Abstract

liberador de gonadotrofinas forte atenção hormona-I (GnRH-I) atraiu como uma ferramenta terapêutica hormonal, particularmente para pacientes com câncer de próstata andrógeno-dependentes. No entanto, o andrógeno-independência do câncer em estágios avançados tem estimulado os pesquisadores a procurar novos tratamentos médicos. Em relatórios anteriores, desenvolvemos o antagonista GnRH-II Trp-1 para inibir a proliferação e estimular a morte autofágica de várias células de câncer de próstata, incluindo células andrógeno-independente. Foram triados mais diversos antagonistas da GnRH-II para identificar moléculas com maior eficiência. Aqui, nós investigamos o efeito de SN09-2 sobre o crescimento de células de cancro da próstata PC3. SN09-2 reduzido o crescimento de células de cancro da próstata, mas não teve nenhum efeito sobre as células derivadas a partir de outros tecidos. Em comparação com Trp-um, o crescimento celular inibido SN09-2 conspicuamente cancro da próstata, mesmo em baixas concentrações. inibição de crescimento de células PC3-induzida SN09-2 foi associada com a diminuição potencial de membrana das mitocôndrias, onde o antagonista foi acumulado, e aumentou mitocondrial e espécies de oxigénio reactivas citosólicas. SN09-2 induzida lactato desidrogenase libertação para o meio e anexina V-coloração na superfície das células PC3, sugerindo que o antagonista estimulada morte celular do cancro da próstata através da activação de sinalização de vias apoptóticas. Além disso, o citocromo c das mitocôndrias de libertação para o citosol e a activação de caspase-3 ocorreu de um modo dependente da concentração e do tempo. SN09-2 também inibiu o crescimento de células PC3 xenotransplantadas em ratinhos nus. Estes resultados demonstram que SN09-2 induz directamente a disfunção mitocondrial e consequente geração de ROS, levando não só para a inibição do crescimento, mas também a apoptose de células cancerosas da próstata

Citation:. Parque S, Han JM, Cheon J, Hwang JI , Seong JY (2014) apoptose morte de células do cancro da próstata por um Hormônio Liberador de Gonadotropina-II antagonista. PLoS ONE 9 (6): e99723. doi: 10.1371 /journal.pone.0099723

editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 06 de fevereiro de 2014; Aceito: 18 de maio de 2014; Publicação: 13 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Park et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Programa Básico de Investigação (2013R1A2A2A01068295), da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF), financiado pelo Ministério da Ciência, TIC e Planejamento Futuro eo nacionais de I Programa D de Controle do Câncer, Ministério da Saúde Bem-estar (0520270-1). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o tumor maligno mais comum que ocorre no sistema reprodutor masculino. Embora a maioria dos cânceres de próstata são de crescimento lento, eles podem causar dor e dificuldade em urinar, e os mais agressivos são propensos a metástase para outras partes do corpo [1]. Globalmente, o câncer de próstata é a sexta maior causa de morte relacionada ao câncer em homens [2], e nos Estados Unidos, que está em segundo lugar [3]. Um tratamento comum para o cancro da próstata avançado, é a terapia hormonal combinada com a terapia de radiação [4]. O principal objetivo da terapia hormonal é remover ou diminuir andrógeno do soro, um potencial estimulante do crescimento do câncer de próstata. No entanto, em muitos casos, a regressão dos tumores inicial é seguido por re-crescimento independente de níveis de androgénio, o aumento da agressividade, e alta actividade metastática [5]. Por esta razão, o desenvolvimento de fármacos eficazes para o tratamento de cancro da próstata independente de androgénios é uma questão urgente.

o eixo hipotalâmico-pituitário-gonadal, gonadotropin-releasing hormone-I (GnRH-I) sintetizado no hipotálamo estimula a secreção das gonadotropinas da pituitária da hormona luteinizante (LH) e da hormona folículo-estimulante (FSH), que por sua vez modulam a síntese e secreção de androgénios, incluindo a testosterona, a partir de testículos [6]. A administração crónica de um agonista de GnRH-I conduzido para a regulação negativa do receptor da GnRH na glândula pituitária, resultando numa redução acentuada nos níveis circulantes de andrógenos [7]. antagonistas GnRH-I também reduziu os níveis séricos de andrógenos por inactivação do receptor GnRH [6], [8]. Estes resultados sugerem que as terapias hormonais que utilizam agonistas e antagonistas da GnRH-I, são aplicáveis ​​para o tratamento da hiperplasia benigna da próstata e cancros da próstata dependentes de androgénio. Além disso, estudos recentes demonstraram que a GnRH-I afecta directamente a ambas as células de cancro da próstata andrógeno-dependentes e independentes de androgénios. Agonistas de GnRH-I factor de crescimento epidérmico inibida ou a proliferação de células do cancro da próstata estimulada por factor de crescimento semelhante à insulina, e induzida a apoptose das células cancerosas em condições de privação de soro [9], [10]. Estes efeitos foram sugeridos para ser mediada pelo receptor de GnRH-I, que estimula a activação dependente de sinalização de G

