Sumário
A hipoxia é um fator adverso no cancro cervical, e expressão genética relacionadas com a hipóxia pode ser um biomarcador poderosa para identificar os tumores hipóxicos agressivos. A transcrição reversa quantitativa PCR (RT-qPCR) é um método valioso para estudos de expressão de gene, mas genes de referência apropriados para a normalização de dados que são independentes do estado de hipoxia e parâmetros clínicos de tumores cervicais são escassos. No presente trabalho, teve como objetivo identificar genes de referência para estudos de RT-qPCR de hipóxia em câncer cervical escamosa. A partir de 422 genes de referência candidatas seleccionadas a partir da literatura, foram utilizados perfis de expressão com base na matriz Illumina para identificar 182 genes que não são afectadas por hipoxia no cancro do colo do útero, ou seja, genes regulados por hipóxia em oito linhas celulares de cancro do colo do útero ou correlacionando com o contraste dinâmica associada à hipóxia parâmetro de ressonância magnética Enhanced a
Brix em 42 pacientes, foram excluídos. Entre os 182 genes, nove candidatos (
CHCHD1
,
GNB2L1
,
IPO8
,
LASP1
,
RPL27A
,
RPS12
,
SOD1
,
SRSF9
,
TMBIM6
) que não foram associados com o volume do tumor, estágio, comprometimento de linfonodos ou progressão da doença em dados da matriz de 150 pacientes, foram selecionados para testes adicionais por RT-qPCR. geNorm e NormFinder análises dos dados RT-qPCR de 74 pacientes identificados
CHCHD1
,
SRSF9
e
TMBIM6
como o melhor conjunto de genes de referência, com a expressão estável tanto em termos globais e entre os subgrupos de pacientes com status de hipóxia diferente (A
Brix) e parâmetros clínicos. A adequação dos três genes de referência foram validadas em estudos dos genes induzidos por hipoxia
DDIT3
,
ERO1A
, e
STC2
. Após a normalização, os dados de RT-qPCR destes genes mostrou uma correlação significativa com a expressão Ilumina (P 0,001, n = 74) e A
Brix (P 0,05, n = 32), e
STC2
os dados foram associados com os resultados clínicos, em conformidade com os dados Illumina. Assim,
CHCHD1
,
SRSF9
e
TMBIM6
parecem ser genes de referência adequados para o estudo da expressão de genes relacionados com a hipóxia em amostras de cancro cervical escamosas por RT-qPCR. Além disso,
STC2
é um promissor biomarcador hipóxia prognóstico no câncer cervical
Citation:. Fjeldbo CS, Aarnes EK, Malinen E, Kristensen GB, Lyng H (2016) Identificação e Validação de genes de referência para RT-qPCR Estudos de hipóxia em escamosas cervicais pacientes com câncer. PLoS ONE 11 (5): e0156259. doi: 10.1371 /journal.pone.0156259
editor: Christian Schönbach, Universidade Nazarbayev, CAZAQUISTÃO
Recebido: 23 de novembro de 2015; Aceito: 11 de maio de 2016; Publicado em: 31 de maio de 2016
Direitos de autor: © 2016 Fjeldbo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação. Todos os arquivos de expressão de genes Illumina estão disponíveis no banco de dados do GEO (GSE75034)
Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Pesquisa da Noruega, número Grant 226120 /O30, (https://www.forskningsradet.no /pt /Home_Page /1177315753906). O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Tumor hipoxia é um importante fator que leva à resistência à radioterapia, metástases e mau prognóstico para muitas doenças malignas incluindo cânceres cervicais [1-5]. Para medição das variações de expressão de genes relacionados com a hipoxia em amostras de doentes, a transcrição reversa de reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR-RT) é um método valioso devido à sua alta sensibilidade, a flexibilidade, baixo custo e facilidade de utilização [6-8]. Na análise de RT-qPCR, é importante escolher os genes de referência óptimos para a normalização dos dados para remover não-biológica, a variação induzida experimentalmente a partir dos dados. Para a normalização precisas e confiáveis, vários genes de referência são recomendados [6,7,9]. Determinação de genes de referência para estudos clínicos é particularmente desafiador, porque a estabilidade dos genes tem que ser verificada nos tecidos sob investigação e através de fenótipos tumorais e parâmetros clínicos.
