Abstract

Objectivo

O papel da quercetina no tratamento do câncer de ovário ainda é controverso, e o mecanismo é desconhecido. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos terapêuticos da quercetina em combinação com cisplatina e outras drogas anti-neoplásicas em células de cancro do ovário, tanto

in vitro

e

in vivo

, juntamente com o molecular mecanismo de acção.

Métodos

tratamento quercetina em várias concentrações foi examinada em combinação com cisplatina, taxol, pirarubicina e 5-FU em células SKOV3 humana epitelial de ovário C13 câncer * e. ensaio CCK8 e ensaio de anexina V foram para a viabilidade celular e análise de apoptose, imunofluorescência, coloração DCFDA e em tempo real PCR foram utilizados para espécies reactivas de oxigénio (ROS) de detecção de lesão induzida e antioxidante endógeno enzimas expressão. ratinhos nus atímicos BALB /c-nu foram injetados com células C13 * obter um modelo de xenotransplante para

In vivo

estudos. análise imuno-histoquímica foi realizada para avaliar a atividade lesões e SOD1 induzida ROS de tumores xenoenxerto.

Resultados

Ao contrário do que o efeito pró-apoptótica de alta concentração (40? M-100 M) de quercetina, baixas concentrações (5 ^ M-30 pM) de quercetina resultou em vários graus de atenuação da citotoxicidade de tratamento com cisplatina quando combinada com cisplatina. Foram observados efeitos anti-apoptóticas similares quando a quercetina foi combinada com outros agentes anti-neoplásicos: Taxol, pirarubicina e 5-fluorouracilo (5-FU). Baixas concentrações de quercetina foram observados para suprimir a lesão induzida por ROS, reduzir intracelular nível de ROS e aumentar a expressão de enzimas antioxidantes endógenos, sugerindo um mecanismo de ROS-mediada de atenuação de drogas anti-neoplásicas. No modelo xenogeneico, quercetina levou a uma redução substancial de eficácia terapêutica de cisplatina, juntamente com o aumento da expressão da enzima antioxidante endógena e reduzindo os danos induzidos ERO em tecido de tumor de xenoenxerto.

Conclusão

Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a quercetina em baixas concentrações atenuar os efeitos terapêuticos de cisplatina e outros fármacos anti-neoplásicos em células de cancro do ovário, reduzindo os danos ROS. suplementação de quercetina durante o tratamento do câncer de ovário pode afectar negativamente a resposta terapêutica

Citation:. Li N, Sun C, Zhou B, Xing H, Ma D, Chen G, et al. (2014) de baixa concentração de quercetina antagoniza o efeito citotóxico de anticorpos anti-neoplásicos Drogas no cancro do ovário. PLoS ONE 9 (7): e100314. doi: 10.1371 /journal.pone.0100314

editor: Rubi John Anto, Rajiv Gandhi Centro de Biotecnologia, Índia |

Recebido: 11 de dezembro de 2013; Aceito: 26 de maio de 2014; Publicação: 07 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa básica da China (973 Programa, 2009CB521808); National Nature e Science Foundation da China (81230038; 81272859; 81025011; 81090414; 81000979; 81101962); Nature e Science Foundation da Província de Hubei (2011CBD542); Fundos fundamentais pesquisa para as universidades Central (HUST: 2012TS058). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a neoplasia maligna invasiva mais comum do trato genital feminino nos Estados Unidos, com um número estimado de 22.240 casos diagnosticados anualmente. Cerca de 14.030 mulheres morrem a cada ano de câncer de ovário, que representa a causa mais comum de morte entre mulheres com tumores ginecológicos [1]. fármacos de platina, tais como cisplatina e carboplatina, são agentes quimioterapêuticos de primeira linha para o tratamento de cancro do ovário. Embora a maioria dos pacientes apresentar quimio-sensibilidade, quando do início da terapia, a resistência aos medicamentos adquiridos tornou-se um grande obstáculo no tratamento do câncer. Os factores que podem aumentar ou suprimir o efeito anticancerígeno de drogas anti-neoplásicas parecem ser importantes no tratamento de cancro do ovário.

