Sumário

A maioria das células de cancro do pâncreas humanos são resistentes ao factor de necrose tumoral (TNF) -relacionados-ligando indutor de apoptose (TRAIL) mediada por apoptose. No entanto, os mecanismos pelos quais as células cancerígenas pancreáticas utilizam suas moléculas extracelulares para neutralizar a sinalização pró-apoptótica mediada pela família TNF são em grande parte desconhecida. Neste estudo, demonstramos pela primeira vez que o DcR3, um receptor chamariz secretado que as células cancerosas malignas do pâncreas expresso a um nível elevado, actua como uma molécula de anti-apoptótico extracelular por ligação a TRAIL e neutralizar a sua função de promoção da morte. A redução do DcR3 com siRNA TRAIL desmascarado e apoptose induzida por TRAIL bastante reforçada. Gemcitabina, uma droga de primeira linha para câncer de pâncreas, também reduziu o nível de DcR3. A adição de DcR3 siARN reforçada apoptose induzida por gemcitabina. Notavelmente, a

In vivo

estudo demonstrou que o efeito terapêutico de gemcitabina pode ser aumentada por meio de nova redução de DcR3, o que sugere que a regulação negativa de DcR3 em células tumorais poderia inclinar o balanço no sentido de células pancreáticas apoptose e, potencialmente, servir como um nova estratégia para o tratamento do câncer de pâncreas

Citation:. Wang W, Zhang M, Sun W, Yang S, Su Y, Zhang H, et al. (2013) Redução da apoptose Decoy Receptor 3 Melhora TRAIL-Mediated no cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (10): e74272. doi: 10.1371 /journal.pone.0074272

editor: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de março de 2013; Aceito: 29 de julho de 2013; Publicação: 25 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado em parte pelo Fundo Nacional de Ciência Natural da China concede (81071968) para WW e do Programa chave de Pesquisa científica de Fujian Medical University (09ZD014) para WW. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores têm as seguintes participações: co-autor Sunghee Kim é empregados por BioPowerTech. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O equilíbrio entre fatores pró-apoptóticos e anti-apoptóticos é um determinante importante no destino das células tumorais . Estas células conseguem fazer pender a balança para a sobrevivência pela superexpressão de moléculas anti-apoptóticos em sítios intracelulares e intercelulares. Um corpo de estudos demonstrou que o linfoma de células B intracelular 2 (BCL-2) promove a malignidade em vários tipos de tumores, ao passo que a sua função de bloqueio aumenta o efeito de tratamentos anticancerígenos [1], [2], [3]. Bcl-2 estabiliza a membrana mitocondrial e impede a libertação do citocromo c das mitocôndrias e a formação de Apoptossomas no citoplasma [4], [5], reduzindo assim a apoptose de células de tumor e aumentar a capacidade dos tumores a crescer e metastizar.

no entanto, a maioria de sinalização apoptótica é activado extracelularmente através da ligação de ligandos proapoptóticos de uma célula para receptores de morte na superfície de outra célula [6], [7]. Por exemplo, os ligandos do factor de necrose tumoral (TNF) se ligam família aos seus receptores (por exemplo, TNF a TNFR, FasL ao Fas, luz para HVEM /TR2) e depois provocar a sinalização apoptótica em resposta a eventos desfavoráveis ​​[8], [ ,,,0],9]. O mecanismo pelo qual as células extracelular proteger-se antes de ligandos de morte se ligarem aos seus receptores tem atraído muita atenção [10], [11]. Embora a descoberta de receptores de engodo (por exemplo, DcR1, DcR2 e DcR3) tem lançar alguma luz sobre este fenómeno [8], [12], é necessária uma compreensão mais detalhada destes mecanismos.

As células tumorais utilizam 2 camadas de protecção: (1) um sistema de defesa activa na qual chamariz bloquear receptores do ligando de morte antes de atingirem os receptores da família TNF na superfície celular e prevenir a iniciação da morte de sinalização; e (2) um sistema de defesa passiva em que máquinas antiapoptótica desempenha um papel uma vez que o sinal de morte é accionado no interior das células. Desde porções das moléculas de receptores de morte celular tipo I (por exemplo, DcR3, DR3, DR5, TNFR1, OPG, e OX40) e ligantes de morte (por exemplo, FasL, luz, TL1A, TRAIL, e LTA) compartilhar domínios funcionalmente semelhantes, especialmente entre os 6 membros da família do TNFR [13], foram utilizados vários métodos para explorar a interacção de ligação e de DcR3 com ligando indutor de apoptose relacionado com TNF (TRAIL). Os nossos resultados mostraram que o DcR3 não se liga apenas a FasL, TL1A (VEGI), e Luz [14], [15], [16], [17], mas também para TRAIL, tal como evidenciado pelos resultados de vários ensaios, incluindo a ligação de Biacore, citometria de fluxo, imunoprecipitação, transferência Western e ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). as células cancerosas malignas do pâncreas expressam um alto nível de DcR3, que pode ser regulada negativamente por DCR3 siRNA ou drogas de quimioterapia, tais como gemcitabina. A combinação de DcR3 siRNA com TRAIL ou gemcitabina aumenta muito o processo de apoptose