Trabalhos anteriores sobre genes de referência no colo uterino tem focada em diferentes fases da carcinogénese do colo do útero, avaliando genes candidatos em todo o papilomavírus humano (HPV) negativos e positivos lesões [10], e em amostras normais, pré-cancerosas e cancerosas [11-13]. Para nosso conhecimento, genes de referência adequados para o estudo de expressão gênica associada à hipoxia em biópsias de cancro cervical não foram relatados. Muitos candidatos têm sido sugeridos para este fim de estudos experimentais onde as linhas de células são cultivadas sob concentrações de oxigênio baixos [9,14-17], mas apenas um estudo sobre câncer de cabeça e pescoço têm utilizado o status de hipóxia de amostras clínicas para a validação de tal candidatos [18]. avaliação específica do tumor local é necessária [9,15] e deve incluir as associações de características clínicas e evolução, além de status de hipóxia.
A maioria dos estudos em busca de genes de referência começa com um painel limitado de cerca de 8-25 candidatos seleccionado com base em genes normalmente utilizados na literatura, que não são necessariamente os mais genes expressos de forma estável. Utilizando dados de expressão do genoma inteiro para uma avaliação inicial dos candidatos pode ser útil para identificar o painel mais promissor de genes para testar em um ensaio RT-qPCR [19-24]. No presente estudo, esta abordagem foi utilizada para identificar genes de referência adequados para estudos de hipóxia em biópsias de cancro cervical. Uma revisão completa da literatura identificou 422 genes de referência potenciais, dos quais 410 candidatos estavam presentes em nossos conjuntos de dados e foram submetidos a uma avaliação inicial, usando perfis de 150 pacientes com câncer cervical e oito linhas celulares de cancro do colo do útero de expressão gênica. Nove genes, e não associadas aos parâmetros de hipóxia ou clínicos, foram ainda avaliados com RT-qPCR, e três deles foram selecionados como o melhor conjunto de genes de referência. A adequação dos genes de referência para a normalização dos dados foi confirmada em estudos de três genes induzido por hipoxia conhecidos relativamente ao estatuto de hipóxia do tumor e resultado clínico.
Materiais e Métodos
Ética declaração
O estudo foi aprovado pelo Comitê Regional de Medicina e Saúde de Ética em Pesquisa no Sudeste da Noruega (REC S-01129) e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.
coortes de pacientes e amostras tumorais
Totalmente 160 pacientes com carcinomas de células escamosas localmente avançado do colo do útero, prospectivamente recrutados para o nosso protocolo quimioradioterapia no Radium Hospital Norueguês 2001-2012, foram incluídos (Tabela 1). Illumina perfis de expressão de genes existem há 150 pacientes (Illumina de coorte, a Tabela 1) e foram usados para selecionar genes de referência candidato para testes com RT-qPCR (Fig 1). Para 42 destes pacientes, o parâmetro de imagem de contraste dinâmico associada a hipoxia reforçada (DCE) -magnetic ressonância (MR)
Brix [25] estava disponível e usado como medida do estado de hipoxia tumoral. Dez doentes independentes (RT-qPCR coorte 1) foram usadas para a pré-avaliação de nove genes candidatos. Além disso, 74 dos 150 pacientes na coorte de Illumina (RT-qPCR coorte 2) foram utilizados para posterior avaliação e validação de candidatos. Além disso, 22 biópsias de oito pacientes independentes (2-4 biópsias de cada paciente) foram utilizados para avaliar a heterogeneidade intra-tumoral (heterogeneidade coorte).
