Abstract

A linha de células 22Rv1 é amplamente utilizado para pesquisas sobre o câncer de próstata e outros estudos em todo o mundo. Estas células foram estabelecidas a partir de um tumor de próstata humano, CWR22, que foi passada seriadamente em ratinhos nus e seleccionada para a independência de androgénio. As células 22Rv1 são conhecidos para a produção de títulos elevados de vírus xenotr�ico relacionadas com o vírus da leucemia murina (XMRV). Estudos recentes sugerem que XMRV foi inadvertidamente criado na década de 1990 quando dois vírus da leucemia murina (MLV) genomas (pré-XMRV1 e pré-XMRV-2) recombinado durante passaging do tumor CWR22 em camundongos. A conclusão de que XMRV originado de ratos e não o paciente foi baseado parcialmente em falha para detectar o XMRV em xenoenxertos CWR22 início. Enquanto que a dedução é certamente justificada, examinamos a possibilidade de que um vírus estreitamente relacionados poderia ter estado presente no tecido do tumor primário. Aqui mostramos que temos localizado o tecido de tumor da próstata de CWR22 original é excisado do paciente e ter ensaiado o ADN correspondente por PCR e as secções de tecido por fluorescência

In situ

de hibridação para detectar a presença de um vírus XMRV ou semelhante. Os tecidos tumorais primários faltava o ADN do rato, tal como determinado por PCR para ADN intracisternal Um tipo de partículas, evitando-se, assim, uma das limitações de xenoenxertos que estudam. Mostramos que nem XMRV nem um vírus estreitamente relacionados estava presente no tecido da próstata primário do CWR22 paciente. Nossos achados confirmam e reforçam a conclusão de que XMRV é um vírus do mouse gerado em laboratório recombinante que é altamente adaptado para células cancerosas humanas da próstata

Citation:. Das Gupta J, Luk KC, Tang N, Gaughan C, Klein EA , Kandel ES, et al. (2012) Ausência de XMRV e vírus estreitamente relacionados em primárias da próstata tecidos de câncer utilizado para derivar a linha celular XMRV-Infected 22Rv1. PLoS ONE 7 (5): e36072. doi: 10.1371 /journal.pone.0036072

editor: Gilda Tachedjian, Instituto Burnet, Austrália |

Recebidas: 1 de fevereiro de 2012; Aceito: 25 de março de 2012; Publicado em: 16 de maio de 2012 |

Direitos de autor: © 2012 Das Gupta et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Estas investigações foram realizadas com o apoio da Geyer Fundação Charlotte, o Maltz Family Foundation e Abbott Laboratories (a RHS e EAK), NCI CA137708 concessão (a ESK), e pela recolha de tecidos, Histologia e imunohistoquímica Núcleo Facilidade do processo Comprehensive Cancer Center (CA43703 P30). Os co-autores em Abbott estavam envolvidos no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar e preparação do manuscrito. As outras agências de financiamento não tinha tais papéis

Conflito de interesses:. KL, NT e JH são funcionários e acionistas da Abbott Laboratories. JDG, EAK, e RHS são inventores sobre patentes licenciadas para Abbott Laboratories que se relacionam com XMRV. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A leucemia murina relacionada com o vírus vírus xenotr�ico (XMRV) é um Gammaretrovirus descoberto durante estudos de pacientes com cancro da próstata com uma deficiência genética subtis no gene para a proteína antiviral de RNase L [1]. Embora vários estudos subsequentes forneceu evidências adicionais para qualquer XMRV ou um vírus estreitamente relacionados em pacientes com câncer de próstata [2] – [6], mais estudos falharam para detectar qualquer evidência de XMRV em pacientes com câncer de próstata ou se foi obtida evidência, mas foi limitada a uma pequeno número de amostras humanas [7] – [16]. Alguns dos resultados positivos no cancro da próstata, incluindo, mas não se limitando a, mapeamento local de integração e a detecção de produtos de PCR foram encontrados mais tarde para ser o resultado de contaminação laboratorial [17], [18]. As possíveis fontes de contaminação incluem DNA do rato abrigar pr�v�us MLV, plasmídeo ou PCR produtos XMRV ea própria XMRV de linhas de células infectadas. Por exemplo, o DNA do rato às vezes está presente em quantidades vestigiais em algumas polimerases Taq, PCR preparações master mix e kits de extração de DNA levando a falsos positivos em testes de PCR [19] – [22]. Os falsos negativos também podem ser produzidos em ensaios de PCR adicional de detecção de confusão XMRV ou vírus relacionados [23]. Um único estudo também mostrou a presença de XMRV em pacientes com síndrome da fadiga crônica [24], mas, recentemente, esses resultados foram em grande parte atribuída à contaminação de laboratório [25] – [27] eo relatório original retracte [28]. Com base em um estudo recente em larga escala de doadores de sangue em os EUA, é pouco provável que XMRV