i-ligada de proteínas relacionadas com a apoptose, incluindo c-Jun NH

cinase 2-terminal (JNK) [11 ]

na maioria dos vertebrados, o outro tipo de GnRH, GnRH-II chamado, é identificado, o qual é estruturalmente conservado na evolução dos peixes para os mamíferos [12] -. [14]. GnRH-II é expressa não apenas no cérebro, mas também em tecidos reprodutivos e imunes periféricas [15]. Este padrão de expressão mais amplo pode conferir uma variedade de funções fisiológicas no péptido. Semelhante a GnRH-I, GnRH-II é capaz de regular a reprodução nas fêmeas, estimulando a secreção de LH e FSH [16], [17]. Apesar de ambos os GnRHs agir em células da granulosa-lútea humanos, eles apresentam diferentes padrões de regulação hormonal [18], [19]. GnRH-II produzido pelas células T humanas estimula a expressão do receptor de laminina e a migração de células [20]. expressão do receptor de laminina Curiosamente, induzida por GnRH-II não é bloqueada pela GnRH-I antagonista de cetrorelix, o que implica que a GnRH-II não interage com o receptor de GnRH-I [20]. Recentemente, nós e outros grupos identificaram o receptor de GnRH-II em espécies não mamíferas. O receptor liga-se para a GnRH-II, com uma sensibilidade mais elevada do que a afinidade e a GnRH-I [21], [22]. Além disso, um receptor específico de GnRH-II foi clonado a partir de macaco e é denominado receptor de GnRH-II de mamífero [23]. O receptor é altamente selectivo para a GnRH-II e aparenta ser diferente do receptor de GnRH-I em termos de rápida internalização por interacção do ligando e das vias de sinalização. Em humanos, os genes do receptor do tipo da GnRH-II está localizada nos cromossomas 1 e 14. Embora o ARNm para estes genes são expressos em muitos tecidos, incluindo o cérebro e mesmo em muitas linhas de células, que parecem ser os pseudogenes não-funcionais devido a um codão de paragem prematuro [24], [25]. A ausência de um receptor acoplado a proteína G funcional para a GnRH-II em humanos indica a possibilidade de outros tipos de parceiros de ligação na membrana plasmática, enquanto que os seus mediadores funcionais permanecem ainda desconhecido.

Curiosamente, a GnRH-II apresenta o capacidade para inibir a proliferação de células de cancro do ovário, bem como células de cancro da próstata [26], [27]. GnRH-II é susceptível de funcionar em células de câncer de próstata, interagindo com proteínas desconhecidas, com base em nossa observação anterior que radiomarcados GnRH-II foi capaz de se ligar várias células cancerosas humanas da próstata [27]. Esta ligação foi deslocado por não marcado da GnRH-II, mas não pela GnRH-I. Esta constatação sugere que a GnRH-II pode ser uma droga potencial para o tratamento de cancros da próstata, apesar de ligação da GnRH-II para as células de cancro da próstata de elevada afinidade não parece ser devido à expressão de um receptor de GnRH-II convencional. Recentemente, desenvolveu-se um antagonista de GnRH-II romance, chamado trptorelix-1 (Trp-1). Trp-1 é capaz de induzir a morte de células andrógeno-dependentes e câncer de próstata independente de por mecanismos como disfunção mitocondrial seguido de espécies reactivas de oxigénio (ROS) e autofagia [28] subjacente.

Nós sintetizado GnRH adicional antagonistas -II para comparar com o efeito Trp-1 e melhora o efeito de morte. Aqui, nós apresentamos outro antagonista, SN09-2 que é capaz de inibir a proliferação e induzir a morte em células de cancro de próstata humanas, com uma eficiência mais elevada do que a de Trp-1. Além disso, os mecanismos funcionais da morte são forma diferente Trp-1, e envolvem a activação de vias apoptóticas.