O volume do tumor ea presença de linfa patológica nós foram avaliados a partir de pré-tratamento imagens de RM. Um a quatro biópsias de tumor (cerca de 5 × 5 × 5 mm) foram tomadas no momento do diagnóstico, imediatamente congelado rapidamente e armazenado a -80 ° C. Todos os pacientes receberam radiação externa de 50 Gy para o tumor primário e as áreas eletivas, 45 Gy para os restantes pélvis, e adicional de 14 Gy para os nódulos linfáticos patológicas. Isto foi seguido por braquiterapia, de 25 Gy. cisplatina concomitante (40 mg /m
2) foi dada semanalmente no máximo 6 cursos de acordo com a tolerância. Os pacientes foram acompanhados de acordo com o procedimento padrão, como descrito [25].
cultura celular
Oito linhas celulares de cancro do colo do útero humanos a partir da American Type Culture Collection foram utilizados para avaliar os genes de hipoxia-responsive ; HeLa, SW756, C-33 A, C-4I, ME-180, HT-3, SiHa e CaSki. As linhas celulares foram autenticado pelo perfil STR /ADN utilizando PowerPlex 21 (Promega, Madison, WI) por Eurofins Genomics (Ebersberg, Alemanha). As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de CO a 5%
2 incubadora em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com GlutaMAX (Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA) suplementado com 100 U /mL de penicilina /estreptomicina (Sigma , St. Louis, MO) e soro bovino fetal a 10% (FBS, Gibco). As células foram rotineiramente testados para
infecção por Mycoplasma
. As células foram cultivadas durante 24 horas em 10 cm pratos de plástico (1-1,8 x 10
6 células para obter 4 x 10 ~
6 células após 48 horas de incubação), antes de exposição a hipoxia (0,2% S
2, 5% de CO
2) ou normóxica (95% de ar, as condições durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO
2). Uma câmara Invivo2200 (Ruskinn Technology Ltd., Bridgend, Reino Unido) foi utilizada para o tratamento de hipoxia.
Análise
A expressão de genes
isolamento do RNA.
O ARN total foi isolado a partir de células linhas utilizando RNeasy MiniKit (Qiagen, Germantown, MD) e a partir de amostras congeladas, utilizando o reagente Trizol (Life Technologies) (Ilumina coorte, RT-qPCR coorte 2) ou miRNeasy MiniKit (Qiagen) (RT-qPCR coorte 1, coorte heterogeneidade). Todos os espécimes clínicos tinham células tumorais mais do que 50% em hematoxilina e-eosina, derivados a partir da parte central da biópsia. Para além da heterogeneidade coorte, ARN de diferentes biópsias do mesmo tumor foi reunido e a concentração de ARN foi medida usando um espectrofotómetro NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA). a integridade de ARN foi confirmada pela Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA). Todas as amostras tinham um número de integridade do RNA (RIN) na faixa de 3,6-9,0 com uma mediana RIN de 7,1.
expressão gênica por matrizes talão Illumina.
Para todo genoma expressão gênica profiling, Illumina 48K matrizes talão com aproximadamente 48000 transcritos foram usadas; HumanWG 6-V3 (pacientes, as linhas celulares) e HumanHT-12 v4 (linhas celulares) (Illumina Inc., San Diego, CA). Os dados do paciente fazem parte dos conjuntos de dados utilizados no trabalho anterior [25]. cRNA foi sintetizado, etiquetado, e hibridado com as matrizes. extracção do sinal e normalização quantil foram realizadas utilizando o software fornecido pelo fabricante (Illumina Inc.), e os dados transformados-log2 foram utilizados nas análises. Os dados foram depositados no omnibus expressão gênica (GEO) do banco de dados (GSE75034).
Gene expressão por RT-qPCR.