per se

entrou nesta população humana de forma significativa (prevalência 0%; 95% intervalo de confiança de 0% -0,017 %) [29]. No entanto, alguns dos resultados positivos que envolvem métodos não-PCR com base, como sorologia, imuno-histoquímica e fluorescência

in situ

fluorescente (FISH), que aparentemente detectados XMRV ou vírus semelhantes em amostras humanas ainda têm de ser plenamente explaine [1], [3], [24]. deixa tal evidência em aberto a possibilidade de que seja DNA mouse ou um vírus XMRV-like está presente em pelo menos alguns seres humanos.

Neste contexto, a origem do XMRV foi recentemente elucidadas através do estudo da linha de células de cancro da próstata humana, 22Rv1, e os seus precursores de xenoenxerto cresceu em MIC nu [30]. As células são infectadas com 22Rv1, e produzir títulos elevados de, um XMRV que é quase idêntico na sequência de VP62 de estirpe XMRV Studie cancro da próstata [1], [30], [31]. A origem das células 22Rv1 pode ser rastreada até um carcinoma da próstata humana (Gleason grau de 9) que foi retirado em 1992 na Case Western Reserve Universit [32]. Subsequentemente, o tumor, apelidado CWR22, foi transplantado seriadamente em ratinhos nus. Em 1996, após quatro anos de passagem em série em ratinhos nus, a castração dos ratos foi realizada levando à regressão e recaída da tumo [33]. O tumor independente de androgénios resultante, CWR22R, foi, em seguida, transplantado seriadamente em ratinhos até 1999, quando foi usado para estabelecer a células lin 22Rv1 [34]. Altos níveis de XMRV estão presentes nas linhas celulares 22Rv1 e em passagens tardias do tumor CWR22, mas não em xenoenxerto de início [30], [35]. Notavelmente, os ratinhos hospedeiras contêm dois provírus, pré-XMRV1 e pré-XMRV2, com trechos longos ( 3,2 kb) que são 99,9% idênticos ao XMR [30]. Supõe-se que a recombinação entre os dois provírus levou a XMRV e que XMRV estava ausente do tumor original. No entanto, as amostras de tumores originais não foram avaliados nesses relatórios, enquanto xenoenxertos inevitavelmente contêm baixos níveis de células de camundongo. A presença do provírus endógenos de ratinho no DNA de células de ratinho tais contaminantes limita a escolha de sondas e iniciadores de PCR que podem ser utilizados para identificar elementos-XMRV como nas amostras. Aqui nós descrevemos a análise de blocos de próstata embebidos em parafina de CWR22 paciente e mostrar que nem XMRV nem vírus estreitamente relacionados estão presentes no tumor primário.

Materiais e Métodos

Processamento de blocos de tecido da próstata

Processamento de blocos fixados em formalina e embebidos em parafina (FFPE) foi realizado no Instituto Medicina Genômica e do Departamento de Medicina laboratorial, Cleveland Clinic. Cinco blocos de parafina do tecido da próstata de CWR22 paciente (marcados A, B, C, E, e K) foram seccionados a uma largura de 5 μ num micrótomo que tinha sido utilizado exclusivamente para amostras humanas. Secções foram coletados em tubos para extração de DNA ou colocadas em lâminas de microscópio para análise FISH. Os cortes foram armazenados em uma geladeira C 4 ° na biorrepositório Genomic Instituto de Medicina (Cleveland Clinic). extracção de ADN foi efectuada no mesmo laboratório, em que nem XMRV nem plasmídeo XMRV nunca foi usada. O tecido recolhido originalmente a partir do qual foi produzido o transplante CWR22 tecido foi descartado e foi necessária qualquer consentimento do paciente.