in vitro

e retarda o crescimento do tumor

in vivo

, sugerindo que a regulação negativa da extracelular DcR3 antiapoptótico pode melhorar terapia antineoplásica. Isto é especialmente verdadeiro para o câncer pancreático agressivo, que utiliza DcR3 como os meios para a sua progressão.

Materiais e Métodos

linhas de células e reagentes

Duas linhas celulares de cancro pancreático humano , AsPC-1 e MiaPaCa-2, e uma linha de células de carcinoma do cólon, SW480, foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). As células foram mantidas como culturas em monocamada em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino, 100 ug /ml de estreptomicina e 100 U /ml de penicilina a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 atmosfera. reagentes relacionados com o DcR3 foram fornecidos pela BioPowerTech (Tuscaloosa, AL). Gemcitabina foi comprado na farmácia da Universidade de Rochester Medical Center (Rochester, NY). O siRNA para DcR3 foi sintetizado em tecnologias de DNA integrados, Inc. (Coralville, IA). FasL recombinante e TRAIL e seus anticorpos foram adquiridos de R D Systems (Minneapolis, MN) e BioLegend, Inc. (San Diego, CA). Esferas de proteína A-Sepharose foram adquiridos a Pharmacia (Uppsala, Suécia). poli anti-clivada (ADP-ribose) polimerase (PARP) anticorpos policlonais foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology, Inc. (Beverly, MA) e anti-gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) anticorpo policlonal foi adquirido de Santa Cruz, Inc. (Santa Cruz, CA).

Biacore ensaio

a ligação de TRAIL humano recombinante de DcR3 humano foi analisada num instrumento Biacore 3000 (Biacore Inc., Piscataway, New Jersey). DcR3 foi conjugado covalentemente com células de fluxo do sensor de chip CM5 Biacore () através de grupos amina utilizando N-etil-N ‘- (dimetilaminopropil) carbodiimida /N-hidroxissuccinimida. Várias diluições de TRAIL (1-2048 nM) foram passados ​​através da célula de fluxo e a superfície em branco conjugado a 20 ul /minuto, para um volume total de 70 ul. A quantidade de proteína ligada foi determinada durante a lavagem da célula de fluxo com tampão HBS-EP (HEPES 10 mM [pH 7,4], NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, 0,005% Surfactante P20). Para regenerar a superfície da célula de fluxo, as proteínas ligadas foram lavadas com 20 mM de NaOH. Leve humana recombinante diluída em tampão HBS-EP (1-512 nM) foi utilizado como um controlo positivo. A associação, dissociação e constantes de equilíbrio foram determinadas com um programa de cinética avaliação no Suporte lógico BIA Evaluation (Biacore, Inc.), utilizando um modelo de ligação de 1:01 e o método de análise global.

análise de ligação de superfície celular

AsPC-1 e MiaPaCa-2 foram incubadas com ou sem o DcR3 recombinante (5 ng /ml), TRAIL (5 ug /ml), ou anticorpo monoclonal anti-TRAIL murino (1 ug /ml) em os mesmos ou diferentes tubos durante 1 hora a 4 ° C, seguido de anticorpo monoclonal biotinilado de DcR3 (0,5 ug /ml), e, em seguida, o isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated anticorpo secundário estreptavidina durante 1 hora a 4 ° C. Após a lavagem, o DcR3 ligado na superfície celular foi detectado com FACStarPlus (BD Inc., Franklin Lakes, NJ). Os dados foram expressos como a percentagem de células marcadas positivamente.