Para as análises RT-qPCR, a Rápido Real-Time PCR System 7900HT (Applied Biosystems, Foster City, CA) foi aplicada, e as curvas de amplificação foram analisados utilizando o software SDS v2.3 (Applied Biosystems). O (# AM1906, Ambion, Austin, TX)
™ Kit livre de ADN foi utilizada para remover o ADN genómico, de acordo com a descrição do fabricante. A transcrição reversa foi realizada pelo High-Capacity cDNA kit de transcrição reversa (Applied Biosystems), que inclui iniciadores aleatórios, utilizando 2,000 ng de ARN tratado com ADNase numa reacção de 20 ul. 1 cDNA ul foi amplificada utilizando o TaqMan Mix Rápido Universal PCR Master (2x) e Personalizado matriz TaqMan placas de 96 poços rápidos com ensaios secos-down Gene TaqMan Expressão (Applied Biosystems), ou ensaios TaqMan de tubo único e placas de 96 poços rápidos . parâmetros termociclagem eram como descrito no protocolo personalizada de matriz, ou para ensaios de tubo único: 20 s a 95 ° C (de activação de enzimas), 40 ciclos térmicos de 1 s a 95 ° C (desnaturação) e 20 s a 60 ° C ( emparelhamento e extensão). ensaios TaqMan para genes de referência candidatos e três genes induzido por hipoxia avaliados neste estudo são apresentados na Tabela 2. Foram selecionados ensaios TaqMan inventariadas único pré-desenvolvidos. Para avaliação dos ensaios TaqMan, os tamanhos dos produtos de PCR foram determinadas por electroforese em gel, utilizando um ScreenTape D1000
® estação (Agilent Technologies). Para os três genes seleccionados de referência (ver abaixo) e os três genes induzidos por hipoxia, as eficiências de PCR foram determinados a partir de curvas de diluição de ADNc e apresentaram eficiências de reacção linear (S1) Fig.
Todas as amostras foram corridas em duplicado, e o ciclo médio quantificação (C
q) para cada amostra foi utilizada nas análises. As amostras com média C
q 37 ou desvio padrão 0,4 foram excluídos. Menos reversa transcriptase controlos foram testados para o DNA genómico residual para todos os ensaios TaqMan, e contaminação foi avaliado por controlos sem molde sem ARN para a síntese de cDNA. Todos os controles negativos teve indeterminado C
q. O nível de expressão de um gene alvo foi analisado utilizando o
Q-método comparativo C [26], normalizando os sub
valores de Q C do gene-alvo a um factor de normalização calculado como a média da C
q- valores dos genes de referência; Sc
q, gene = C
q, gene- (C
q,
CHCHD1
+ C
q,
SRSF9
+ C
q ,
TMBIM6
) /3 para os genes de referência identificados neste estudo (ver abaixo).
Estatísticas
O geNorm [6] e NormFinder [7] foram usados algoritmos para avaliar a estabilidade dos genes de referência candidato. O algoritmo geNorm baseia-se no princípio de que a relação de dois genes de referência ideais expressão é idêntico em todas as amostras. Para cada candidato, uma medida de estabilidade M é calculado como a variação média, em pares do gene com todos os outros candidatos; isto é, o desvio padrão da média das razões de expressão transformada-log2 entre os genes. Os genes com os menores valores de M são considerados como sendo mais estável. Os genes são classificados por exclusão gradual do candidato menos estável e novo cálculo dos valores M para os restantes genes é realizada até que os dois genes são mais estáveis à esquerda. Para determinar o número de genes de referência para incluir a normalização confiável, variação de pares entre dois fatores de normalização sequenciais (V
n /n + 1) foi calculada para todas as amostras, eo valor de corte para a inclusão de um gene adicional foi definida como 0,15 [6]. NormFinder é uma abordagem baseada em modelo de análise de variância, e foi usado para estimar a variação global de cada gene candidato e sua variação entre os subgrupos de pacientes, levando em conta tanto a intra e variações inter-grupo. As variações estimadas são combinados em um valor de estabilidade para cada gene, onde um valor baixo indica expressão mais estável [7].
de correlação de Spearman foi utilizado para estimar a associação entre variáveis contínuas, foi utilizado Mann-Whitney U. para comparar as diferenças nos níveis de expressão do gene entre os grupos, e de riscos proporcionais de Cox (PH) análise univariada foi utilizado para avaliar a relação de genes de referência candidato ao resultado clínico. O endpoint clínico era a sobrevivência livre de progressão (PFS) para acompanhamento até 5 anos. PFS foi definido como o tempo desde o diagnóstico de morte relacionada com a doença ou o primeiro evento de recaída. Mortes ocorridas dentro de 2 anos após a inclusão foram considerados como relacionados com a doença, a menos que uma outra causa foi documentada. Os pacientes foram censurados na sua última nomeação ou em 5 anos, e o estado foi avaliado em 3 de outubro de 2014. Um modelo de risco concorrentes foi usado para calcular a incidência cumulativa de progressão da doença, com a morte de outras causas do que o cancro do colo do útero como concorrente evento. Onze dos 160 pacientes incluídos morreu de outras causas sem experimentar recorrência durante o acompanhamento. Uma vez que cerca de 1/3 dos pacientes experimentaram a recorrência, curvas cumulativas de incidência foram comparados entre 1/3 da coorte com a mais alta expressão do gene e com 2/3 a menor expressão. O teste de cinza foi usado para avaliar diferenças entre as curvas. O nível de significância foi de 5%, salvo indicação em contrário, e todos os valores P foram em frente e verso.