A extracção de ADN a partir de secções da próstata

extracção de ADN foi realizada pelo seguinte método (fornecida pela Dr. Charis Eng, Genomic Medicine Institute, Cleveland Clinic: https://www.lerner.ccf.org/gmi/gmb/methods.php). A desparafinação foi feito através da adição de 1 ml de xileno a 18 secções (5 μ largura de cada), agitando suavemente durante 10 min, centrifugação durante 10 min a 16000 g à temperatura ambiente e descartando os sobrenadantes. Este passo foi repetido duas vezes. A extracção foi então realizada com 1 mL de cada vez de etanol a 100% (2 vezes), 80% de etanol (2 vezes) e 50% de etanol (2 vezes), cada vez que a centrifugação durante 10 minutos a 16,000 g à temperatura ambiente e descartando os sobrenadantes . Para o sedimento foi adicionado 1 ml de água isenta de nuclease (/Affymetrix USB) e incubou-se a 4 ° C durante a noite. O sedimento foi recolhido após centrifugação durante 10 min a 16000 g à temperatura ambiente após o descarte do sobrenadante. Ácido Nucleico de tampão de lise, 700 ul, (10 mM de Tris base, 400 mM de NaCl, 2 mM de Na

2EDTA e 0,7% de SDS), foi adicionado ao sedimento. Proteinase K, 50 ul (30 mg /mL) (Invitrogen) foi adicionado e a digestão foi realizada a 65 ° C durante 24 horas. Um adicional de 50 ul de solução de proteinase K foi adicionada, incubadas durante a noite a 65 ° C, adicionou-se 250 ul de NaCl a 6 M, misturado completamente, e deixada à temperatura ambiente durante 10 min. As amostras foram centrifugadas durante 10 min a 16000 g à temperatura ambiente para sedimentar o ADN e os sobrenadantes foram descartados com cuidado. Os sedimentos foram lavados com etanol a 70% e seco ao ar na bancada durante alguns min. Cada um dos sedimentos foi ressuspenso em 40 ul de TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 1 mM) (USB /Affymetrix) e armazenadas a 4 ° C

polimorfismo de um único nucleótido (SNP) genotipagem (Roswell Park Câncer. Institute)

SNP genotipagem foi realizada utilizando o sistema Compact MassARRAY (Sequenom, Inc., San Diego, CA) em um painel de 30 ensaios SNP projetados usando RealSNP e MassARRAY Ensaio Designer (Sequenom). Em resumo, o protocolo envolve a amplificação por PCR de 10 ng de ADN utilizando iniciadores específicos de SNP, seguido por uma reacção de extensão de base utilizando a química Iplex ouro (Sequenom). Os produtos finais de extensão de base foram tratados e manchado em um SpectroCHIP 384-pad (Sequenom) usando um nanodispenser ChipSpotter LT (Samsung). Um analisador MassARRAY compacto de MALDI-TOF MS (Sequenom) foi usado para a aquisição de dados a partir do SpectroCHIP. Os genótipos resultantes foram chamados usando MassARRAY Tipos Analyzer v4.0 (Sequenom).

PCR quantitativo (qPCR) para o XMRV (Cleveland Clinic)

amostras de DNA foram diluídos para 100 ng /mL em TE de tampão e 2 ul (200 ng) foram usadas alíquotas em duplicado para os ensaios de qPCR (excepto para a amostra K, 17 ng de DNA foi utilizado devido a uma menor quantidade de ADN disponível). Mastermix rápida (Applied Biosystems) foi utilizado para os ensaios de qPCR em tempo real usando uma máquina de PCR Passo Um Além disso, seguindo as instruções do fabricante (Applied Biosystems). As condições de PCR utilizando PCR para rápida Mastermix foram: 95 ° C durante 20 segundos para desnaturação inicial seguido por 95 ° C durante 1 seg, 60 ° C durante 20 segundos (passo de recolha de dados), repetido 50 vezes para. As sondas de oligonucleotídeos continha 6-carboxifluoresceína (FAM), ligado à extremidade 5 ‘e não fluorescentes Quencher-Minor Grove Binder (QNQ-MBG), ligado à extremidade 3’ (Applied Biosystems].

env

gene:

6124F: 5′-GGCCGAGAGAGGGCTACT-3 ‘

6159R: 5′-FAM-CACATCCCCATTTGCC-QNQ-MGB-3′

6197R: 5 ‘ -TGATGATGATGGCTTCCAGTATGC-3 ‘

gag

gene:

625F: 5′-GTAACTACCCCTCTGAGTCTAACCT-3′

668F

: 5′-FAM-TCCAGCGCATTGCATC- QNQ-MGB-3 ‘

708R: 5′-CTTCTTGACATCCACAGACTGGTT-3′

pol

gene:

4843F: 5′-CGGGACAGAACTATCCAGTATGTGA-3 ‘

4873F: 5′-FAM-ACCTGCACCGCCTGTG- QNQ-MGB-3′

4912R: 5′-TGGCTTTGCTGGCATTTACTTG -3 ‘

Como um controle interno, medimos foi usado níveis do gene de RNase P (um gene de cópia única) que codifica a fracção de ARN para a enzima RNase P. controle RNase P combinação iniciador-sonda VIC-rotulados da Applied Biosystems. um número de cópias conhecido do comprimento total XMRV VP62 genoma no plasmídeo pcDNA 3.1 [36] foi usado como um controle positivo para testar cada combinação de iniciador-sonda.

a intracisternal partículas (IAP) ensaios qPCR (Cleveland Clinic)

qPCR para mouse IAP de ADN foi realizada com os seguintes iniciadores oligonucleotídicos /sonda:

IAP-1414F: 5′- TGGCGAAAGTCAGCGTACTG-3 ‘

IAP-1435F: 5′-FAM-TCAACCTCCCGGCAGT-QNQ-MGB-3 ‘

IAP-1472R: 5′-CATAGGGCGGACCTTGAAAC-3′

Como um controlo positivo para o IAP, ADN da cauda do rato foi extraído utilizando o estojo de extracção de ADN Qiagen, a sua concentração medida por absorvância e diluídas em série em tampão TE para gerar a curva padrão. As condições de PCR foram as mesmas que as utilizadas para detectar sequências XMRV.

em tempo real ensaios RT-PCR para XMRV (Abbott Molecular)

Individual rodada em tempo real RT-PCR ( RT-PCR) ensaios de protótipos foram executados no

m

2000

rt

TM (Abbott Molecular Inc., Des Plaines, IL) instrumento. Uma média de 500 ng de ADN de cancro da próstata CWR22 paciente (os blocos A, B, C, E e K) foi amplificado com os dois conjuntos de iniciadores concebidos para dirigir individualmente a polimerase (

pol

) ou envelope (

env

) regiões do genoma XMRV. Cada amostra de ADN diluído em água para obter um volume de 25 ul foi combinado com 25 ul de mistura principal que continham 10x tampão EZ, enzima Tthr, dNTPs, corante de referência ROX, MnCl

2, os iniciadores e sondas, para se obter uma última volume de reacção de PCR de 50 uL. sequências /sonda primer, as condições dos ciclos e a estimativa de sensibilidade /especificidade de

pol

e

env

ensaios de RT-PCR foram descritos em detalhe previousl [37]. Um conjunto iniciador /sonda para a detecção das 136 bases do humano

-globina β

gene foi usado para controlar a adequação do espécime e foi amplificada e detectada simultaneamente com XMRV (sinal FAM) na mesma reacção com um corante fluorescente diferente (sinal de Cy5). tampão TE contendo 1,5 ug /mL de poli dA: dT foi utilizada como controlo negativo ensaio (NC). plasmídeo XMRV VP62 DNA diluído na NC foi usado como controle positivo ensaio (PC).

fluorescência

in situ

fluorescente (FISH) (Abbott Diagnostics)

O XMRV- SO sonda FISH foi preparado por marcação directa todo o DNA de plasmídeo (~13.6 kb) de clone VP62 /pcDNA3.1 transportando um genoma completo (~8.2 kb) de XMRV VP62 (36) com SpectrumOrange fluoróforo através de reações químicas como previousl descrita [38], [39]. A percentagem de incorporação de SpectrumOrange na sonda XMRV-SO foi ~ 8%. CEP8-SA sonda derivada da sequência centromérica do cromossoma 8 humano e directamente marcado com fluoróforo SpectrumAqua foi obtido a partir de Abbott Molecular, Inc.

Para a avaliação de desempenho da sonda XMRV FISH, células de cancro da próstata DU145 não infectado XMRV [36] foram usadas como um controlo negativo, enquanto 22Rv1 células de cancro da próstata abrigando -10 cópias integradas de XMRV por célula e de geração de título elevado de vírus XMRV [31] foram utilizados como um controlo positivo. Ambas as linhas celulares foram cultivadas em DMEM-F12 meio completo (Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37 ° C na presença de 5% de CO

