho e mais E

3) foi observada em RN46A mas não células PC12, enquanto saltando de E

2 sozinho foi observado no hipocampo a partir de 2 de 4 ratinhos testados, sugerindo uma diferença inter-individual. Da mesma forma, a diferença individual no

RESTO

pré-mRNA splicing também foi observada na ponte e rafe a partir de 4 macacos (Figura S2).

Descoberta de um romance último exão que dobra humana

RESTO

limite gene

Realizamos RACE para determinar as ‘e 3’ 5 de humano

RESTO

mRNA. Inesperadamente, nós identificamos um romance exão poliadenilado (E

5) que localiza ~ 30 kb a jusante da E

4 e parcialmente sobreposições na direção oposta, com o exão 5 do óxido nítrico associada-1 (

NOA1

) gene (Figura 2A), que codifica uma GTPase essencial para a síntese de proteína mitocondrial [39]. Por PCRs aninhados usando um E iniciador inverso

5-específico (E

5R

1) emparelhado com E

1af

1 e E

2F

1, respectivamente, nos encontrado que e

5 inclusão, ocasionalmente, em combinação com e

2 /e

3 salto, é expressa na maioria dos tecidos humanos e linhas de células (Figura 2b, 2c e na Figura S1). Como E

2 /E

3 skipping, E

5 inclusão está principalmente associada com E

1a, mas raramente com E

1b e E

1-C. Notavelmente, não encontramos variantes que contêm E

4 e E

5, sugerindo que E

4 e E

5 são mutuamente exclusivas e que E

4, como o caso para E

2 e e

3, pode ser completamente ignorada. Assim, o romance último exão E

5 quartos duplos a humanos

RESTO

limite gene de ~28 kb para ~59 kb (Figura 3A). E

5 inclusão não foi observado em primatas não humanos e roedores.

(A) Sequência de E

5 e a sua parcial (81 pb) com sobreposição

NOA1

gene direção oposta. (B) Detecção de E

5 inclusão em tecidos humanos e linhas celulares por PCR aninhada. (C) cromatogramas de rastreio para junções de E

5 com E

1a, E

2 e E

3. Note-se que o 3 ‘extremidades de E

2 e E

3 partes de identidade alta sequência.

(A) Identificado

em REST

exons e seus 5′ /3 ‘SS ou termina. O UCSC genes faixa foi utilizado para rapidamente indicar a localização cromossómica de

DESCANSO

locus do gene, enquanto que a sequência genómica NG_029447 foi utilizado como referência para esclarecer as posições exactas dos exões. Principais domínios da proteína de repouso (NP_005603) foram ilustrados paralela à região de codificação correspondente, de modo a prever as consequências de a partir de

DESCANSO

pré-ARNm ao nível da proteína. Os exons constitutivos e alternativos, bem como os seus 5 ‘/3’ SS ou terminar, são como indicado codificados por cores. Note-se que: 1) exão N na Figura 1 é renomeado como N

3c aqui; 2) E

2k é uma extensão do E

2-A, sem splicing; e 3) E

5 e N4B não são realmente apresentados em NG_029447. (b) os padrões de

RESTO

pré-mRNA splicing e variantes de mRNA resultante. variantes de codificação putativas são cores codificadas (azul-nenhuma mudança de aminoácidos prevista; proteína vermelho-truncada) ou sombreado (perda de ZFM-5). (C) Previsão de proteínas em REST truncada no terminal C para variantes de mRNA específicos. As junções exão-exão e códons de paragem prematuro são sublinhados.

extensa como de

RESTO

pré-mRNA

Ao examinar tecidos de primatas acima mencionados e linhas celulares , bem como tumor emparelhados e tecidos normais adjacentes de pacientes com câncer mencionados a seguir, que revelou uma extensa partir de

RESTO

pré-mRNA. Como mostrado na Figura 3A, além E

5 e o exão previamente relatada N (agora denominada como N

3-C), foram identificados outros exões 7 romance alternativos (N

1, N

2a, N

2b, N

3-a, N

3-B, N

4a e N

4-B), juntamente com numerosos 5 ‘/3’ SS e termina nos exons constitutivos e

2 e e

4. Independentemente do 5 ‘/3’ termina em E

2 e E

4, pelo menos, 45 variantes (S1-S45) são formados por vários padrões de splicing incluindo exon, alternativo 5 ‘/3’ SS, mútuo exclusão e uso alternativo dos primeiros e últimos exões (Figura 3B). As sequências das novas variantes foram depositados no GenBank com os números de acesso atribuídos JX896957-JX896993 e KC117262-KC117266.