Materiais e Métodos

análogos de GnRH-II e reagentes

o antagonista de GnRH-II, [Ac-D-Nal (2) -D-Phe (4Cl) -D-Pal (3) -Ser-Phe-D-Lys-Trp-Tyr-Arg-D-Ala-NH

2], designado como SN09-2, e a sua isotiocianato de fluoresceína (FITC) forma -conjugated foram sintetizados por AnyGen (Gawngju, Coreia). Trp-1 [Ac-D-Nal (2) -D-Phe (4Cl) -D-Pal (3) -Ser-Tyr-D-Cit-Trp-Tyr-Pro-D-Ala-NH

2 ] foi também sintetizado pela mesma empresa [28].

o potencial de membrana mitocondrial detector de 5,5 ‘, 6,6′-tetracloro-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodeto (JC- 1), MitoTracker, e 2 ‘, 7’-dichlorfluorescein-diacetato (DCF-dA) foram adquiridos a partir de Invitrogen (Palo Alto, CA, EUA). meios de cultura celular, incluindo o meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e Roswell Park Memorial Institute (RPMI) foram obtidos a partir de Welgene Inc. (Daegu, Coreia). soro fetal de bovino (FBS) e penicilina /estreptomicina foram de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Todos os reagentes, incluindo a Hoechst 33342, Anexina-V, H

2O soro bovino

2, e albumina foram obtidos de Sigma (St. Louis, MO) a menos que especificado de outra forma. Os anticorpos contra a caspase-3 clivada, intacta da caspase-3, e citocromo C foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danver, MA, EUA). anticorpos anti-p-actina foram da Sigma.

cultura celular

Todas as linhas celulares foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). PC3, linhas de células LNCaP, DU145, e DLD1 foram cultivadas em meio RPMI 1640 contendo 10% de FBS 100 unidades de penicilina, inactivado por calor, e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C e humidificada com 5% de CO

2. As células HeLa foram cultivadas em DMEM contendo FBS a 10%, nas mesmas condições.

ensaio de gene repórter

células CV-1 foram cultivadas durante a noite em placas de 24 poços e subsequentemente transfectadas com complexos de lipossoma contendo pGL3 /plasmídeos SRE-luc com rã de touro GnRHR-II (bfGnRHR-II) ou macaco verde GnRHR-II (gmGnRHR-II). Mais 48 h mais tarde, as células tratadas com GnRH-II (1 nM para bfGnRHR-II, 10 nM gmGnRHR-II) e diferentes concentrações de SN09-2 ou Trp-1 durante 6 h foram lavadas com PBS e solubilizado com tampão de lise. A actividade de luciferase dos extractos celulares foi determinada usando o sistema de ensaio de luciferase padrão de BioTek Instrument, Inc. (Winooski, VT). Para determinar a eficiência de transfecção, as actividades da luciferase foram normalizados com a actividade β-gal. Todos os dados são calculados a partir de pelo menos três experiências independentes, normalizadas para grupos não tratados.

A viabilidade celular ensaio

As células foram semeadas em placas de 12 poços em triplicado (1 × 10

4 células /bem). Após 24 h, as células foram tratadas com as concentrações indicadas de antagonistas de GnRH-II solubilizados em DMSO a 0,1% a cada 24 h durante o número de dias indicado. Em seguida, as células foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS), dissociadas com tripsina /EDTA, e re-suspendido em 500 ul de meio de crescimento completo. Trypan azul (0,4%), as células-exclusão de corante foram contadas sob um microscópio invertido (Olympus, Tóquio, Japão).

liberação de lactato desidrogenase ensaio

ensaio de lactato desidrogenase (LDH) A atividade foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha). Em resumo, as células PC3 foram semeadas em placas de 12 poços a 2 x 10

4 células /poço. No dia seguinte, as células foram tratadas com diferentes concentrações de SN09-2 em 5% de FBS contendo meio RPMI 1640 durante 3 dias. Os meios de cultura foram transferidas para tubos de Eppendorf e centrifugada durante 1 min a 5000 rpm. Cem microlitros de cada sobrenadante foi transferido para uma placa de 96 poços opticamente clara. Cem microlitros de mistura de reacção preparada de fresco foram adicionados a cada poço e incubou-se durante 30 min a 25 ° C. A absorvância das amostras foi medida usando o filtro de comprimento de onda de 490 nm do leitor de ELISA.