Todas as análises foram realizadas com R [27] versão 3.1.1. Para as análises geNorm, o funções nos pacotes ReadqPCR e NormqPCR read.qPCR () e selectHKs () [28] foram aplicadas. Para o NormFinder analisa a função Normfinder () fornecido por Molecular Diagnostic Laboratory, Departamento de Medicina Molecular, Aarhus University Hospital Skejby, Dinamarca foi usado, e as análises de risco concorrentes foram realizadas com a função cuminc () no pacote cmprsk [29].
resultados e Discussão
seleção de genes de referência candidato de perfis de expressão com base na matriz
para identificar genes expressos de forma estável em amostras de cancro do colo do útero, a selecção dos candidatos foi limitado a genes que tenham sido previamente reportado como genes de referência na literatura [10,11,13,18,30-35], enquanto novos candidatos de referência com base em meta-análise de conjuntos de microarray ou seqüenciamento RNA dados em grande escala [19-23], ou presente no TaqMan Expresso controle endógeno humano Plate (Applied Biosystems). Isto resultou em uma lista de 422 genes diferentes, para as quais 410 estavam presentes na matriz Illumina utilizado no presente estudo (Fig 1, S1 Table), representado por 631 sondas diferentes.
Os candidatos mais prováveis entre os 410 genes foram identificados, utilizando Illumina perfis de expressão com base na matriz de 150 pacientes com câncer cervical e oito linhas celulares de cancro do colo do útero cultivadas sob normóxia e hipóxia. Primeiro, os candidatos foram excluídos com base na sua associação com uma resposta hipóxia no cancro cervical ou com parâmetros clínicos na coorte de paciente. Genes para os quais a expressão de, pelo menos, uma sonda no conjunto de dados clínicos correlacionada com a DCE-MRI parâmetro associado hipóxia-A
Brix (n = 42) foram removidos, bem como genes que foram mais do que 1,5 vezes o aumento ou downregulated sob hipoxia, em pelo menos uma das linhas celulares (S1 tabela). Além disso, foram excluídos os candidatos que mostram uma associação entre seus níveis de expressão e volume do tumor, estágio, status do nó de linfa, ou o resultado clínico em 150 pacientes (S1 tabela). Os genes removidos incluídos
GAPDH
,
HMBS
,
EEF1A1
,
ACTB
,
PGK1
,
RPLP0
e
TBP
, que foram identificados como genes de referência apropriados em estudos anteriores da carcinogênese cervical [10-13,36,37], e
B2M
,
HPRT1
,
RPL11
,
RPL37A
,
ACTR3
, e
NDFIP1
, que foram encontrados para ser adequado para estudos de hipóxia em câncer de cabeça e pescoço [18,30]. No total, 99 genes diferentes representados por 117 sondas manteve-se como candidatos de referência nesta fase. Para garantir a detecção dos genes de referência em ensaios de RT-qPCR, mais uma exclusão de genes com base em um nível de expressão muito baixo (média de expressão log2 de 150 pacientes 7) foi realizada, a redução deste número para 89 candidatos representados por 101 sondas.