29 das 45 variantes de processamento envolvem skipping total ou parcial de E

2, onde os iniciados de tradução, tais que podem funcionar como ncRNAs devido à falta do local de início da tradução (TSS), excepto que as várias variantes (S16, S19 e S28) cuja SST foi preservada são preditivos de isoformas proteicas DESCANSO truncadas N-terminais. Da mesma forma, skipping parcial ou completa de E

4, que é frequentemente acompanhada por E

2 pular e /ou E

5 inclusão, produz numerosas ncRNAs ou codificação preditiva mRNAs de isoformas da proteína RESTO truncadas. Em contraste, pulando do E 84-bp

3 (S4 e S34) não produz nenhuma mudança de quadro, mas a perda de ZFM-5. Notavelmente, as variantes com E intacta

2 (ou mais E

3) seguida por exões alternativos (mas não E

4) estão previstos para codificar proteínas DESCANSO truncados C-terminais, dos quais 8 variantes com e

3 codificam REST4 (S3 e S12) ou proteínas com RD1 e ZFMs 1-5 REST4-like (S2, S21, S31, S33, S39 e S41), enquanto outros 4 variantes (S34, S39-S41), com e

3 ignorada codificam REST1 com RD1 e ZFMs 1-4 (Figura 3C)

a maioria das 45 variantes de splicing são expressos em níveis baixos de uma forma do tipo de cula /tecido-específicos.; No entanto, pelo menos uma variante foi observada em todos os tecidos e linhas celulares testadas (Figura 1, Figura 2 e S3).

Ligação entre

DESCANSO

pré-mRNA splicing e cancro

Nós comparamos a expressão de padrões de splicing específicos e variantes entre tumor emparelhado (T) e (N) tecidos adjacentes normais de 27 pacientes com insuficiência renal (Ki), fígado (Li) e pulmão (Lu) (9 pares para cada câncer, Quadro 1) por PCR e ensaios de qRT-PCR, com foco em e

2 /e

3 skipping e uso alternativo dos primeiros e últimos exons. Os ensaios de qRT-PCR foram concebidos visando junções exão-exão específicas (Figura 4A), e mudanças de splicing específica entre T e N expressão estão apresentados nas dobras (T sobre N) para cada objecto (Figura 4B). Com a exceção de E

1a /E

3 e E

1a /E

4, que representam variantes S5 e S6, respectivamente, as junções exão-exão não representam necessariamente uma única variante de processamento específica , no entanto, que pode ser detectada por PCR aninhados (Figura 4C). Assim, tanto os ensaios de PCR aninhados qRT-PCR e foram levados em consideração para a comparação de

RESTO

perfil splicing de pré-mRNA entre os tecidos T e N emparelhados. Enquanto a grande expressão de E

2 /E

3 skipping e E

5 inclusão no humana foi ainda validado, descobrimos que todos os 27 pacientes, sem exceção, mostraram expressão diferencial de numerosos

DESCANSO

variantes de processamento causados ​​por padrões de splicing específicos entre emparelhado T e N tecidos, com um tipo de tecido marcante e diferença individual.

(a) Estratégia para o desenho de ensaio de qRT-PCR para junções específicas exão-exão. (B) muda de expressão (T mais de N, em dobra) de junções exão-exão específicas ensaiadas pelo ensaio qRT-PCR; (C) A expressão de específico

RESTO

variantes de processamento detectado por PCR. A frente e verso, primers são indicados por setas direita e esquerda, respectivamente. T emparelhado e N tecidos foram recolhidos a partir de 27 pacientes com insuficiência renal (Ki), fígado (Li) e pulmão (Lu), e o diagnóstico de base mostrado na Tabela 1 foi brevemente dada como suas iniciais 3 letras para cada paciente. mudanças de expressão (T sobre N, em dobra) de variantes ou splicing específicos (por exemplo, junções exão-exão) foram testados por qRT-PCR e calculado pelo 2

-ΔΔCt abordagem utilizando E

2 como referência. Os dados são apresentados como média ± SEM. ensaio de qRT-PCR não é atingível para E

3 saltando única (isto é, E

2 /E

4 junção), mas as alterações aparentes pode ser observada entre T e N tecidos para a maioria dos indivíduos por PCR aninhada usando o e

2F

1 /e

4R

1 conjunto de primers.