Imunoprecipitação e Western blot

A associação física do DcR3 com TRAIL foi examinado com imunoprecipitação (IP) e Western blot em 3 diferentes configurações. Para analisar a interacção entre proteínas de recombinação 2 puros, mistura de 100 ul de DcR3 com TRAIL (1 ug /ml) foi precipitado com anticorpos anti-DcR3 ou anti-TRAIL (3-5 ug) com 20 ul de pérolas de proteína A suspensão. Após a lavagem, o complexo ligado de DcR3-Trail nas esferas foi eluída com 30 jil de tampão de amostra Laemmli não desnaturado 1X, a electroforese em electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio poliacrilamida a 12% (SDS-PAGE), transferidos para uma membrana de nitrocelulose, detectado com anti-TRAIL biotinilado ou anti-DcR3 (1-2 ug /ml) seguido de estreptavidina (SA) -HRP, e visualizada com um substrato quimioluminescente sensível (Pierce, Rockford, IL). Para detectar solúvel complexo de DcR3-TRAIL no meio de cultura celular e o complexo ligado à membrana, em ligado de células, as amostras com o cocktail inibidor de protease (50 ug /ml de PMSF, 1 ug /ml de aprotinina, leupetin, e pepstatina) foram limpas com proteínas grânulos e depois incubadas com anticorpos anti-DcR3 ou anti-TRAIL a 4 ° C durante a noite enquanto era suavemente agitada. O complexo de DcR3-LIART ligado sobre as pérolas foi sujeita a transferência de Western de um modo semelhante ao descrito acima.

-ELISA como ensaio de ligação

A ligação do DcR3 com TRAIL foi examinada com um ELISA modificado. Os poços foram revestidos com FasL ou TRAIL recombinante (100 ul de 1 jag /ml). Depois as placas foram lavadas com tampão de lavagem (0,01% de Tween 20 em PBS) e bloqueou-se com PBS-T (5% de Tween 20 em PBS), a 100 ul de DcR3 recombinante (1 ng /ml) com ou sem TRAIL recombinante ou 5% FasL (10-20 ug /ml, para a competição) foi adicionado a cada poço e incubou-se a 4 ° C durante a noite. Após a lavagem, o anticorpo biotinilado-DcR3 (0,2 ng /ml) foi adicionado a cada poço e incubou-se a 37 ° C durante 1 hora; Depois disso, adicionaram-se 100 ul de estreptavidina-1:4000 peroxidase de rábano (SA-HRP) e incubada nos poços durante 45 minutos a 37 ° C, lavou-se, visualizada com 3, 3 ‘, 5, 5’ tetrametilbenzidina (TMB), e lida a um comprimento de onda de 450 nm. Em sentido inverso, as placas foram revestidas com o DcR3 (100 ul de 2 ug /ml) e, em seguida, incubadas com FasL ou TRAIL recombinante (100 ul de 1 jag /ml) com ou sem o DcR3 (20-50 ug /ml, para competição) , seguido por biotinilado anti-FasL ou anti-TRAIL (0,5 ug /ml), SA-HRP, TMB e ler a um

450.

ELISA para DcR3

DcR3 foi quantitativamente medida, conforme descrito anteriormente 17]. Uma vez que o DcR3 é uma proteína segregada, foi usado 100 ul de meio de cultura. Resumidamente, incubou-se durante a noite com uma placa de ELISA revestida com anticorpo anti-DcR3 McAb (2 ug /ml) a 4 ° C. Depois de proteínas foram lavadas variado fora, o DcR3 ligado foi detectado com biotinilado anti-DcR3 e o McAb SA-HRP e visualizadas com o substrato TMB. A concentração da amostra desconhecida foi determinada a partir da curva padrão, que foi calculada simultaneamente.

regulação negativa do DcR3 com pequeno RNA de interferência (siRNA)

Small interferir sequências de RNA para DcR3 humano foram projetados usando o BLOCK -IT RNAi Designer (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA). A sequência 5′-siARN foi CGCUGCAGCCUCUUGAUGGAGAUGUCC-3 ‘, e a sequência de controlo de ARNip foi 5′-AGGUAGUUCCAGAACUGCGUGUAGUGG-3’. Eles foram sintetizados quimicamente para knockdown transiente de DcR3 em cultura de células. Além disso, as sequências similares foram inseridos no vector de expressão para um pSilencer estável expressor de baixo DcR3. A transfecção foi realizada com o reagente Lipofectamina LTX (Invitrogen Life Technologies) e meios Opti-MEM, de acordo com as instruções do fabricante. As células com knockdown transiente de DcR3 foram usadas dentro de 3 dias. Os transfectantes estáveis ​​foram selecionados em 50 ug /ml de higromicina B. As células sobreviventes foram agrupados para evitar variação colónia e usar para

in vivo

estudo.