Anexina V ensaio de coloração

A apoptose de células PC3 foi avaliada utilizando um kit de detecção de apoptose (Koma Biotech, Seul, Coréia). Após a exposição ao SN09-2 durante os tempos indicados ou em diferentes concentrações, as células PC3 foram colhidas e lavadas com PBS frio e re-suspensas em tampão contendo isotiocianato de fluoresceína (FITC) de ligação -conjugated proteína anexina V e iodeto de propídio. Anexina V de ligação e coloração de PI foi determinada por análise de citometria de fluxo (Becton Dickinson, San José, CA, EUA). As células apoptóticas foram definidos como a PI-negativas e anexina V-positiva.

Após o tratamento com SN09-2, as células PC3 em lamelas de poli-D-lisina-revestidas foram fixadas com 4% de paraformaldeído durante 15 min, lavadas com PBS três vezes, e incubaram-se com Cy3-conjugado anexina V. As células foram lavadas com PBS e incubadas com pouco Heochst33342 (10 ug /ml). As células coradas foram visualizados sob um microscópio confocal LSM510 (Carl Zeiss, Jena, Alemanha).

análise Western blot

células (5 × 10

4) foram plaqueadas em placas de 100 mm . No dia seguinte, as células foram tratadas com as concentrações indicadas de SN09-2 para diferentes tempos, colhidas e incubadas com tampão contendo 10 mM de HEPES (pH 7,9), KCl 10 mM, DTT 0,5 mM, e um cocktail inibidor de protease (Roche) durante 30 min em gelo. As células foram desintegradas com um homogeneizador Dounce de 20 ciclos e centrifugou-se a 5.900 x

g

durante 10 minutos para recolher a fracção citosólica. Os peletes resultantes foram re-suspensos em tampão frio, brevemente sonicada três vezes, e centrifugou-se a 5.900 x

g

durante 10 min para se obter proteínas mitocondriais em bruto. As proteínas de cada fracção (20 ug) foram aplicados a electroforese em gel de poliacrilamida-SDS (gel a 12%) e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Millipore, Billerica, MA). As membranas foram bloqueadas com 3% de albumina de soro bovino e incubadas com os anticorpos apropriados. Após lavagem com solução salina tamponada com Tris contendo 0,05% de Tween 20, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano e os sinais foram detectados utilizando uma solução de quimioluminescência aumentada (GE Healthcare Life Science, Buckinghamshire, Reino Unido).

localização subcelular de SN09-2

Dois dias após o plaqueamento em poli-D-lisina-revestidas tampa desliza em placas de 12 poços, as células PC3 foram tratadas com 66 nM de MitoTracker durante 30 min e, em seguida, com 10 mM de FITC SN09-2 durante 10 min a 37 ° C. Após lavagem com PBS, as células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 min. Os núcleos foram corados com Hoechst 33342. sinais de fluorescência foram detectadas ao microscópio confocal.

A medição do potencial de membrana mitocondrial potencial

membrana mitocondrial foi medido utilizando JC-1. Em células saudáveis, JC-1 forma agregados dentro da mitocôndria, a geração de fluorescência vermelha. No entanto, durante a despolarização mitocondrial, JC-1 monómeros difundem por toda a célula, produzindo fluorescência verde. células PC3 foram semeadas sobre a cobertura com poli-D-lisina-revestidas desliza em placas de 12 poços. Após o tratamento com 10 uM SN09-2 durante 3 dias, as células foram incubadas com PBS contendo JC-1 (2,5 ug /ml) durante 20 min à temperatura ambiente. As células foram lavadas, fixadas com paraformaldeído a 4%, e observadas ao microscópio confocal. Após incubação com JC-1, as células PC3 foram descoladas a partir de prato e aplicado para a análise de células activadas por fluorescência (FACS).