2. Depois de atingir 60% -70% de confluência, 1 ml de solução colcemida (10 ug /ml; Invitrogen) foi adicionado por meio de cultura de 50 ml e as células foram cultivadas a 37 ° C durante 2 h. As células foram colhidas após tripsinização, lavadas uma vez com 40 ml de DPBS 1x (Invitrogen), ressuspensas em 40 ml de solução de cloreto de potássio 0,075 M (Invitrogen), e incubou-se a 37 ° C durante 30 min. As células foram subsequentemente lavadas com 40 ml de fixador de Carnoy (03:01 v /v de metanol: ácido acético glacial; Fisher, Pittsburgh, PA), quatro vezes, ressuspenderam-se em 5 ml de fixador de Carnoy e armazenados a -20 ° C. As lâminas com uma mistura de DU145 e 22Rv1 foram preparadas por deposição de 10 ul de cada suspensão de células num SuperFrost Além disso corrediça carregado positivamente (ThermoShandon, Pittsburgh, PA). A lâmina foi pré-tratamento durante a noite antes da hibridização FISH e

lâminas celular espécimes foram pré-tratadas em 2x SSC seco ao ar (0,3 M de NaCl, 0,03 M citrato de sódio, pH 7,0; Invitrogen). A 73 ° C durante 2 min em seguida, incubadas em 0,5 mg /mL de pepsina em HCl 10 mM (USB, Cleveland, OH) a 37 ° C durante 10 min. As lâminas foram lavadas em DPBS 1x (Invitrogen) durante 5 minutos a temperatura ambiente, fixadas em solução de formalina neutra tamponada a 1% (Fisher), durante 5 min, em seguida, imersas em 1X DPBS durante 5 min. Os slides foram desidratados numa série de etanol de 70%, 85%, e 100% durante 1 min cada, e depois seco ao ar. Dez ul de solução de hibridação foi preparado por mistura de 100 ng XMRV-SO, 100 ng CEP8-SA, 1000 ng sonicada ADN de placenta humana, 250 ng de ADN Cot-1 humano, e 7 ul LSI /WCP tampão de hibridação (Abbott Molecular, Inc. ), e foi aplicado a cada lâmina. A lamela (22 × 22 mm; VWR, Radnor, PA) foi colocado sobre a solução de sonda, e selado para o slide com cimento de borracha (Staples, Framingham, MA). As sondas e os ácidos nucleicos de células em cada lâmina foram co-desnaturada a 73 ° C durante 3 minutos e depois hibridizou a 37 ° C durante 16-24 horas numa plataforma de hibridação (ThermoBrite; Abbott Molecular, Inc.). Após a hibridação, as lâminas foram lavadas em 0,4x SSC /0,3% de NP-40 (Abbott Molecular, Inc.) durante 2 min a 73 ° C e, em seguida, em 2x SSC /0,1% de NP-40 (Abbott Molecular, Inc.) durante 1 min à temperatura ambiente. Dez ul de contraste nuclear DAPI II (125 ng /ml; Abbott Molecular, Inc.) foi aplicada a cada amostra, e as lâminas foram avaliadas sob um microscópio de fluorescência. sonda XMRV-SO foi visualizado com um conjunto de filtros laranja, CEP8-SA sonda foi visualizado com um conjunto de filtros aqua, e coloração nuclear DAPI foi visualizado com um conjunto de filtros DAPI.

Slides montado com secções de tecido de cancro da próstata FFPE foram cozidas a 56 ° C durante 4 horas, em seguida, armazenados à temperatura ambiente. Na preparação para hibridação FISH, espécime de tecido lâminas foram desparafinadas três vezes em Hemo-De solvente (Scientific Segurança Solventes, Keller, TX) durante 5 minutos cada à temperatura ambiente e lavadas duas vezes em etanol absoluto durante 1 min cada. As lâminas foram subsequentemente pré-tratado numa solução de ácido fórmico a 45% (Fisher) /0.3% peróxido de hidrogénio (Calbiochem, San Diego, CA) durante 15 min à temperatura ambiente e lavadas em H

2O durante 3 min. As lâminas foram então incubadas numa solução de pré-tratamento (Abbott Molecular, Inc.) a 80 ° C durante 35 min, lavou-se em H

2O à temperatura ambiente durante 3 min, incubadas numa solução de pepsina (1,5 mg /ml em HCI 0,1 N ) a 37 ° C durante 22 min, lavadas em H