A quercetina (3,3 ‘, 4’, 5,7-pentahydroxyflavone, Quer) pertence a uma classe de compostos flavonóides, e está em vários vegetais, frutas, sementes, nozes, chá e vinho tinto [2]. É o principal flavonóide na dieta humana, com um consumo dietético diário estimado de 25 mg nos Estados Unidos [3]. Como um antioxidante comprovado, quercetina é recomendado para tomar por via oral para a prevenção e da saúde do cancro cuidados [4]. Nos últimos anos, vários estudos têm observado que a quercetina pode actuar como um potencial medicamento anti-cancro, melhorando a toxicidade do tratamento com cisplatina no hepatoma HA22T /VGH e células A2780 cancro do ovário [5] – [7]. No entanto, existem estudos relataram que, em contraste com altas concentrações de flavonóides diminuiu a sobrevivência celular e viabilidade, baixas concentrações de aumento da capacidade antioxidante total de células cancerosas e impedir a morte celular devida a drogas citotóxicas, tais como cisplatina e 5-FU na A549 do cancro do pulmão e células HCT116 do cancro colo-rectal [8], [9]. O papel da quercetina no tratamento do câncer de ovário é controverso, e o mecanismo de ação permanece desconhecido.

A cisplatina e outros agentes anti-neoplásicos levar a aumentos de espécies reativas de oxigênio intracelulares (ROS) que podem contribuir para o seu efeito terapêutico . Antioxidante tais como suplementos de vitamina C pode atenuar a actividade anti-neoplásica de drogas que aumentam ROS [10]. A quercetina é conhecido por reduzir intracelulares níveis de ROS em vários tipos de células, promovendo o sistema ROS-eliminadora intracelular, o que inclui a modulação de enzimas desintoxicantes, tais como superóxido dismutase 1 (SOD1) e catalase (CAT). Ele levou-nos a questionar que se quercetina também pode anular os efeitos citotóxicos de medicamentos anti-neoplásicos que o aumento das ROS. O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos da quercetina em combinação com cisplatina e outras drogas anti-neoplásicas em células de cancro do ovário, tanto

in vitro

e

in vivo

, juntamente com o mecanismo molecular de ação.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do Instituto Nacional de Saúde. O protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação Animal de Tongji Medical College, Huazhong Universidade de Ciência e Tecnologia (número de autorização: S292). foram feitos todos os esforços para minimizar o sofrimento dos animais

produtos químicos e reagentes

A quercetina ( 99% de pureza)., cis-Diammineplatinum (II) dicloreto (cisplatina), Taxol (paclitaxel) foi adquirido a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO), dissolvido em DMSO, aliquotados, e armazenados a -20 ° C. Pirarubicina (Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co., Ltd., China) e 5-fluorouracilo (5-FU) (Xangai Xudong Haipu Pharmaceutical Co. Ltd., China) foram dissolvidos em solução salina normal.

cultura celular

a linha epitelial do ovário humano de células de cancro C13 * [11] é o clone resistente a cisplatina de linha de células OV2008, que foi derivada de um carcinoma do ovário humano. Esta linha de células C13 * foi um presente do Prof. Rakesh na Ottawa Regional Cancer Center, Ottawa, Canadá [3]. A linha celular de cancro do ovário SKOV3 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC). células cancerosas do ovário foram cultivadas em meio RPMI 1640 com 10% de soro fetal de bovino (FBS) a 37 ° C com 5% de CO

2.

A viabilidade celular

A viabilidade celular foi medida com CCK8 ensaio (contagem de células kit-8, DOJINDO Tecnologias moleculares, Tóquio, Japão). As células foram preparadas em placas de cultura celular de 96 poços a uma densidade celular de 5 x 10

3 células /cavidade e tratados com quercetina /drogas anti-neoplásicas (cisplatina, taxol, pirarubicina e 5-FU) ou veículo (DMSO com a mesma taxa de diluição como os medicamentos) a 37 ° C durante 48 h. A monocamada de células foi lavada três vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo CaCl 1,2 mM

2 e MgCl 0,7 mM

2, em seguida, uma solução de 01:10 CCK8 diluída em meio RPMI 1640 foi adicionado às células e incubado durante 2 h a 37 ° C. Os resultados foram medidos por um leitor de microplacas a 450 nm e expressa como percentagens dos valores de controlo (obtidos para as células tratadas com veículo).

anexina V /PI coloração

As células foram tripsinizadas e lavadas com meio contendo soro. As amostras (5 × 10

5 células) foram centrifugadas durante 5 min a 400 x g e o sobrenadante foi descartado. As células foram então coradas utilizando um kit de anexina V-FICT /PI apoptose (Keygen Biotech, Nanjing), de acordo com as instruções do fabricante. O número de células em apoptose foi detectada e analisada por citometria de fluxo.