Além de expressão estável, o gene de referência deve, idealmente, ter abundância transcrição semelhantes aos genes sob investigação para aumentar a sensibilidade para detectar as alterações de expressão de genes pequenos [24]. Descobrimos que os candidatos com o menor coeficiente de variação (CV) foram geralmente expressos em níveis elevados, uma observação também visto por outros [24], enquanto que a maioria dos genes regulados por hipoxia do nosso trabalho anterior [25] tinha um nível de expressão relativamente baixos ( dados não mostrados). Um painel final dos genes a serem avaliados por meio de RT-qPCR foi, por conseguinte, seleccionado para representar diferentes níveis de expressão além de manter o CV tão baixo quanto possível. Os candidatos também foram escolhidos de tal forma que eles representados diferentes vias ou classes funcionais de modo a minimizar o risco de selecção de genes co-regulados [6]. Finalmente, a disponibilidade de um ensaio TaqMan-pré-concebido e validado adequado foi utilizado como um critério de selecção. O painel de nove candidatos a ser testados em ensaios de RT-qPCR está listado na Tabela 1, e tinha CV na gama de 0,01-0,09 e a média dos níveis de expressão de log2 na gama de 7,4-14,0 nos dados clínicos estabelecidos. Entre estes genes,
GNB2L1
tenha sido previamente utilizado como gene de referência em estudos de hipóxia de câncer de cabeça e pescoço [18].
Pré-avaliação de 9 genes de referência candidatos por RT-qPCR
Para assegurar que os candidatos podiam ser correctamente detectado num ensaio de TaqMan e, eventualmente, limitar ainda mais o painel, uma pré-avaliação dos nove genes foi realizada em 10 pacientes (RT-qPCR coorte 1, Tabela 1, Figura 1) . Os ensaios de TaqMan foram avaliados pela primeira vez por electroforese em gel dos produtos de PCR a partir de um paciente (Fig 2A). Para todos os ensaios, foi vista uma forte banda de tamanho esperado. No entanto, para
SOD1
uma banda mais fraca adicional de tamanho menor que podem representar dímeros de iniciadores também apareceu, o que indica que o ensaio não foi trabalhar de forma óptima.
SOD1
foi, portanto, excluídos nas análises posteriores.
eletroforese (A) Gel dos produtos de PCR para os genes de referência de nove candidatos em um paciente. Inferior (25 pb) e superior (1500 bp) marcadores são mostrados em cada pista. símbolos de genes são indicados. A figura é uma imagem composta onde
CHCHD1
é a partir de uma imagem separada e a escada de cada imagem é mostrada. As linhas verticais indicam o corte da imagem ou imagens diferentes. parcelas (B) caixa de a média aritmética de
q-valores duplicados C para genes de referência de oito candidatos em 10 pacientes. Caixas de indicar o intervalo interquartil (IQR), com mediana como a barra central preto. Extensão barras verticais representa 1,5 x IQR abaixo do primeiro quartil e 1,5 x IQR acima do terceiro quartil, e círculos marcar suspeitos de outliers. (C) geNorm análise dos oito genes de referência candidato. estabilidade expressão médio (M) dos candidatos remanescentes após a remoção gradual do gene menos estável é mostrada. O gene menos estável em cada passo é indicado abaixo.
Os oito candidatos remanescentes foram detectados com C
sub valores de Q (D) Estabilidade valor de cada um dos oito genes de referência candidato a partir da análise NormFinder, em que um valor baixo indica uma expressão mais estável. variando 19,1-31,1, onde
GNB2L1
e
TMBIM6
foram os mais abundantes e
RPL27A
a menor transcrição abundante (Fig 2B). geNorm e análises NormFinder foram realizados para avaliar os genes de acordo com a estabilidade global entre os dez pacientes (fig 2C e 2D). A estabilidade de expressão H média a partir da análise geNorm variou de 0,72 usando todos os oito genes a 0,4 para os dois candidatos mais estáveis (Figura 2C). A classificação dos genes na análise NormFinder era quase idêntico ao geNorm Classificação (Figura 2D). Para uma análise mais minuciosa da estabilidade, incluindo a avaliação da estabilidade entre os subgrupos de pacientes, e determinação do número ótimo de genes de referência para incluir a normalização, os cinco genes expressos mais estavelmente como determinado pelos dois métodos, ou seja,
CHCHD1
,
GNB2L1
,
IPO8
,
SRSF9
e
TMBIM6
, foram examinados mais.
a determinação de uma RT-qPCR fator de normalização
Os cinco candidatos restantes foram avaliados por análise de RT-qPCR em 74 pacientes (RT-qPCR coorte 2, Tabela 1, Figura 1), resultando em
q-valores C entre 17,9 e 25,4 ( Figura 3A). geNorm e analisa NormFinder mostrou classificação semelhante dos genes de acordo com a estabilidade entre os pacientes (Fig 3B e 3C). A partir da análise geNorm, a estabilidade expressão média M variou de 0,57 usando todos os cinco genes para 0,45 usando os dois candidatos mais estáveis.