2O à temperatura ambiente durante 3 min. As lâminas foram subsequentemente desidratadas em 70%, 85%, e etanol a 100% durante 1 min cada, e deixou-se secar à temperatura ambiente. Dez ul de mistura de hibridação sonda contendo 100 ng XMRV-SO, 100 ng CEP8-SA, 1000 ng sonicado DNA de placenta humana, 250 ng de ADN Cot-1 humano, e 7 ul tampão de hibridação LSI /WCP foi colocada sobre cada secção de tecido. A lamela foi aplicada e as bordas foram selados para o slide com cimento de borracha. As sondas e os ácidos nucleicos da amostra de tecido em cada lâmina foram co-desnaturada durante 5 minutos a 73 ° C e hibridados durante 16-24 horas a 37 ° C num ThermoBrite. Após a hibridação, as lâminas foram colocadas em 2x SSC /0,1% de NP-40 à temperatura ambiente durante 5-10 min, lavadas em 0,4 x SSC /0,3% de NP-40 a 73 ° C durante 2 min e em 2 x SSC /0,1% NP-40 à temperatura ambiente durante 1 min. Dez ul de counterstain DAPI nuclear I (1.000 ng /ml; Abbott Molecular, Inc.) foi aplicado a cada secção de tecido, e as lâminas foram avaliadas sob um microscópio de fluorescência

Declaração de ética

Estas. estudos foram aprovados pela Cleveland Clinic Foundation Institutional Review Board # 1.

resultados

Identificação e verificação de CWR22 tecidos da próstata

em 1992, o câncer de próstata CWR22 paciente foi submetido à ressecção transuretral da próstata na Case Western Reserve Universit [32]. Após a cirurgia, os chips de tecido da próstata foram fixados em formalina a 10% tamponada neutra e embebidos em blocos de parafina. Na sequência de estudos de diagnóstico e emissão de relatório de patologia padrão, os blocos foram mantidos em armazenamento pelo Departamento de Patologia (Case Western Reserve University) à temperatura ambiente constante, principalmente em salas sem iluminação. Em meados de 2011, os blocos de tecido foram identificados que os registos em papel arquivados como tendo originado de CWR22 paciente e, em seguida, foram recuperados do armazenamento. O Hospitais Universitários (Cleveland) Institutional Review Board permite a manutenção de pacientes e amostras registros para estudos futuros; com uma capacidade de re-ligação, mantendo um firewall para impedir a liberação de qualquer informação de saúde pública para os investigadores.

Os blocos de próstata foram seccionados em micrótomo utilizado exclusivamente para tecidos humanos do Departamento de Medicina Laboratorial (Cleveland Clinic ). O DNA foi extraído no Instituto Medicina Genômica (Cleveland Clinic) em um laboratório onde foram utilizados nem XMRV nem ácidos nucleicos XMRV. Para confirmar a origem comum das amostras, as amostras de DNA a partir de cinco blocos próstata FFPE de CWR22 paciente (marcado como A, B, C, E K) foram comparados entre si, bem como para o anteriormente descrito [35] amostras de um xenoenxerto CWR e linha de células 22Rv1 por análise de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) em Roswell Park Cancer Institute (Buffalo). Nós baseou-se num método de detecção de SNPs utilizando o sistema totalmente automatizado de Sequenom, Inc. (San Diego, CA). O sistema baseia-se na amplificação por PCR da região de interesse, seguida de extensão do iniciador através do sítio polimórfico na presença de três desoxirribonucleótido-trifosfatos e uma trifosfato dideoxyribonucleotide, e determinação da composição de nucleótidos dos produtos de extensão curta usando espectrometria de massa [ ,,,0],40]. Observou-se que todas as sete amostras realizado um padrão idêntico de SNPs em todos os trinta dos locais examinados (Tabela 1), confirmando assim que os blocos de tecido de próstata originado com o mesmo paciente assim como as células de xenoenxerto e CWR 22Rv1.

Ausência de ADN que XMRV ou de um vírus estreitamente relacionados em CWR22 paciente

Para determinar se os ácidos nucleicos a partir de XMRV ou um vírus intimamente relacionados estava presente na próstata de CWR22 paciente, a PCR foi realizada de forma independente no Departamento de Biologia do Câncer, Cleveland Clinic (Cleveland) e pelo Abbott Molecular, Inc. (Des Plaines).

qPCR em Cleveland Clinic.

para determinar as sensibilidades de qPCR para XMRV

gag

,

pol

, e

env

, os ensaios foram feitos com o clone molecular viral de corpo inteiro, o plasmídeo XMRV VP62 [36]. Apenas 15 cópias de plasmídeo XMRV foram reproducibly detectada com iniciadores e sondas para os três genes XMRV (

gag

,

pol

, e

env

) (Fig. 1A ). Porque a sequência de nucleotídeos de XMRV é até 95% idêntico a vários MLV proviruse endógena [1], procurou-se determinar se qPCR para XMRV

gag

,

pol

, e

env

também amplificar sequências de MLV de DNA mouse. QPCR com XMRV

gag e

env

primers que amplificam produtos a partir de tão pouco quanto 100 fg de DNA da cauda do rato, enquanto que o XMRV