Medição da ROS

ROS foi detectada usando oxigênio reativo Espécies Assay Kit (Beyotime, China) de acordo com as instruções do fabricante. Após a sonda molecular 5- (e-6) -Clorometil-2 ‘, diacetato de 7’-dichlorodihydrofluorescein (DCFH-DA) se difunde nas células e é sequestrado intracelularmente por de-esterif icação, a reacção subsequente com peróxidos gera fluorescente 5-clorometil- 2 ‘, 7’-diclorofluoresceína (DCF). Resumidamente, após o tratamento, as células foram recolhidas por centrifugação, ressuspensas em PBS contendo 10 umol /L de DCFH-DA, incubadas durante 20 min a 37 ° C, lavadas com PBS para remover o excesso de corante, e, em seguida, incubadas com meio RPMI a 37 ° C durante 10 min, os resultados de fluorescência foram obtidas utilizando o canal FL-1 de um Becton Dickinson FACSCalibur, e analisados ​​por meio de CellQuest Software. A percentagem de células que exibem aumento da captação de corante foi usada para reflectir um aumento nos níveis de ROS.

imunofluorescência

Resumidamente, C13 células * foram semeadas em placas de 24 poços de cultura de células contendo um vidro estéril corrediça a uma densidade celular de 2 x 10

4 células /poço. Depois tratou-se com diferentes drogas durante 48 h, as células foram lavadas três vezes com PBS arrefecido em gelo, e fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS durante 20 min à temperatura ambiente. Após o bloqueio com leite magro a 1%, durante 2 h, anticorpos de γH2AX anti cabra anti-8-OHdG e de ratinho (Millipore) foram adicionados aos corrediços respectivamente. Após 4 h de incubação, as lâminas foram lavadas 3 vezes com 0,5% de PBS-Tween 20 (PBST) e o anticorpo secundário anti-rato fluoresceína Cy3 conjugado anticorpo de ratinho secundário anti-cabra e conjugado com FITC de cabra (Sigma-Aldrich) foram adicionados a uma diluição de 1:100. As células foram incubadas durante 45 min a 37 ° C. Finalmente, as células foram lavadas como descrito acima e examinadas por microscopia de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão). Cinco imagens de campo de alta potência aleatórios foram tomadas de cada grupo, software Image J foi utilizada para calcular o número de células coradas altamente positivos.

em tempo real Transcrição Reversa Cadeia da Polimerase (RT-PCR)

C13 * As células foram semeadas em placas de cultura celular de 6 poços a uma densidade de 5 x 10

5 células /poço, e tratou-se com quercetina e cisplatina, durante 48 h. O ARN total foi extraído utilizando Trizol (Invitrogen, China). O DNA complementar foi sintetizado de acordo com o protocolo do fabricante (Toyobo, Japão). Em tempo real a amplificação por PCR foi realizada num 7500 termociclador ABI Prism com reagente de SYBR (Toyobo, Japão). As condições dos ciclos térmicos foram definidos como indicado nas instruções que acompanham o reciclador, com uma temperatura de recozimento de 60 ° C. Os oligonucleótidos utilizados para a amplificação de superóxido dismutase 1 (SOD1), endonuclease de L (EndoG), citocromo c (cito-C), a glutationa-peroxidase (GPx), catalase (CAT) e proteína de desacoplamento 2 (UCP2) (Tabela S1) foram concebidos utilizando iniciador 5.0 e sintetizados pela Invitrogen. normalização quantitativa de ADNc foi efectuada utilizando a desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato gene de manutenção (GAPDH) como um controlo interno para determinar a uniformidade do ARN modelo para todas as amostras. Para cada amostra, a expressão do gene de interesse foi obtido a partir da relação entre a sua expressão para a expressão de GAPDH utilizando a seguinte fórmula:. Express relativa = 2- (ΔCt amostra-ΔCt controlo), ΔCt = Ct do gene-Ct GAPDH