ensaios de apoptose

As células apoptóticas foram detectadas com 3 ensaios. As células foram colhidas às 24-48 horas e coradas com anexina V /iodeto de propídio (PI) para células apoptóticas ou fixados em álcool a 75%, seguido por coloração com PI para a fracção sub-G1, de acordo com protocolo padrão dos fabricantes. Os resultados foram analisados ​​por citometria de fluxo. Western blotting foi realizado de PARP clivada. As células recolhidas foram lisadas com 1% de tampão de lise NP-40-Tris contendo um cocktail de inibidores de protease, e a concentração de proteína de lisado foi determinada com o método de BCA (Pierce, Rockford, IL). A proteína (30 ug) foi carregado para 10% de SDS-PAGE, electroforese, transferido para uma membrana de nitrocelulose, incubadas com 0,5 ug /ml de anticorpo de coelho anti-clivada PARP ou anti-GAPDH (como controlo de carga) seguido por anticorpos anti-coelho-HRP e visualizado com substrato quimioluminescente ECL.

ética animal

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com e aprovado pela Universidade de Rochester (Rochester, NY) animal Care Institucional e Comitê de Uso (IACUC ), a Comissão de Universidade de Recursos Animais (UCAR), conforme descrito no

manual sobre o Responsible Care e Uso de Animais de Laboratório

. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento e limitar o número de animais. Todos os animais que apresentaram sinais de fraqueza e desidratação devido ao tratamento recebido uma dieta alimentar molhado. Animais que continuaram a apresentar sinais de fraqueza foram humanamente eutanasiados por deslocamento cervical.

O crescimento do tumor em ratinhos nus

transfectantes de controlo ou transfectantes com baixa expressão DcR3 (2 × 10

6 em 0,2 ml de solução salina) foram injectados por via subcutânea nas patas traseiras de ratos nus atímicos (5-6 semanas de idade) com uma agulha de calibre 27,5. Os tumores foram deixados a crescer durante 7 dias (aproximadamente 0,1 cm

3) antes do tratamento. Os ratinhos portadores de tumores formada por qualquer dos transfectantes de controlo ou transfectantes com baixa expressão de DcR3 foram divididos aleatoriamente em 2 grupos (8 murganhos /grupo), tratados com solução salina como controlo ou gemcitabina (IV 100 mg /kg) duas vezes por semana durante 4 semanas. Para a curva de crescimento do tumor, o tamanho do tumor foi medido duas vezes por semana com compassos de calibre de Vernier. Os volumes tumorais foram calculados de acordo com a fórmula

(L x W2) /2

por medição do comprimento do tumor (L) e a largura (W). No final da experiência, os tumores foram removidos e pesados. Um teste ELISA foi usado para avaliar o nível de DcR3 em homogeneizado de tumor (30 ug). Western blot foi realizada para DcR3, TRAIL, e clivada PARP.

Análise estatística

Todos os dados foram expressos como a média ± desvio padrão (SD) de pelo menos 3 determinações, salvo indicação contrária. As diferenças entre ou entre os grupos controle e tratamento foram determinadas por estudante do

t-

teste ou análise de variância (ANOVA).

P

. 0,05 significância estatística indicou

Resultados

DcR3 obrigado a trilha

TRAIL é um ligando morte ligada à membrana com níveis baixos, sob condições normais condições de cultura, e é o DcR3 um receptor chamariz segregada. Embora FasL, TL1A, ea luz têm sido identificados como ligandos de DcR3 [14], [15], [16], [17], [18], a interacção de DcR3 com TRAIL não foi estudada em grande detalhe. Porque as ações TRAIL domínios funcionalmente semelhantes com FasL, TL1A, e a luz, nós especulamos que DcR3, que se liga a FasL, TL1A, e leve, também pode ligar-se a TRAIL.

Para determinar se DcR3 se liga a TRAIL, nós estado conduzida da análise de ligação arte Biacore. O DcR3 recombinante puro foi ligado covalentemente na superfície do chip de fluxo, e o TRAIL recombinante puro e leve (como um controlo positivo) foram lavados através da superfície em várias concentrações. A Figura 1 mostra a curva de ligação de TRAIL para DcR3 em diferentes concentrações (1-2048 nM). Como mostrado na Tabela 1, embora o controlo constante de equilíbrio (

K

eq) de leve humana recombinante de DcR3 foi de 13,2 nM, a constante de velocidade de associação (

K

um

) e constante da taxa de dissociação (

K

d

) para TRAIL humano recombinante para DcR3 foram 1,97 × 10

4 1 /Ms e 1,04 × 10

-3 1 /s, respectivamente, e

K

eq

foi de 52,8 nM, indicando ligação entre TRAIL e DcR3; No entanto, a afinidade foi menor do que a da luz de DcR3.