Grânulos de conjugação e suspenso ensaio

Grânulos conjugação de SN09- 2 foi realizada como descrito no trabalho anterior [28]. Em breve, N-hydroxysunninimide-activado esferas de sepharose foram incubadas com SN09-2 em tampão de acoplamento durante a noite a 4 ° C, e, em seguida, lavada com um tampão contendo Tris-HCl 0,1 M (pH 8,5) e um tampão contendo acetato 0,1 M (pH 4,5) e 0,5 M de NaCl. fracção de membrana de células PC3 foi isolado por meio de homogeneização e centrifugação. As peletes resultantes foram dissolvidos em tampão de lise contendo 1% de Triton X-100 e centrifugou-se a 20000 ×

g

durante 15 min a 4 ° C. Os sobrenadantes foram incubados com conjugado SN09-2-sefarose e lavados com tamp de lise. Os precipitados foram incubadas com 50 mM SN09-2 e os sobrenadantes foram aplicados por SDS-PAGE e Western blot com anticorpos anti-GPR75.

geração intracelular ROS

espécies reativas de oxigênio (ROS) foram medido utilizando DCF-DA. células PC3 (1 × 10

5) foram plaqueadas em placas de 60 mm, cultivados em meio RPMI 5% de FBS, e tratou-se com SN09-2 durante 3 h. Após a incubação com 5 uM DCF-DA, durante 30 min a 37 ° C no escuro, as células foram lavadas, re-suspensas em PBS, e, em seguida, aplicado à análise de FACS.

A imunocitoquímica

PC3 células (4 × 10

4) foram plaqueadas em lamelas em placas de 12 poços e trata-se com 10 uM SN09-2 durante 12 h. As células foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante 10 min, permeabilizadas com 0,2% de Triton X em PBS, lavadas e bloqueadas com BSA a 3% em PBS durante 30 min. Os anticorpos policlonais de coelho contra a caspase-3 clivada (1:200) e anticorpos anti-p-actina de rato monoclonal (1:1000) foram aplicados às células. Caspase-3 activa e β-actina foram visualizados por incubação com ambas Alexa 594-conjugado anti-ratinho e Alexa 488-conjugado anti-coelho de anticorpos secundários durante 1 h. Em seguida, as células foram coradas com Hoechst 33342 (1 ug /ml) durante 5 min, montadas em lâminas, e observadas ao microscópio confocal.

In vivo

crescimento de células cancerosas da próstata

de seis semanas de idade, ratinhos nus atímicos macho (BALB /c-nu) foram obtidos de Harlan (Houston, TX). Os ratos foram alojados em condições específicas livres de patógenos em um sistema de encarceramento ventilado individualmente. Todos os procedimentos experimentais foram realizados após receber a aprovação do Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do Instituto de Pesquisa Clínica no Hospital da Universidade Nacional de Seul. células PC3 (6 × 10

6) foram injectadas no flanco direito dos ratos. Dez dias após a injeção de células, tumores com volumes de cerca de 20-25 mm

3 desenvolvida na maioria dos ratos; Os volumes dos tumores foram medidos todos os dias. Os volumes dos tumores foram determinados por duas dimensões perpendiculares [comprimento (

G

) e a largura (

W

)] e a altura (

H

), medida utilizando compassos de calibre de Vernier (a fórmula é

V

= (π /6) x (

W

×

L

×

H). A partir deste momento, SN09-2 ( forma de ácido acético) dissolvido em 5% de N, N-dimetilacetamida (DMA), 10% glicerol, e 85% de água destilada que é solvente biocompatível foram injectados subcutaneamente em ratinhos durante 25 dias consecutivos. o tamanho do tumor em cada ratinho foi medida a cada dia. Seis a sete ratos foram usados ​​para cada grupo experimental.

a análise estatística

Os dados foram analisados ​​usando o software PRISM4 (GraphPad). médias dos grupos foram comparados por meio de Student

t

teste ou one-way ANOVA seguido por comparações múltiplas de Bonferroni A

P-

valor .. 0,05 foi aceito como significante

resultados

SN09-2 induz células de câncer de próstata espec�ico morte

Nós relatado anteriormente que um novo antagonista GnRH-II Trp-1 morte celular induzida por câncer de próstata [28]. Para identificar molécula mais eficaz, sintetizamos 65 análogos com base na estrutura Trp-1 e rastreados suas actividades de morte em PC3 e LNCaP sem qualquer actividade tóxica em fibroblastos de pulmão MRC-5. Finalmente, SN09-2 foi escolhido como antagonista potencialmente eficaz de GnRH-II para inibir o crescimento de células de cancro da próstata. Em repórter anterior, identificaram-Trp-1 tem uma actividade antagonista sobre os GnRHR-II [28]. O nosso ensaio de gene repórter presente revela que SN09-2 também tem uma actividade antagonista potente no GnRHR-II mesmo em comparação com Trp-1 (Fig. 1). SN09-2 eficiente antagonizou o efeito da GnRH-II em sapo de touro GnRHR-II (IC