In vivo

estudos de xenotransplante

O

in vivo

avaliação de quercetina foi realizada utilizando um modelo de xenoenxerto de células C13 * humanos. Atímicos BALB /ratinhos nus c-nu (4-6 semanas de idade, obtidos a partir de Pequim HFK empresa de biociência, Beijing, China) foram alojados em uma sala livre de patógenos específicos dentro das instalações dos animais no Centro de Animais de Laboratório da Universidade de Tongji Medical College . Os animais foram deixados a aclimatar ao seu novo ambiente durante uma semana antes da utilização. células C13 * (2 × 10

6) foram ressuspensas em meio PBS com Matrigel matriz da membrana basal (BD Biosciences, Bedford, MA) a uma 01:01 proporção (volume total 100 mL), em seguida, foram injectados por via subcutânea nos flancos ratos nus (dia 0). A partir do 10 ° dia da injecção, os ratos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos de tratamento (n = 8 para cada grupo) e injectados intraperitonealmente (ip) com solução salina normal (NS), a quercetina (20 mg /kg de peso corporal, diariamente), cisplatina ( 4 mg /kg de peso corporal, de quatro em quatro dias), e o tratamento combinado quercetina e cisplatina (utilizando as dosagens acima) durante 21 dias consecutivos. peso corporal e massa do tumor foram medidos a cada 5 dias. O volume do tumor foi determinada utilizando um paquímetro e calculada de acordo com a fórmula (largura

2 × comprimento) /2. Os ratinhos foram mortos por deslocamento cervical, sob anestesia após tratamento três semanas (dia 30).

A análise imunohistoquímica

Estudos imuno-histoquímicos foram realizados sobre os tumores de xenoenxerto depois de terem sido removidos de ratinhos nus. Os tumores foram fixados em 40 mg /mL de paraformaldeído, e cortada em 4 uM secções seriadas embebidos em parafina. Em seguida, as peroxidases endógenas foram rapidamente arrefecidos e as secções foram lavadas cuidadosamente com solução salina de fosfato tamponada (PBS) três vezes. As secções foram bloqueadas com soro de cabra 2% e soro de coelho, respectivamente, em PBS, à temperatura de 37 ° C durante 45 min, em seguida, incubadas com anticorpo de ratinho anti-SOD1 (1:500 diluição, Abcam) e anticorpo de cabra anti-8-OHdG (1 :800 diluição, Millipore) durante a noite a 4 ° C. Em seguida, as secções foram incubadas com o ratinho de cabra anti-e anticorpos secundários conjugados com peroxidase anti-rato de cabra rábano separadamente e complexo de avidina-biotina seguido de diaminobenzidina (Vector ABC, Burlingame, CA, EUA). Imerso em água 2% de amoníaco, hematoxilina foi usado para contracoloração. As secções foram incubadas com de coelho e soro de IgG de cabra controlos, respectivamente, como negativos.

positiva 8-OHdG coloração era principalmente nos núcleos enquanto expressão positiva de SOD1 foi principalmente um padrão citoplasma tanto em células tumorais, e não nas células estromais . Por causa da intensidade de 8-OHdG e SOD1 coloração dentro de cada seção foi principalmente homogênea, a imunorreatividade nas amostras foi avaliada utilizando os seguintes critérios semi-quantitativa: forte positivo (marcado como 3), forte intensidade de coloração ( 90% da células cancerosas); positiva moderada (pontuada como 2), a intensidade da coloração moderada ( 50-89% de células positivas); positiva fraca (pontuada como 1), fraca intensidade de coloração ( 10-49% de células positivas); ausente (pontuada como 0), nenhuma intensidade de coloração e não positivo ou apenas algumas células positivas para [12], [13]. A intensidade da coloração e proporção de cada seção manchada foram calculados utilizando cinco imagens de alta campo de energia aleatórias de cada grupo por dois investigadores independentes.

Análise Estatística

Todos os experimentos foram realizados em triplicado. Os dados são apresentados como média desvio padrão ±. As análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS19.0. As diferenças entre dois grupos foram comparados usando

t

teste de Student. As diferenças estatísticas entre mais de dois grupos foram determinados pela one-way análise ANOVA seguido por comparações post hoc de pares.