(A) Os diagramas de caixa da média aritmética de
q valores duplicados C por cinco genes de referência candidato em 74 pacientes. Caixas de indicar o intervalo interquartil (IQR), com mediana como a barra central preto. barras verticais estendidos representam 1,5 x IQR abaixo do primeiro quartil e 1,5 x IQR acima do terceiro quartil, e círculos marcar suspeitos de outliers. Análise (B) geNorm de cinco genes de referência candidato. estabilidade expressão médio (M) dos candidatos remanescentes após a remoção gradual do gene menos estável é mostrada. O gene menos estável em cada passo é indicado abaixo. valor (C) Estabilidade de cada um dos cinco genes de referência candidato a partir da análise NormFinder, em que um valor baixo indica uma expressão mais estável. Análise (D) geNorm variação emparelhados (V) para determinar o número suficiente de genes de referência do factor de normalização. variação Pairwise para dois factores de normalização sequenciais (V
N /N + 1) a partir de dois genes mais estáveis para todos os cinco genes. A linha horizontal indica o valor de corte (V = 0,15), para o qual inclusão de mais genes não tem efeito significativo sobre o fator de normalização.
Para avaliar o número suficiente de genes necessários para a normalização confiável , um procedimento passo a passo foi utilizado incluindo genes sequencialmente para o factor de normalização de acordo com as suas crescentes valores M até que nenhuma contribuição significativa foi alcançada. A variação de pares entre os fatores de normalização com três e quatro genes estavam abaixo do valor de corte (V
3/4 0,15), indicando que os três candidatos com menor valor M,
CHCHD1
,
SRSF9
e
TMBIM6
, são suficientes para a normalização (Fig 3D). Estes candidatos também foram encontrados para ser os três genes mais estáveis na análise NormFinder (Fig 3C). Além disso, o M-valor médio foi de 0,49 (Fig 3B), e abaixo do intervalo de 0,5-1, que deve ser necessário ao avaliar genes de referência em biópsias de cancro [38].
ainda avaliada a estabilidade do cinco candidatos entre os subgrupos de pacientes, utilizando o algoritmo NormFinder (Fig 4). Nesta análise,
CHCHD1
,
SRSF9
e
TMBIM6
também apareceu como os genes de referência ideais. Eles eram os candidatos mais estáveis em todo pacientes com estágio de baixa e alta tumor ou volume e com e sem recorrência, e para pacientes com e sem envolvimento de gânglios linfáticos no momento do diagnóstico dos três candidatos estavam entre os quatro genes mais estáveis. Além disso, na análise do estado de hipoxia tumor,
CHCHD1
,
SRSF9
e
TMBIM6
foram os candidatos mais estáveis em toda a pacientes com alta e baixa A
Brix ( Fig 4). Para validar ainda mais a estabilidade destes três genes, a análise de dados sobre geNorm RT-qPCR a partir de amostras de normóxia e de hipóxia de oito linhas celulares de cancro do colo do útero foi realizada. O M-valor médio para os três genes foram de 0,79, indicando uma expressão estável através normóxia e hipóxia condições de cultura [38]. Assim,
CHCHD1
,
SRSF9
e
TMBIM6
parecia ser bem adequado para calcular um fator de normalização e foram selecionados para validação em estudos de expressão gênica induzida por hipoxia (Fig 1).