ensaios Biocore, citometria de fluxo, Western blot, ELISA e ensaios de ligação semelhantes foram realizadas para determinar a interacção física entre o DcR3 e TRAIL. análise (A) Biacore. A curva de ligação de TRAIL para DcR3 foi determinada a diferentes concentrações (1-2048 nM). O controle

K

eq

da LIGHT humana recombinante a DcR3 foi de 13,2 nM, enquanto o

K

eq

de TRAIL para DcR3 foi de 52,8 nM. (B) A citometria de fluxo para DcR3 com TRAIL na superfície da célula. células AsPC-1 em suspensão foram incubadas primeiro com PBS, TRAIL (5 ug /ml) sem (pista 2) ou com o DcR3 (pista 4), o DcR3 recombinante (pista 3), ou de ratinho anti-TRAIL MAb (1 ug /ml) com DcR3 (pista 5). Em seguida, 5 ug /ml de anti-DcR3 biotinilado foi adicionado para determinar a ligação de DcR3 sobre a superfície celular com citometria de fluxo. (C e D) de citometria de fluxo para TRAIL exposta. A gemcitabina foi adicionado a AsPC-1 (0-1000 nM) ou MiaPaCa-2 (0-100 nM) para estimular as células a expressão de TRAIL. As células também foram tratados com PBS, 10 nM de ARNsi de DcR3 (para reduzir a ligação de TRAIL e mascaramento) DcR3 recombinante, ou adicional (para bloquear o acesso de anti-TRAIL) para detectar TRAIL por citometria de fluxo. (E e F) co-localização de DcR3 e TRAIL. ASPC-1 sem células tratadas (como controlo) ou com 500 nM de gemcitabina (para aumentar a expressão de TRAIL) foram coradas com anticorpo anti-TRAIL-PE e anti-DcR3-FITC. células Doublestained foram avaliados por citometria de fluxo. (G para G) Imunoprecipitação e Western blotting para o complexo de DcR3-TRAIL. 70-kDa complexo DcR3-TRAIL em 100 ul de pura mistura de DcR3 e TRAIL (G e H), lisado (I e J), ​​ou meios de cultura (K e L) de células AsPC-1 foi capturado com McAb anti-DcR3 ( G, I, K) ou anti-TRAIL (H, J, L) e o McAb imobilizado com 30 ul de pérolas de proteína a. O complexo de McAb-DcR3-TRAIL foi eluída com tampão de Laemmli e sujeitos a Western blotting com biotinilado anti-TRAIL (G, I, K) ou anti-DcR3 (H, J, L) seguido de SA-HRP e detector de ECL. (M e N) Encadernação concorrência entre as formas livres e imobilizadas de DcR3 e TRAIL. H: Após 100 uL de 1 ug de TRAIL recombinante /ml ou FasL foi imobilizado numa placa de ELISA, 1 ug /ml de DcR3 foi adicionado sem (grupo sem competição) ou com 10 ug /ml de TRAIL ou FasL (grupo de competição) ou TRAIL fervido ou FasL (sem controlo da proteína de função), seguido por biotinilado anti-DcR3 e SA-HRP e substrato TMB. N: DcR3 foi imobilizado numa placa de ELISA. TRAIL e FasL foram utilizados como ligandos sem ou com cozidos ou funcionais 10? G /ml de TRAIL ou FasL na presença de DcR3, seguido por anti-TRAIL biotinilado ou anti-FasL, e substrato SA-HRP e TMB.

para determinar se DcR3 se liga a TRAIL, nós pré-incubados AsPC-1 células cancerosas pancreáticas humanas com ou sem DcR3 recombinante, TRAIL, ou anti-TRAIL McAb, e depois manchado-los com biotinilado anti-DcR3 seguido por estreptavidina-FITC. A citometria de fluxo (Figura 1B) demonstraram que, enquanto biotinilado anti-DcR3 e estreptavidina-FITC sozinho resultado na coloração pouco de DcR3, o DcR3 recombinante pode ligar-se à superfície da célula e ser detectado com anti-DcR3. Devido à concorrência entre TRAIL gratuito e TRAIL ligada à membrana, TRAIL recombinante reduzida de superfície celular DcR3 vinculativo. Esta ligação foi também reduzida pela pré-incubação com anti-TRAIL, que bloqueou a acessibilidade de DcR3 para TRAIL ligada à membrana. Juntos, os dados indicam que DcR3 recombinante se liga a trilha na superfície das células AsPC-1.