P

. 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

A quercetina em baixas concentrações promove a sobrevivência de células * C13 câncer de ovário tratados com cisplatina

quimioterapia à base de platina é a terapêutica mais importante no tratamento de cancro do ovário. Para determinar o papel potencial quercetina podem desempenhar na resistência à cisplatina em cancro do ovário, células C13 * foram expostas a diferentes concentrações de quercetina, cisplatina, ou uma combinação dos dois. A IC50 de células * C13 tratadas com cisplatina foi de cerca de 80 uM (IC50 = 78,8 uM, IC 95%: 72,9-85,1 | iM) (Figura S1A). Quando as células C13 * foram tratados com 80 pM de cisplatina em combinação com doses crescentes de quercetina, verificou-se que a citotoxicidade de cisplatina foi reduzida quando se combina com baixas concentrações de quercetina (5 uM a 30 uM), enquanto a alta concentração relativa de quercetina (100 ^ M) aumentou a citotoxicidade cisplatina (Fig. 1A). Para determinar o efeito antagonista ou sensibilização da combinação de drogas, foi calculado o índice de combinação (CI) para os medicamentos à base de Chou e teorema de Talalay [14]. Os resultados mostraram que baixas concentrações de quercetina antagonizou os efeitos citotóxicos da cisplatina em células C13 *, enquanto concentrações elevadas de quercetina tem um efeito aditivo com cisplatina (Tabela S2). Nós também levaram a cabo experiências de combinação com uma série de diferentes concentrações de cisplatina com concentrações de quercetina (20 uM), que mostraram que baixas concentrações de quercetina aumento da resistência de células C13 * a cisplatina, em diversos graus (Figura S2) fixo. imagens de contraste de fase de células * C13 tratadas com controlo de veículo, a cisplatina, ou combinações de quercetina (20 uM, 80 uM) com cisplatina (80 uM) estão apresentados na Fig. 1B.

(A), a viabilidade celular de grupos expostas a diferentes concentrações de quercetina por si só, ou em combinação com 80 pM de cisplatina durante 48 horas foi medida com o ensaio de CCK8 e expressa como percentagem dos valores de controlo. *

P

= 0,039, #

P

= 0,009,

P

= 0,027,%

P

= 0,010, teste ANOVA seguido do pós comparações de pares hoc. (B), imagens de contraste de fase de células * C13 tratadas com controlo de veículo (DMSO, com a mesma taxa de diluição como os medicamentos), cisplatina, ou a combinação de quercetina (20 uM, 80 uM) com cisplatina (80 uM). (C, D), apoptose celular dos diferentes grupos de tratamento foi detectados e analisados ​​utilizando citometria de fluxo. As experiências foram realizadas em triplicado (n = 3 por cada experiência). Grupo de Cisplatina combinado com quercetina VS. tratamento grupo de tratamento com cisplatina, **

P

= 0,033, ***

P

= 0,043, teste ANOVA seguido por comparações post hoc de pares.

Para mais quantificar os efeitos apoptóticos da quercetina e o tratamento com cisplatina, as células C13 * foram coradas com Anexina-V FITC e PI, e, subsequentemente analisadas por citometria de fluxo quanto a apoptose celular. diminuições óbvias em números de células apoptóticas foram detectadas por células tratadas com Cisplatina e 20 uM quercetina do que com cisplatina isoladamente (Fig. 1C, 1D). As proporções de células anexina V-manchadas foram maiores nas células tratadas com cisplatina do que os das células tratadas com um adicional de 20? M quercetina.

Para generalizar nossas conclusões, realizamos ensaios CCK8 em SKOV3, um comumente usado linha de células de cancro do ovário. Os resultados revelaram que baixas concentrações de quercetina reduziu os efeitos citotóxicos da cisplatina em células SKOV3 (Figura S3).