50 = 0,01 M) e macaco verde GnRHR-II (IC

50 = 1,9 mM). No entanto, Trp-1 ativação inibido de apenas rã de touro GnRHR-II com elevada potência (IC

50 = 0,25 M). As sequências da GnRH-II, Trp-1 e SN09-2 foram descritos na Fig. 2A. células PC3 (células de cancro de próstata independente de androgénios) foram tratadas com 10? M SN09-2 em meio de cultura contendo concentrações diferentes de FBS. Em concentrações séricas baixas (menos de 2%) SN09-2 induzida a inibição do crescimento superior a 95% de células PC3 dentro de 4 dias. E, mesmo em concentrações de soro mais elevados, o crescimento de células SN09-2 drasticamente inibida em mais de 85%, embora a inibição foi ligeiramente afectadas pela concentração no soro (Fig. 2B). O tratamento com SN09-2 durante 4 dias induzida a inibição do crescimento de 91% e 88% de células em condições de soro PC3 5% e 10%, respectivamente. Este resultado indica que SN09-2 regula negativamente o crescimento de células de cancro da próstata de um modo independente de soro. Em seguida, várias células de cancro foram tratadas com 10? M SN09-2 em meios contendo 5% de soro para determinar o efeito específico de células do cancro da próstata do antagonista de GnRH-II. Três dias após o tratamento com SN09-2, o crescimento de PC3 e células LNCaP foi drasticamente regulada negativamente, e que de células DU145 foi também inibida por ≈50%, sugerindo que a sensibilidade das células de cancro da próstata para SN09-2 podem ser diferentes. No entanto, o crescimento das células a partir de outros tecidos, tais como células HeLa (cancro do colo do útero) e DLD1 (cancro do cólon) não foi afectada pela SN09-2 (Fig. 2C). Embora mais células devem ser testadas, estes resultados podem indicar SN09-2 tem efeito inibidor do crescimento específico das células do cancro da próstata.

De qualquer bfGnRHR-II ou gmGnRHR-II foi transfectada com o repórter SRE-luc em células CV-1 . As células foram tratadas com os antagonistas de diferentes concentrações na presença de GnRH-II (1 nM para bfGnRHR-II, 10 nM gmGnRHR-II).

(A) Molecular sequências da GnRH-II, células PC3 TRP-1, e SN09-2 (B) foram incubadas em meio RPMI contendo várias concentrações de FBS e expostas a 10? M SN09-2 durante 4 dias. O número de células viáveis ​​foi contado sob um microscópio de luz. (C) PC3, células DU145, LNCaP, HeLa, e DLD1 foram incubadas com 5% de meio FBS contendo 10 mM SN09-2 ou DMSO durante 3 dias. (D) As células PC3 foram tratadas com diferentes concentrações do TRP-1 ou SN09-2 durante 3 dias, e, em seguida, as células viáveis ​​foram contadas sob um microscópio de luz. O número de células de cada grupo foi comparado com o grupo tratado com DMSO. CTL: tratado com DMSO. células PC3 (E) foram tratados com várias concentrações de SN09-2 durante 3 dias. Usando sobrenadantes da cultura a partir de cada grupo, a actividade da LDH foi determinada como descrito em Materiais e Métodos. Os dados são médias ± E.P. *,

p

0,05; **,

p .