Como mostrado na Figura 4B e 4C, variantes com e

2 /e

3 ignorados foram diferencialmente expressos entre os tecidos T e N emparelhados para a maioria dos pacientes. De variantes utilizando E

4 como o último exão, S6 (tanto E

2 e E

3 ignorados) mostrou surpreendentemente expressão diferencial para todos os pacientes, excepto Lu # 4 e 7. Especificamente, 7, 5 e 1 pacientes com rim, fígado e câncer de pulmão, respectivamente, mostraram aumento da expressão S6, enquanto 2, 4 e 6 pacientes com rim, fígado e câncer de pulmão, respectivamente, apresentaram diminuição da expressão S6. Embora ensaio qRT-PCR para E

3 pular apenas (ou seja E

2 /E

4 saída) não é atingível, nested PCR com E

2F

1 /E

4R

1 mostrou aparentemente expressão diferencial de S4 entre emparelhado T e N para uma parcela dos pacientes. Enquanto isso, a expressão diferencial de E

2-ignorado variantes S5 e S15 entre emparelhado T e N a partir de alguns pacientes foi mostrado por qRT-PCR e PCR, respectivamente. Além disso, algumas outras variantes (por exemplo, S14, S16 e S17) com E

1b como o primeiro exão e E

2 parcialmente ignorados foi diferencialmente expressos entre emparelhado T e N para alguns pacientes. Por exemplo, S14 e S16 foram observados somente nos tecidos T de 4 pacientes (Ki # 5, 6 para S14 e Ki # 4, Lu # 9 para S16, respectivamente). Da mesma forma, de variantes que usam E

5 como o último exão, S34 (E

3 pulado), S35 (E

2 ignorado) e S38 (ambos E

2 e E

3 ignorada ) mostrou aparentemente expressão diferencial entre emparelhado T e N, como indicado pela PCR aninhadas com e

1af

1 /e

5R

1 e e

2F

1 /e

5R

1. Assim, E

2 /E

3 (especialmente E

3) skipping é geralmente mas diferencialmente ligado a diferentes tipos de cancro com diferenças marcantes do tipo de células /tecidos e individuais.

Como mostrado na Figura 4C, com exceção de 3 pacientes (Li Nº 5, 6 e 6 Lu #) sem expressão detectável de e

5 inclusão, todos os outros pacientes apresentaram expressão diferencial de e

variantes 5-compreendido entre emparelhado tecidos T e N. Particularmente, a expressão de S33 /S39, sem E

2 /E

3 skipping foi obtido e perdido nos tecidos T de 6 (Ki # 2, 9, Li # 1, 3, 7 e Lu # 3) e 4 (Ki # 1, 4, 7, 8 e Lu # 1) pacientes, respectivamente. Notavelmente, nested PCR com E

2F

1 /E

5R

1 mostrou que todos os 9 pacientes com câncer renal expressa E

5 em seus tecidos n, eles 3 (Ki # 1, 7, 8) perdida E

5 expressão nos seus tecidos T. Em contraste, todos os 9 doentes com cancro do fígado mostrou nenhuma E

5 expressão nos seus tecidos n, e um deles, 4 (li # 1, 2, 3, 7) adquirida E

5 expressão nos seus tecidos T. A expressão diferencial de E

variantes entre t emparelhado e N tecidos mostrados por PCR aninhado foi suportada por ensaio de qRT-PCR de E

3 /E

5 junção (Figura 4B) 5-incluídos.

Além disso, a variante de S18 que usa e

1C como o primeiro exão foi expresso diferencialmente entre emparelhados e N tecidos T para a maioria dos pacientes (22/27), com 12 e 10 pacientes, mostrando aumento e diminuição da expressão, respectivamente (Figura 4B e 4C). Enquanto isso, o ensaio de qRT-PCR indicaram que as variantes S1 e S11, que utilizam o E

1a e E

1b como o primeiro exão, respectivamente, mostraram alterações de expressão superior a 2 vezes entre emparelhados e N tecidos T para alguns pacientes (Figura 4B).