A quercetina atenuou os efeitos da terapia de diferentes drogas anti-neoplásicas em células de cancro do ovário

Para examinar se quercetina atenuar os efeitos anti-cancro de outras drogas anti-neoplásicas, que trataram células C13 * com três outras drogas anti-neoplásicas vulgarmente utilizados no tratamento do cancro do ovário, 5-FU, taxol, e pirarubicina. células C13 * foram tratados com uma série de doses crescentes de quercetina e fixo 5-FU (5 uM), Taxol (3 uM) e pirarubicina (3 nM) em concentrações aproximadas do IC50, respectivamente (Figura S1). Semelhante aos resultados obtidos com a cisplatina, o tratamento com estes medicamentos em combinação com quercetina resultou em mais a resistência das células do que o tratamento com drogas anti-neoplásicas sozinho (Fig. 2), na concentração de 20 uM, a quercetina mostrou efeitos anti-apoptóticos óbvias contra estes três medicamentos. A quercetina mostrou uma concentração específica de baixo efeito para as células cancerosas do ovário, tratadas com 5-FU (Fig. 2A) protegendo, semelhante aos resultados obtidos com a Cisplatina. Em combinação com o Taxol ou pirarubicina, no entanto, a quercetina mantido o efeito de promover células survial contra as drogas anti-cancro, mesmo em concentrações relativamente elevadas (80 uM, 100 uM) (Fig. 2B, 2C).

(A~C ), a viabilidade celular da quercetina em combinação com 5-FU, taxol e pirarubicina foi medida com o ensaio de CCK8 e expressa como percentagem dos valores de controlo. N = 3 por experimento. Grupo de Cisplatina combinado com quercetina 20 uM contra tratamento Grupo de tratamento com cisplatina, *

P

= 0,048, **

P

= 0,040, ***

P

= 0,032, teste t de Student.

a quercetina reduziu o dano oxidativo das células de cancro do ovário causados ​​pela cisplatina

Nós investigamos o mecanismo pelo qual quercetina atenuou os efeitos citotóxicos da cisplatina. Como relatado anteriormente [15], que muitos fármacos anti-neoplásicos, incluindo a cisplatina, conduzir a aumentos de ROS intracelular que contribuem para o seu efeito terapêutico. Nós questionaram se quercetina pode alterar a lesão ROS-associada causada por essas drogas. A expressão de 8-hidroxideoxiguanosina (8-OHdG), um marcador de estresse oxidativo ao DNA e da lesão de DNA mais frequentemente detectada e estudados [16], foi estimada pelo ensaio imunofluorimétrica. Também medimos o nível de prejuízo total de citotóxico pela detecção de γH2AX, um marcador comum de danos no DNA. Os resultados demonstraram que as intensidades de fluorescência de ambos γH2AX e 8-OHdG foram muito mais baixos no grupo de tratamento de 80 uM Cisplatina combinado com uma baixa concentração de quercetina (20 pM) do que o grupo de 80 uM cisplatina isolada. Contrariamente a isto, 80? M Cisplatina com elevada concentração (60 uM, 100 uM) de A quercetina aumentou a intensidade de fluorescência (Fig. 3A, 3B). Contagem de células positivas usando o software Image J. mostraram que o tratamento combinado com quercetina (20 uM) tinha uma diminuição mais evidente de 8-OHdG do que a de γH2AX, em comparação com o tratamento com cisplatina sozinha (36,40% e 19,33%, respectivamente) (Fig. 3B) . É indicado que a baixas concentrações de quercetina reduziu a lesão oxidativa de células de cancro do ovário causados ​​pela cisplatina.

(A), 8-OHdG e expressão H2AX em células * C13 tratados com quercetina em combinação com a cisplatina foi detectada por imunofluorescência ensaio. (B), o número de células coradas altamente positivos em cinco campos de alta potência aleatórios foram contadas por Image J e expressa como percentagem dos valores do grupo de cisplatina. Grupo de Cisplatina combinado com quercetina 20 uM contra tratamento Grupo de tratamento com cisplatina, N = 3 *

P

= 0,004, #

P

= 0,001, teste t de Student.