pol

primers não produzem produtos de PCR de rato do ADN (Fig. 1B C e dados não mostrados). Estes resultados sugerem que MLV provírus endógenos podem ser detectadas por qPCR quer com o XMRV

da mordaça ou

env

iniciadores, mas não com os

pol

primers. Para monitorar a contaminação do DNA do rato, qPCR foi realizado para IAPs rato (elementos móveis do tipo retrovírus endógenos [41] que são facilmente detectáveis ​​pelo PC [18]). Notavelmente, tão pouco como 1 fg de ADN da cauda de rato foi detectada por qPCR de ADN de IAP (Fig. 1D). Estes resultados são consistentes com a presença de cerca de 50 MLV provírus [42] e 1000 cópias de ADN de IAP por ratinho genom haplóide [41].

(A) por nove diluições diferentes de plasmídeo XMRV VP62 (15 a 15 × 10

9 cópias de cada reacção em duplicado) foram usadas para gerar a curva padrão, utilizando

gag

,

pol

e

env

combinações de sonda de primers. (B-D) A diluição em série de ADN da cauda do rato (1 fg para 100 ng de cada reacção em duplicado) foram usadas para gerar os dados para (B)

gag

, (C)

env

e (D) IAP. e, expoente (10 elevado à potência de

n

).

Para demonstrar unidades de fluorescência representativos em função do número de ciclos, XMRV VP62 plasmídeo foi submetido a qPCR para XMRV

gag

,

pol

, e

env

em comparação a controlar as reações falta DNA adicionado (Fig. 2A). QPCR ensaio foram realizadas utilizando o DNA a partir dos diferentes blocos de tecido de próstata de CWR22 paciente. No entanto, nenhum ADN XMRV foi detectada em ensaios em duplicado para todos os três genes XMRV com ADN CWR22 da próstata a partir de blocos A, B, C, E e K (Fig. 2B e Tabela 2). Um dos 2 ensaios para XMRV

env

no bloco C só produziu uma resposta fraca em 40 ciclos, o que está abaixo do limite de confiança de detecção e provavelmente representa um artefato. Nenhum rato do ADN de IAP foi detectada por PCR do ADN extraído a partir dos tecidos CWR22 da próstata, indicando uma ausência de contaminantes de ADN de rato nestas amostras (Tabela 2).

trama de amplificação em tempo real para análise qPCR (a) a detecção de regiões específicas XMRV (

gag

,

pol

e

env

) usando XMRV VP62 plasmídeo de DNA (3.750 cópias) e (B) em DNA extraído de diferentes seções de tecidos CWR22 próstata (blocos de tecido a, B, C e, cada uma testada em duplicata). Para bloco C somente, 1 de 2 ensaio para

env

foi fracamente positivo, todos os outros ensaios para

gag

,

pol

e

env

foram negativos .

RNase P

sondas foram usadas para detectar a presença de DNA genômico em tecidos tumorais.

em tempo real RT-PCR em Abbott Molecular.

Para interrogar mais as amostras de tecido da próstata para evidência de infecção XMRV, dois rodada única em tempo real adicional ensaios de RT-PCR para XMRV

pol

e

env

foram utilizados. A sensibilidade e a especificidade dos dois ensaios para a detecção de XMRV ter sido previamente demonstrado; estes foram baseadas na comparação de vários ensaios com os painéis de controlo codificados criadas pelo XMRV Investigação Científica do grupo sanguíneo de Trabalho (BSRWG) [37], [43]. Usando painéis de sangue total e plasma preparados pelo BSRWG, estes ensaios foram iguais aos ensaios teste mais sensível [43]. Usando as diluições em série de controlos de plasmídeo XMRV VP62, ambos os ensaios de poder detectar com precisão 5 cópias de ADN por reacção. Com base nesta sensibilidade do ensaio, estima-se um limite inferior de detecção de cerca de um genoma proviral por 17.000 células. As reacções de controlo positivo foram controlos positivos e negativos foram negativos (Fig. 3A). Sem XMRV foi detectado tanto pelo

pol

ou

env

ensaios in DNA extraídos de blocos de próstata CWR22 A, B, C, E e K (Fig 3A;. Tabela 2). parcelas de amplificação de sinal de

β-

globina (Cy5) amplificado durante o mesmo prazo (Fig. 1B, Tabela 2) revelou que todas as amostras de pacientes foram positivas para