NormFinder análises da estabilidade de cinco genes de referência candidato entre os subgrupos de pacientes. Os subgrupos avaliados foram: baixa (n = 49) e alta (n = 25) o estágio do tumor (FIGO 1B-2B vs. 3A-4A), com (n = 32) e sem (n = 42) dos linfonodos (LN) envolvimento no momento do diagnóstico, abaixo (n = 36) e anterior (n = 36) um volume de tumor mediano de 44,6 cm
3, com (n = 32) ou sem (n = 42) recorrência de tratamento em cinco anos, e diferente estado de hipóxia representado por abaixo (n = 16) e superior (n = 16) uma mediana a
Brix.
Validação de
CHCHD1
,
SRSF9
e
TMBIM6
como genes de referência em estudos de hipóxia
análises RT-qPCR foram realizadas por três genes que temos anteriormente relatados para ser induzido por hipoxia em linhas celulares de cancro do colo do útero e associado com a
Brix no cancro do colo do útero [25], ou seja,
DDIT3
,
ERO1A
e
STC2
. A coorte RT-qPCR 2 de 74 pacientes, para os quais tínhamos dados de expressão Illumina, foi utilizada. A electroforese em gel dos produtos de PCR revelou que os ensaios de TaqMan funcionou correctamente, a geração de um único produto específico do tamanho esperado para cada um dos três genes (Figura 5A). Os níveis de expressão
DDIT3
,
ERO1A
e
STC2
foram calculados através da normalização da
q valores de C à média C
q-valor
CHCHD1
,
SRSF9
e
TMBIM
6. O
Q-valor -ΔC foi mostrado ser altamente correlacionados com os dados Illumina para todos os três genes (P 0,001; ρ 0,78-0,83). Além disso, correlações negativas significativas entre -ΔC
q e A
Brix foram encontrados, de acordo com as correlações obtidas com os dados Illumina (Tabela 3). Os genes de referência identificadas, portanto, parece apropriado para a medição de alterações induzidas por hipoxia em câncer cervical.
(A) Gel de electroforese dos produtos de PCR para os três genes induzido por hipoxia
DDIT3
,
ERO1A
, e
STC2
. Inferior (25 pb) e superior (1500 bp) marcadores são mostrados em cada pista. A figura é derivado de uma imagem, e as linhas verticais indicam recorte da imagem. A incidência cumulativa de progressão da doença em 74 pacientes, divididos em baixa ( percentil 67%) e alta (percentil ≥ 67%)
STC2
expressão com base em (B) dados de expressão Illumina e (C) dados RT-qPCR normalizada com
CHCHD1
,
SRSF9
e
TMBIM
6 (-ΔC
q). 60 meses de probabilidade de recorrência, o P-valores de teste e número de pacientes em risco de Gray são indicados. Morte por outras causas que não o câncer cervical foi incluído como um evento concorrentes (n = 5). (D) a variabilidade intra-tumoral em
STC2
níveis de expressão medidos por RT-qPCR em oito tumores independentes com 2-4 biópsias por tumor, ou seja, no total de 22 biópsias. Medição da
STC2
foi vencida por uma das biópsias de tumor 4.
STC2
dados foram normalizados com o
CHCHD1
,
SRSF9
e
TMBIM
6. As amostras foram classificados em um grupo de alta e baixa expressão usando o mesmo corte como na Figura 5C (isto é -ΔC
q = -4,46). Diferentes biópsias do mesmo tumor foram representados graficamente com a mesma cor para facilitar a interpretação da figura.
Uma vez que a hipoxia é conhecida por estar associada com a agressividade em cancro cervical [3-5] , avaliamos o valor prognóstico da
DDIT3
,
ERO1A
e
expressão STC2
nos conjuntos de dados Illumina e RT-qPCR. Com base nos dados Illumina de 150 pacientes, um aumento estatisticamente significativo da progressão da doença foi encontrada em pacientes com a mais alta expressão da
DDIT3
ou
STC2
comparado aos demais (P = 0,047 e P = 0,015, respectivamente, teste de Gray; dados não mostrados), ao passo que
ERO1A
expressão não foi associada com resultados (dados não mostrados). Na coorte de RT-qPCR 2 de 74 pacientes, a associação mais forte para o resultado foi encontrada para
STC2
em ambos os conjuntos de dados e para os dados RT-qPCR a relação foi estatisticamente significativa (Fig 5b e 5c).