A quercetina reduzido nível de ROS de células de cancro do ovário em tratamento cisplatina

para determinar se quercetina reduziram a lesão ROS através da diminuição intracelular ROS, reativas de oxigênio Espécies Assay Kit foi utilizado para detectar intracelulares níveis de ROS de células C13 * em diferentes grupos de tratamento. Em comparação com as células tratadas com controlo de veículo ou cisplatina isoladamente, o tratamento com 20 uM quercetina vantagem adicional de uma redução nos níveis intracelulares de ROS (Fig. 4A, 4C). A análise quantitativa mostrou que a quercetina tratamento (20 M) deu uma óbvia redução no nível de ROS (valor médio 70,4) em comparação com o grupo controle (valor de 99.05 média) (

P Art 0,001). (Fig 4B, 4D ). De acordo com os resultados anteriores, a exposição a cisplatina causou células C13 câncer * ovarianos para acumular o ROS intracelulares, com um nível médio ROS de 123,5. No grupo de tratamento de cisplatina combinada com quercetina, este valor foi reduzido para 83,38 (Fig 4D.), Ainda menor do que o grupo de controlo de veículo (99.05) (

P Art 0,001). (Fig. 4B)

níveis intracelular ROS de células C13 * de diferentes grupos de tratamento foram detectados por reativas de oxigênio Espécies Assay citometria de fluxo. (A, B) Os níveis de ROS de células * C13 tratadas com controlo de veículo ou 20 uM quercetina durante 24 horas. (C, D) Os níveis de ROS de células C13 * tratados com 80 pM de cisplatina com ou sem 20 uM quercetina durante 24 horas. N = 3 *

P Art 0,001, #

P

. 0,001, teste t de Student

A quercetina aumentou a expressão de enzimas antioxidantes endógenos no cancro do ovário células

Os resultados acima indicam que a quercetina pode reduzir intracelular ROS de células de cancro do ovário, por isso, procurou determinar um mecanismo de acção. Os componentes antioxidantes mais importantes das células contra ROS são as enzimas antioxidantes endógenos, incluindo superóxido dismutase 1 (SOD1), endonuclease de L (EndoG), citocromo c (cito-C), a glutationa-peroxidase (GPx), catalase (CAT), e desacoplamento proteína 2 (UCP2). Medimos a expressão de enzimas antioxidantes endógenos por PCR em tempo real. Em comparação com as células tratadas com controlo de veículo ou cisplatina isoladamente, tratamento combinação de cisplatina com 20 uM quercetina conduzir a vários graus de aumento na expressão de SOD1, EndoG, cito-C, da GPx, CAT e UCP2 (Fig. 5A~F).

(A~F), expressão de enzimas antioxidantes das células C13 * foi detectado por PCR em tempo real. N = 3.

A quercetina promoveu o crescimento do cancro do ovário com o tratamento com cisplatina

in vivo

Nós usamos células C13 * para gerar tumores de xenoenxerto em atímicos nu BALB /c -nu ratos para determinar se quercetina poderia atenuar os efeitos da quimioterapia

in vivo

. Como esperado, o tratamento com cisplatina sozinha reduziu o crescimento do tumor em comparação com ratinhos tratados com veículo. O tratamento com o crescimento do tumor ligeiramente suprimido sozinho quercetina comparado com controlo de solução salina normal (volumes de tumor de 111,75 mm

3 e 120.51 mm

3, respectivamente) (P = 0,015). Os tumores dos ratinhos tratados com cisplatina em combinação com quercetina foram aproximadamente 1,8 vezes maior no dia 30 do que aqueles tratados com cisplatina sozinha (

P

0,001; Fig. 6A, 6B). Comparando-se os pesos médios dos tumores removidos dos ratos, verificou-se que os tumores tratados com a combinação de quercetina e Cisplatina (72,53 ± 7,33 mg) foram significativamente mais pesado do que o tratado com cisplatina isoladamente (41,47 ± 6,72 mg),

P

0,001 (Fig. 4D). Além disso, a combinação de cisplatina e quercetina tratamento exibido um cancro efeito promotor em comparação com o grupo de controlo, medido tanto no tamanho do tumor e no peso do tumor (Fig. 6C).