0,01, versus controle

Em um relatório anterior, nós demonstramos que Trp-1 inibiu a proliferação de células PC3 [28]. Para investigar a eficácia de inibição de crescimento dos antagonistas da GnRH-II, foram adicionados às células PC3-los em cultura em condições de soro a 5% durante 3 dias. Em comparação com os grupos de controlo, ambos os antagonistas atenuou significativamente o crescimento celular de um modo dependente da dose. Além disso, em todos os grupos tratados com diferentes concentrações, o crescimento celular foi mais potentemente inibida por SN09-2 em vez de Trp-1, sugerindo que SN09-2 é provável que seja melhor para a molécula de desenvolvimento como um inibidor de cancro da próstata (Fig. 2D). O efeito inibitório sobre o crescimento celular pode ser correlacionada com a morte celular. Para confirmar a ideia, foi medida a actividade de LDH a partir de meios de cultura de células tratadas com diferentes doses de SN09-2. Como mostrado na Fig. 1E, a actividade foi aumentada em todas as células tratadas com SN09-2. Este resultado sugere que SN09-2 é capaz de estimular células de cancro da próstata para a morte, mesmo em pequenas quantidades. Mesmo que uma dose elevada de SN09-2 aumentou ligeiramente a actividade da LDH, a actividade não foi correlacionada com a dose do agonista, o que implica que este ensaio parece ser demasiado sensíveis para distinguir a actividade dependente da dose na morte celular.

acumulação mitocondrial de SN09-2

Em relatórios anteriores, nós e outros grupos observaram que as células cancerosas GnRH-II ligado a próstata radiomarcados através da interação com uma proteína de aproximadamente 80-kDa cuja identidade foi designada como proteína regulada por glucose 75 (Grp75), com base em espectrometria de massa com ionização por electrospray cromatografia de líquido-em tandem [11], [28], [29]. Curiosamente, o nosso ensaio suspenso também mostrou que SN09-2 directamente interagiu com Grp75 (Fig. 3A). Desde Grp75 é predominantemente encontrado na mitocôndria, o destino final do SN09-2 pode não ser a superfície da célula. Para explorar a localização subcelular do antagonista, que marcado com FITC SN09-2 e adicionou-lo às células PC3, a uma concentração de 1 uM, durante 10 min. O sinal de FITC-SN09-2 não foi visto na membrana plasmática mas em torno do núcleo. Quando tratados com MitoTracker corante, o sinal de FITC sobreposto com o do corante, indicando que FITC-SN09-2 pode acumular nas mitocôndrias (Fig. 3B). FITC-SN09-2 era dificilmente detectáveis ​​noutras linhas celulares tais como HeLa, MCF7, e DLD1 (dados não mostrados). acumulação mitocondrial do presente conjugado é bastante semelhante ao do FITC-conjugado a GnRH-II e Trp-1, que foram atenuadas por não marcado da GnRH-II. Este resultado implica que uma via de endocitose desconhecido para a GnRH-II e os seus antagonistas podem existir em células de cancro da próstata.

As células foram incubadas com conjugado com FITC e SN09-2 MitoTracker. Após lavagem, as células foram brevemente marcado com Hoechst33342 (para a coloração de núcleo). As imagens foram tiradas sob um microscópio confocal. Vermelho: MitoTracker, Verde: FITC-SN09-2, Azul: Hoechst33342

dano mitocondrial e indução ROS em células

A disfunção mitocondrial tratados SN09-2 é pensado para ser relacionado diretamente a morte celular [30]. direccionamento mitocondrial de SN09-2 pode ser relacionada com o efeito de morte em células de cancro da próstata através da disfunção do organelo. Investigou-se a variação do potencial eléctrico da membrana mitocondrial, o que indica a função mitocondrial. Como mostrado na Fig. 4A, o tratamento de 3 dias com células PC3 com SN09-2 redução na intensidade de fluorescência vermelha em torno do núcleo, mas o aumento da fluorescência amarela e verde por mais de 80% no citoplasma, indicando uma diminuição no potencial de membrana mitocondrial (Fig. 4B). Em muitos casos, a disfunção mitocondrial é um pré-requisito para a geração de ROS citoplasmática. Quando as células PC3 foram tratadas com 5 uM SN09-2, níveis citoplasmáticos ROS, medido através da fluorescência da fluoroprobe DCF-DA, foram aumentados (Fig. 4C). Embora a média geométrica da fluorescência era muito mais baixa do que a observada em H

2O

2-células tratadas, o valor pode ser suficiente para indicar a alteração da função mitocondrial (Fig. 4D). Além disso, o aumento dos níveis de ROS SN09-2 citoplasmáticos de um modo dependente da dose (Fig. 4E).