Para observar melhor a interação entre TRAIL e DcR3, usamos gemcitabina, um primeiro-line antipancreatic droga contra o câncer e TRAIL conhecido indutor, para regular positivamente de TRAIL. Devido às diferenças de sensibilidade ao fármaco, as células AsPC-1 (Figura 1C), requerida a 10 vezes mais elevadas do nível de gemcitabina para aumentar a expressão de TRAIL, em comparação com MiaPaCa-2 células (Fig 1D). Colocámos a hipótese de que o DcR3 se mascarar solúvel de TRAIL na superfície celular; Assim, a redução de DcR3 reduziria o mascaramento e aumentar a coloração de TRAIL exposta. Para testar esta hipótese, utilizou a abordagem DcR3 siRNA. A redução do DcR3 reduzida mascaramento de TRAIL e aumento da acessibilidade dos anti-TRAIL em células AsPC-1 (Fig 1C), enquanto os siRNA de controle não teve tal efeito. Da mesma forma, temos a hipótese de que o aumento do DcR3 torno das células aumentaria o mascaramento e reduzir a acessibilidade dos anti-TRAIL a TRAIL. DcR3 recombinante foi adicionado às células, provocando assim a coloração TRAIL reduzida como detectada por citometria de fluxo (Figura 1C). Um padrão similar foi observado em MiaPaCa-2 (Figura 1D), o que sugere que o fenómeno de mascaramento TRAIL com DcR3 é comum na linha de células testada. Estes resultados apoiam fortemente a noção de que o DcR3 está associada com TRAIL na superfície da célula.

Para determinar a ligação de DcR3 para TRAIL, foi utilizado gemcitabina para provocar a sobre-expressão de TRAIL [19], [20] e adicionou DcR3 recombinante. dupla coloração com anticorpo anti-TRAIL-PE (vermelho) e anti-DcR3-FITC mostrou uma co-localização aumentada (Figura 1F), em comparação com o controlo (Figura 1E), sugerindo que o DcR3 está fisicamente associada com TRAIL.

Para confirmar a associação física do DcR3 com TRAIL, foi realizada imunoprecipi tacão e transferência Western. FasL, um ligando conhecido para DcR3, foi utilizado como um controlo positivo. Os resultados mostraram que o complexo de DcR3-TRAIL anti-DcR3-capturado (aproximadamente 70 kDa MW sob condições suavemente desnaturantes) pode ser detectada por anticorpos anti-TRAIL em uma mistura de DcR3 recombinante puro e TRAIL (figura 1G), lisado (Figura 1I) , media ou condicionado (Fig 1K) de células AsPC-1 que expressa tanto DcR3 e TRAIL. Da mesma forma, o complexo DcR3-TRAIL anti-capturou-TRAIL pode ser detectado por anti-DcR3 nas mesmas 3 definições (Fig 1H, 1J e 1D). Como um controlo positivo lado-a-lado, FasL exibiu um padrão semelhante ao do complexo de DcR3-FasL anti-capturado-FasL detectado por anticorpos anti-DcR3 (Figura 1G, 1I e 1K), que suporta fortemente a noção de que TRAIL e ligam FasL para DcR3. Notavelmente, o complexo de DcR3-TRAIL formado não só em condições de proteína pura (Figura 1G e 1H), mas também numa condição natural na forma ligada à membrana (no lisado, Fig 1I e 1J) e sob a forma de secreção (em meios , Fig 1K e 1L). As bandas de complexo de DcR3-TRAIL em meios eram muito mais finas do que as bandas em lisado, indicando que o complexo foi ligada à membrana. Estes resultados foram consistentes com os obtidos através de citometria de fluxo.

Para confirmar ainda mais a associação de DcR3 com TRAIL, foi realizado um ensaio de ELISA semelhante. Quando TRAIL ou FasL foi usado para revestir placas de ELISA, a ligação de DcR3 para estes ligandos podem ser detectados com anticorpos anti-DcR3 e reduzida pela adição de TRAIL recombinante livre ou FasL, que competiu com DcR3 para o TRAIL ou FasL imobilizada (Figura 1M) . Em contraste, quando o DcR3 foi usado para revestir placas de ELISA, o TRAIL recombinante ou FasL ligado a DcR3 imobilizada e foi detectado por anti-TRAIL ou anti-FasL, que também foi parcialmente bloqueado pela forma livre de DcR3 (Figura 1 N).