Os ratinhos foram injectados com NS, 20 /kg A quercetina, 4 mg /kg de cisplatina, ou quercetina mais cisplatina, ip. xenoenxertos de células C13 * (2 × 10

6) foram inoculados no flanco direito de ratinhos nus atímicos fêmeas nu /nu. Os volumes dos tumores foi determinada por um calibrador e calculada de acordo com a fórmula (largura2 x comprimento) /2. (A), a formação de tumores em ratinhos do grupo de tratamento com cisplatina e combinado com o grupo de quercetina. (B), o crescimento tumoral relativo médio tal como analisado pelo aumento nos volumes dos tumores para 8 ratos por grupo experimental ** cisplatina com quercetina VS. Cisplatina,

P Art 0,001; * VS. quercetina Controle,

P

= 0,015, teste ANOVA seguido por comparações post hoc de pares; (C), os pesos médios do tumor de cada grupo. #Cisplatin Combinado com quercetina VS. Cisplatina,

P Art 0,001, teste ANOVA seguido por comparações post hoc de pares; (D), a análise imuno-histoquímica de 8-OHdG e SOD1 em tumores de xenoenxerto removidos de ratinhos nus. (E) Os dados de quantificação das diferenças na expressão de SOD-1 e 8-OHdG, *: P 0,001, **:. P 0,001, teste ANOVA seguido por comparações post hoc de pares

a quercetina aumentou a expressão de endógena SOD1 enzima antioxidante de câncer de ovário células

in vivo

, e impediu danos ROS induzida

a fim de confirmar o efeito protetor contra o dano oxidativo por quercetina in vivo , ensaios imuno-histoquímicos foram realizados em tumores removidos do modelo de xenoenxerto de murganhos nus. 8-OHdG, um marcador de estresse oxidativo ao DNA, foi localizado principalmente no núcleo de células de cancro. Em tumores tratados com vehical ou quercetina sozinho, 8-OHdG coloração mostrou fraca intensidade com as pontuações de 0,4 e 0,6, respectivamente. No grupo tratado com cisplatina sozinha, quase todas as células cancerosas exibido extremamente forte coloração 8 OHdG com pontuação 2,8. Como esperado, os ratinhos do grupo tratado por cisplatina em combinação com quercetina tinha um nível muito mais baixo de 8-OHdG coloração (pontuação 1,6) em tumores do que as tratadas com cisplatina isoladamente (Fig. 6D-E).

ADN enzimas de reparação de impedir a acumulação de ADN danificado e antioxidantes protegem as células contra os radicais livres. Detectamos expressão SOD1, que é uma enzima antioxidante endógena crítico para tolerar o estresse oxidativo, para descobrir se quercetina afetada sobre a atividade da enzima antioxidante endógena. A expressão positiva da SOD1 foi principalmente um padrão de citoplasma em células de cancro do ovário em vez de células do estroma. O SOD1 enzima antioxidante foi altamente sobre-expressa em tumores tratados com quercetina ou cisplatina mais quercetina (pontuação 2.0 e 2.6, respectivamente) em comparação com tumores tratados com veículo ou cisplatina isoladamente (pontuação de 1,2 e 0,6, respectivamente) (Fig. 6D-E). Os resultados indicaram que a quercetina aumentaram a expressão da enzima SOD1 antioxidante endógena de células de cancro do ovário

in vivo

, e impediu danos ROS induzida.

Discussão

Como um composto flavonóide clássica , quercetina é geralmente recomendado para tomar por via oral todos os dias para os cuidados de saúde em geral e prevenção do câncer. Staedler

et ai., Achou que a quercetina, a concentrações de 5 uM e 10 uM pode aumentar a eficácia de 100 uM de doxorrubicina em células de cancro da mama in vitro [17], [18], enquanto que outros investigadores veio a conclusões diferentes [8], [9]. Samuel

et ai.

[8] relataram que, em células-rectal e cancro da próstata, os efeitos terapêuticos do fármaco em combinação com quercetina foram influenciados pelas doses eficazes e o estado de p53 das células (a combinação de 5- Fu com até 6 mM quercetina promovendo a sobrevivência cologenic em células nulas p53 enquanto 50 mM quercetina agiu papel oposto em células p53 tipo selvagem). Neste estudo, a quercetina, em concentrações elevadas, quer sozinhos ou combinados com cisplatina exibido efeitos anti-neoplásicas em células * C13 do cancro do ovário, enquanto a baixa concentração (5 ^ M-30 pM) de quercetina apareceu para antagonizar os efeitos citotóxicos de agentes anti-neoplásicos incluindo cisplatina, 5-FU, taxol, e pirarubicina. Nós também explorado o mecanismo do efeito anti-apoptótico de quercetina quando combinada com cisplatina.