(A) após o tratamento com 10 uM SN09-2 durante 3 dias, as células PC3 em lamelas foram incubadas com JC-1, fixadas com paraformaldeído a 4%, coradas com brevemente Hoechst33342, e observadas ao microscópio confocal. células PC3 tratadas com SN09-2 (B) foram destacadas do prato e aplicado à análise de FACS para examinar a mudança de cor de fluorescência. células (C) tratados com PC3 SN09-2 durante 3 horas foram incubadas com DCF-DA, e aplicado à análise de FACS (D) Controlo positivo de ROS intracelular. células PC3 foram tratadas com H

2O

2 durante 5 min, marcado com DCF-DA, e, em seguida, aplicado à análise de FACS. (E) meios geométricos de sinais de fluorescência em células PC3 tratadas com diferentes concentrações de SN09-2 estão apresentados na forma de gráficos. Os dados são médias ± E.P. **,

p .

0,01, versus controle

SN09-2 induz a morte celular através da ativação de vias de sinalização apoptótica

A disfunção mitocondrial e consequente ROS geração pode preceder a apoptose, um tipo de morte celular. Para determinar os mecanismos de morte celular subjacente estimulada por SN09-2, nós coradas células PC3 com anexina V conjugada com Cy3, que se liga especificamente a membrana fosfatidilserina. células PC3 tratadas com 10? M SN09-2 durante 24 h foram extensivamente coradas com Anexina V-Cy3, sugerindo que as células sofrem alterações apoptóticas (Fig. 5A). Quando as células foram aplicadas a análise de FACS após coloração com conjugado com FITC anexina V e iodeto de propídio, a maioria das células foram positivas com FITC mas a PI-negativas, o que implica que SN09-2 estimulada morte apoptótica mas não morte necrótica. Anexina V coloração foi dramaticamente melhorada por 9 h após 10 de tratamento? M SN09-2 e sustentada até 24 h (Fig. 5B). Sob as baixas concentrações de SN09-2, algumas células foram FITC-positivos, enquanto que a maioria das células tratadas com concentrações elevadas (mais do que 5 uM) foram FITC-positivos, sugerindo que SN09-2 é um indutor eficaz para a apoptose de células de cancro da próstata (Fig. 5C). Juntamente com o resultado de proliferação, a coloração rara das células tratadas com menos do que 0,5 uM SN09-2 demonstra que uma dose baixa do antagonista inibe o crescimento celular em vez de estimular morte celular.

células PC3 (A) tratada com 10 uM SN09-2 em lamelas foram incubadas com Cy3-conjugado anexina V, e brevemente corado com Hoechst33342. imagens de fluorescência foram tomadas sob um microscópio de fluorescência. BF: a morfologia das células ao microscópio de luz (B, C) células de anexina V-positivos foram aumentados em uma dose e dependente do tempo Manner (B) células PC3 tratadas com SN09-2 foram colhidas em diferentes pontos de tempo, incubado com FITC-conjugado anexina V, e aplicado à análise de FACS (C) células PC3 foram tratadas com diferentes concentrações de SN09-2 durante 12 h antes da coloração de anexina V. Os dados são médias ± E.P. *,

p

0,05; **,

p .

0,01, versus controle

A libertação de citocromo c das mitocôndrias é um evento precoce durante a morte celular dependente de caspase. Após a libertação de citocromo c para dentro do citoplasma, que se liga de protease apoptótica factor de activação-1 e pro-caspase-9 para formar o apoptossomo, que subsequentemente activa a caspase-3 e -7 responsáveis ​​pela destruição das células [31]. A análise por Western blot revelou que SN09-2 estimula a libertação de citocromo c para o citoplasma de uma forma tempo e dose-dependente. A maior parte do citocromo C foi libertado de mitocôndrias em células tratadas com 5 uM mais de SN09-2 (Fig. 6A, C), e saturação citosólico da proteína foi realizada por 24 h após o tratamento (Fig. 6B, D).

(a-D) de Western blotting de citocromo c na citosólica e fracções mitocondriais (a, C), as células PC3 foram tratadas com diferentes concentrações de SN09-2 durante 24 h e fraccionado em citossol e mitocôndria. 20? G de lisados ​​a partir de cada fracção foram usadas para SDS-PAGE e Western blotting com anticorpos anti-citocromo c. (B, D) As células tratadas com 10 pM SN09-2 foram colhidas em diferentes pontos de tempo, e, em seguida, fraccionado. (C, D) A intensidade de sinal de cada mancha foi medido e mostrado na forma de gráficos (E) células PC3 tratadas com 10? M SN09-2 foram colhidas em diferentes pontos de tempo, e utilizado para Western blotting com anti-caspase-3 clivada ou um