β

globina DNA, indicando que há foi suficiente ADN presente nas amostras para a amplificação.

parcelas de amplificação a partir da análise em tempo real de PCR de sinal (a) XMRV (FAM) em ADN extraído de diferentes secções de tecidos da próstata CWR22 e executar os controlos com o

pol

e

env

primer /conjuntos de sondas; (B)

β-

globina sinal (Cy5) durante o mesmo prazo.

análise XMRV FISH de cortes de tecido CWR22

Uma abordagem alternativa para a identificação molecular de infecção viral é FISH. secções de tecido FFPE a partir de cada um dos blocos CWR22 próstata A, B, C, E e K foram rastreados quanto à evidência de infecção XMRV directamente utilizando uma sonda marcada (XMRV-SO). A mistura de sonda também continha uma segunda sonda, CEP8-SA, que hibrida com a região do cromossoma humano centromérica 8 que serviu como um controlo interno para monitorizar a integridade do passo de hibridização FISH. As lâminas, contendo uma mistura de células cancerosas da próstata DU145 não infectadas e células de cancro da próstata 22Rv1 infectadas com XMRV (≥10 cópias integradas /célula) foram utilizados para estabelecer a especificidade e a localização de hibridização FISH. Os resultados desta análise estão apresentados (Fig 4A . B). O marcador cromossómico CEP8-SA prontamente distinguidas as duas linhas celulares como três cópias estavam presentes em DU145 22Rv1 Considerando que continha duas cópias. hibridação XMRV FISH foi observado somente para as células 22Rv1. XMRV-coloração em células 22Rv1 foi localizada principalmente para o núcleo, enquanto alguma coloração foi encontrada no citoplasma. O pré-tratamento das células com ARNase A a digerir tanto ARN virais e celulares antes da hibridação da sonda XMRV-SO resultou num padrão de coloração pontuar, indicativo de ADN proviral integrado XMRV, localizada para o núcleo (dados não mostrados). Imagens representativas da análise FISH XMRV em secções de tecido CWR22 de blocos A, B, C, E e K são mostrados (Fig. 4C-L, respectivamente). As secções de tecido a partir de blocos B, C e E foram negativos para coloração com a sonda XMRV-Assim, embora eles foram positivos para o controlo interno CEP8 SA-sonda (Fig. 4 e dados não mostrados). Secções de blocos A e K foram negativas para o manchamento XMRV com a excepção de algumas células ao longo de um bordo de cada lâmina. Para examinar a especificidade da coloração, um vírus de papiloma humano tipo de sonda 16 uma sonda marcada da mesma maneira como a sonda foi hibridada com XMRV secções de blocos A e K. À semelhança do que foi observado com a sonda XMRV-SO, as secções foram negativos com a excepção de células ao longo da mesma borda das lâminas (dados não mostrados). Assim, a coloração observada ao longo da borda de estas lâminas parece ser um artefacto não específica. Com base nesta análise, concluímos que as secções de todos os blocos de tecido CWR22 são negativos para XMRV e vírus relacionados.

Cada lâmina foi hibridada com uma mistura de sondas consistindo de sonda XMRV-SO viral derivado de uma completa -length XMRV VP62 e CEP8-SA sonda de controlo interno a partir da sequência centromérica do cromossomo humano 8. (a) imagem representativa mostrando coloração XMRV-SO laranja em uma mistura de células cancerosas da próstata DU145 não infectado e 22Rv1 infectadas pelo XMRV; (B) a mesma imagem que mostra a coloração do aqua CEP8-SA em DU145 (três cópias /célula) e 22Rv1 (duas cópias /célula); . (C – G) imagens representativas mostrando resultados pescar em secções de tecido a partir de blocos A, B, C, E e K, respectivamente, de CWR22 SO XMRV-

Discussão

Um estudo anterior sugeriu que XMRV foi gerado por recombinação entre dois provírus endógenos de ratos, pré-XMRV1 e pré-XMRV2, durante a passagem das células de tumor CWR22 em MIC nu [30]. Enquanto XMRV originado em ratos, que é altamente adaptado para as células epiteliais da próstata humana, como resultado de interacções celulares vírus-hospedeiro in vivo. Por exemplo, XMRV traficadas para epitélio prostático dentro de 6 ou 7 dias de infecção experimental de macaco rhesus [44], embora não em macacos pigtailed em 119 dias pós-infectio [45]. As infecções iniciais na linhagem celular CWR22 que conduziram à linhagem celular 22Rv1 foram provavelmente facilitada por deficiências da imunidade inata.