Em todos os testes, o complexo de FasL-DcR3 serviu como um controlo positivo lado-a-lado e mostrou um padrão semelhante ao do complexo de DcR3-TRAIL (figura 1G, 1I, 1K. 1L e 1 M), fortemente de apoio que TRAIL é de fato um novo ligando de DcR3.

Alteração de DcR3 afetada induzida por gemcitabina apoptose

Para estudar a função biológica do DcR3 em câncer pancreático, medimos o nível de DcR3 por um ELISA quantitativo para DcR3 [21], em AsPC-1 e MiaPaCa-2 pancreáticas células cancerosas. Comparado com SW480, uma linha celular de adenocarcinoma do cólon humano que se sabe que expressam níveis elevados de DcR3, em comparação com outras linhas 13 celulares [22], as células AsPC-1 e MiaPaCa-2 tinha um nível ainda mais elevado de DcR3 (Figura 2 A), o que é consistente com outros relatórios [23], [24]. Ambos DcR3 e TRAIL expresso em um alto nível sobre as mesmas células, sugerindo que moléculas anti-apoptóticos e pró-apoptóticos são equilibradas em um nível elevado para neutralizar um ao outro. A expressão natural de níveis elevados de ambas as moléculas faz com que o estudo da sua interacção muito mais fácil.

(A) Expressão de DcR3 em AsPC-1, MiaPaCa-2, e as células SW480 (como controlo positivo). O nível de DcR3 em 100 ul de meio condicionado a partir de células que foram cultivadas em placas de 6 poços (4 mL) foi medido com um ensaio ELISA. (B e C) gemcitabina reduzida expressão DcR3. células AsPC-1 e MiaPaCa-2 foram tratados com gemcitabina, nas concentrações indicadas, durante 48 horas. O nível de DcR3 foi medida em 100 ul de meio de cada grupo. (D) siRNA derrubado expressão DcR3. As células (1 x 10

5) em placas de 6 poços foram transfectadas com 10 nM de DcR3 ou ARNsi de controlo em Transfectin LTX (6,25 ul /poço). Após 24 horas, DcR3 em meios de cultura foi medida com um ELISA.

Para determinar o efeito interativo de DcR3 e TRAIL em células cancerosas, gemcitabina e siRNA para DcR3 foram usadas para regular o nível de DcR3. As células AsPC-1 e MiaPaCa-2 foram tratados com diferentes doses de gemcitabina durante 48 horas, e o nível de DcR3 no meio foi medida com um ensaio ELISA. Os resultados mostraram que o DcR3 gemcitabina reduzida de uma forma dependente da dose em ambas as linhas celulares (Fig 2B e C). Uma redução similar foi observado com siRNA (Fig 2D).

Se a função de DcR3 reduziu-gemcitabina é para fazer pender a balança para a apoptose, em seguida, a adição de DcR3 deve reverter a apoptose induzida por gemcitabina. Assim, as células AsPC-1 e MiaPaCa-2 foram tratados com diferentes doses de gemcitabina com ou sem DcR3 recombinante durante 48 horas, e, em seguida, as células apoptóticas foram medidos com coloração de anexina V. Os resultados mostraram que 5-8% das células estavam apoptóticas no controle, que aumentou para aproximadamente 30% no grupo de gemcitabina. Esta apoptose induzida por gemcitabina foi reduzida pela adição de DcR3 recombinante (0, 0,5, 1, e 2 ug /ml) de um modo dependente da dose (Figura 3A e 3B). Do mesmo modo, o aumento induzido por gemcitabina da actividade da caspase 3, foi invertida pela DcR3 (Figura 3C e 3D). Estes resultados sugerem que o DcR3 desempenha um papel crítico na inibição da apoptose e que a redução induzida por gemcitabina de DcR3 pode ser relacionado com a sua actividade anti-tumoral.

A gemcitabina foi adicionado aos meios de AsPC-1 (500 nM) ou MiaPaCa-2 células (50 nm) foram incubadas com 0, 0,5, 1, ou 2 ug /ml de DcR3 recombinante durante 24 horas. As células foram então sujeitas a citometria de fluxo para a fracção sub-G1 (A e B) ou um ensaio enzimático para a actividade da caspase 3 (C e D). apoptose desencadeada-A gemcitabina foi diminuído pela adição de DcR3 de um modo dependente da dose (

P

0,01).

regulação negativa do DcR3 com a apoptose mediada por TRAIL em siRNA promovido vitro

para testar se o desmascaramento de TRAIL pode aumentar a sua acessibilidade ao seu receptor e melhorar esta via morte, que examinou o efeito de DcR3 sobre a apoptose mediada por TRAIL. A fragmentação do ADN (sub-G1) ensaio mostrou que quando as células AsPC-1 foram tratados com FasL ou luz mais ARNsi de controlo ou ARNsi de DcR3, a apoptose não aumentou significativamente. No entanto, quando tratados com TRAIL e DcR3 siRNA, células AsPC-1 exibiram um aumento dramático na apoptose, em comparação com as células tratadas com TRAIL mais ARNsi de controlo (Figura 4A). células MiaPaCa-2 exibiu um padrão semelhante (Figura 4C). A apoptose aumentada foi ainda confirmada por um aumento da PARP clivada, como determinado por Western blotting (Figura 4B e 4D). Os resultados indicam que a redução de DcR3 pode aumentar consideravelmente o efeito pró-apoptótica de TRAIL nestes 2 linhas celulares do cancro do pâncreas (tal como comparado com FasL e LUZ), ao passo que o DcR3 é utilizada por estas células para neutralizar o efeito pró-apoptótica de TRAIL.

células AsPC-1 ou MiaPaCa-2 foram transfectadas com 10 nM de ARNsi de controlo ou ARNsi de DcR3, respectivamente. Após 24 horas, as células foram tratadas com FasL recombinante, luz, ou TRAIL (100 ng /ml para AsPC-1 e 20 ng /ml para as células MiaPaCa-2) durante 24 horas. As células foram colhidas e sujeitas a citometria de fluxo para a fracção sub-G1 (A e C) ou por Western blotting de PARP clivada (B e D). DcR3 siRNA aumentou significativamente a apoptose induzida por TRAIL (

P Art 0,05).

DcR3 afetados mediada por gemcitabina apoptose in vitro

DcR3 siRNA e gemcitabina reduziu o nível de expressão de DcR3 (Figura 3 e 4). Quisemos determinar se ainda a regulação negativa de DcR3 através da combinação destes 2 factores podem aumentar o efeito pró-apoptótica, em comparação com um único factor sozinho. Depois as células foram tratadas com siRNA ou gemcitabina sozinha ou em combinação, a fragmentação do ADN e PARP clivada foram medidos. Os resultados mostraram que enquanto a gemcitabina sozinha provocou um aumento da apoptose (Fig 5A e 5C) e os níveis de PARP clivada (Fig 5B e 5D), a sua combinação com ARNsi aumentou ainda mais a apoptose e níveis de PARP clivada (Fig 5). Sem um ligando pró-apoptótica com o qual se ligar e neutralizar, DcR3 siRNA sozinho não teve nenhum efeito; No entanto, quando TRAIL foi regulada positivamente por gemcitabina, a redução de DcR3 diminuiu o mascaramento de TRAIL, promovendo assim a apoptose.

AsPC-1 ou MiaPaCa-2 As células foram transfectadas com 10 nM de ARNsi de controlo ou ARNsi de DcR3, respectivamente . Após 24 horas, as células foram tratadas com gemcitabina (25 ou 250 nM, respectivamente) durante 24 horas. As células foram colhidas e sujeitas a citometria de fluxo para a fracção sub-G1 (A e C) ou por Western blotting de PARP clivada (B e D). A combinação de DcR3 siRNA e gemcitabina reforçado significativamente o efeito pró-apoptótica.

Estes resultados são consistentes com aqueles na Figura 3. Em conjunto com os resultados mostrados nas Figuras 1 e 4, os dados sugerem que a ligação de DcR3 a TRAIL reduz a apoptose induzida por TRAIL e protege as células tumorais, o que pode explicar a resistência de tumores ao tratamento TRAIL.

regulação negativa do DcR3 aumentou o efeito quimioterápico no crescimento do tumor in vivo

Incentivado por prometendo

in vitro

resultados, queríamos determinar se a redução do DcR3 poderia aumentar a eficácia da quimioterapia

in vivo.

células ASPC-1 foram transfectadas com um vector de expressão de mamífero que continha siRNA para knockdown da expressão de DcR3 e uma cassete para a selecção de G418. As células de transfecção simulada-reunidas vector (como controlo), ou células transfectadas com ARNsi de DcR3 baixa expressão de DcR3 (confirmado por ELISA) foram injectadas em ratinhos nus, e os tumores estabelecidos (60 mm3) foram então tratadas com gemcitabina. Os resultados mostraram que o DcR3 ARNsi por si só não o crescimento do tumor lento (Figura 6A) ou reduzir o peso do tumor (Fig 6B);