Sumário

Os macrófagos são células com muitas funções importantes em ambas as respostas imune inata e adaptativa e foi demonstrado desempenhar um papel complexo na a progressão do tumor, uma vez que ambas as actividades de porto de tumor impedindo (macrófagos M1) e promovendo tumor (macrófagos M2). Em muitos cancros humanos, macrófagos que se infiltram têm sido associadas a um prognóstico pobre paciente, e, por conseguinte, sugeriu-se principalmente de um fenótipo M2. No entanto, nós e outros já anteriormente demonstrado que o aumento da densidade de macrófagos no cancro colorectal (CRC) em vez está correlacionada com um prognóstico melhorado. É uma questão intrigante se os diferentes papéis desempenhados pelos macrófagos em vários tipos de câncer poderiam ser explicadas por variações no equilíbrio entre M1 e M2 atributos de macrófagos, impulsionado pelo tumor ou órgão-específicas fatores no microambiente do tumor de cânceres individuais. Aqui, utilizamos um

in vitro sistema de cultura celular

de diferenciação de macrófagos para comparar diferenças e semelhanças no fenótipo (morfologia, antígeno-apresentação, migração, endocitose, e expressão de genes de citocinas e quimiocinas) entre M1 /​​M2 e tumorais activado macrófagos (MAT), que poderia explicar o papel positivo dos macrófagos no CRC. Descobrimos que os factores segregados a partir de células de CRC induzida TAM de um fenótipo “misto” M1 /​​M2, que por sua vez podem contribuir para uma “boa resposta inflamatória”. Isto sugere que a reeducação dos macrófagos pode permitir importantes avanços terapêuticos no tratamento do câncer humano

Citation:. Edin S, Wikberg ML, Rutegård J, Oldenborg PA, Palmqvist R (2013) fenotípica a distorção dos macrófagos

In Vitro

por fatores secretados a partir de células de cancro colorrectal. PLoS ONE 8 (9): e74982. doi: 10.1371 /journal.pone.0074982

Autor: Antonio Moschetta, Universidade de Bari Consorzio Mario Negri Sud, Itália |

Recebido: 12 Março, 2013; Aceito: 13 de agosto de 2013; Publicação: 18 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Edin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da Sociedade sueca de Câncer (www.cancerfonden.se) (Grant não CAN 2011/839, Palmqvist.); Swedish Research Council (Grant não B03488901, Palmqvist.) (Www.vr.se); Cutting-Edge Research Grant do Conselho do Condado de Västerbotten, Suécia (Grant não VLL-132981, Palmqvist.); Fundação Cancer Research no norte da Suécia (Grant não AMP 10-655, Edin.) (Www.cancerforskningsfonden.se); e Tore Nilssons Foundation (Edin) (www.torenilssonsstiftelse.nu). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O microambiente do tumor desempenha vários papéis complexos e importantes na progressão tumoral [1]. Durante a última década, um foco principal na pesquisa do câncer tem sido sobre a importância do microambiente do tumor inflamatório, que posteriormente levou à inclusão da inflamação-promoção do tumor e evasão imune como marcas emergentes de câncer [2]. Uma maior compreensão da contextura imunológico – ou seja, a localização, densidade e orientação funcional das células do sistema imunológico, e como isso afeta a progressão do tumor pode fornecer ferramentas importantes para a predição de prognóstico do paciente, bem como o desenvolvimento de novas estratégias de tratamento [3]

o trabalho sobre a inflamação no cancro humano resultou na identificação de componentes do sistema imunitário que podem ser tanto benéfica e prejudicial para o prognóstico do paciente. Um tal componente é o de macrófagos do sistema imune inato. Os macrófagos são mostrados para ser altamente células de plástico que pode mostrar tanto a prevenção do tumor (macrófagos M1) e funções de promotores de tumor (macrófagos M2) avaliação em [4], [5]. Em resumo, os macrófagos activados M1 classicamente suportar a resposta imunitária adaptativa e alvejar agentes infecciosos e células danificadas ou alterados. Eles caracterizam-se por um aumento da expressão de moléculas de apresentação de antigénio (por exemplo, MHC de classe II), os receptores co-estimulantes para linfócitos (por exemplo, CD86 e CD40), bem como um número de citocinas pro-inflamatórias (por exemplo, IL6, IL12, IL23 e TNF), e são relatados para ter microbicida e da actividade tumoricida. Alternativamente macrófagos M2 ativados estão envolvidos na cicatrização de feridas e nas manutenções da homeostase do tecido e faxina e expressar altos níveis de receptores de reconhecimento de padrões (por exemplo, manose receptor (RM) e receptores de varredura (por exemplo, CD163). No entanto, muitas das funções dos macrófagos M2 pode, de facto, ser pro-tumorigénico uma vez que estimulam a proliferação celular, remodelação de tecidos, angiogénese e o desenvolvimento de um ambiente imunossupressor por secreção de citocinas imuno-supressora (por exemplo, IL-10 e TGF-p), que podem ser utilizados por um tumor em crescimento para invadir torno tecido e se espalhou para órgãos distantes [6]. M1 e M2 macrófagos têm perfis de quimiocina distintas, conduzindo ao recrutamento selectivo de células imunitárias, por exemplo, diferentes subconjuntos de linfócitos-T. Enquanto os macrófagos M1 principalmente expressar CXCL9 e CXCL10 que recrutar linfócitos do T auxiliares de tipo 1 (Th1) e citotóxicas (Tc) subconjuntos, macrófagos M2 em vez recrutam principalmente linfócitos de um fenótipo de regulamentação (Treg) e T helper (Th2) subconjuntos de secreção de quimiocinas CCL17, CCL22 e CCL24 [4], [5 ], [7]. Macrófagos também podem ser diferenciados em vários estados funcionais M2-like, que foram evidenciados tanto

in vitro

e

in vivo

, revisados ​​em [4]. Na realidade, as variações de macrófagos com várias características M1 ou M2 parecem não ter fim. M1 e ​​M2 fenótipos macrófagos deve, portanto, ser encarado estados funcionais como extremos em um espectro de phentoypes macrófagos [8]. No entanto, a classificação M1 e M2 pode ainda ser usado para identificar o fenótipo principal e as funções dos diferentes populações de macrófagos. O fenótipo de macrófagos é controlado pelos acontecimentos no microambiente do tumor em que é encontrado. Exemplos de eventos de polarização de macrófagos são a secreção de mediadores derivadas de tumor hipóxico, ou factores de necrose e danos nos tecidos [9]. O fenótipo de macrófagos também é influenciada por outras células do sistema imunológico e componentes do estroma.

Nos cancros humanos, a infiltração de macrófagos tem sido muitas vezes correlacionada com um prognóstico pior e, portanto, macrófagos associados a tumores têm sido sugeridos para ser principalmente de um fenótipo M2 [10] – [12]. No entanto, este não é o caso em todos os cancros. No cancro colorrectal (CRC), e que outros mostraram que um elevado número de macrófagos associados a tumores são correlacionados com um melhor prognóstico [13] – [17]. Estudamos ainda mais a distribuição de M1 e M2 fenótipos de macrófagos no CRC. Descobrimos que o número de macrófagos M1 e M2 foram altamente correlacionados. Os pacientes com um número elevado de infiltração de macrófagos M1, também teve um elevado número de infiltração de macrófagos M2 e um prognóstico significativamente melhor [18]. Considerando a elevada plasticidade de macrófagos, uma possível explicação para a população mista de M1 e M2 macrófagos visto no CRC pode ser que os factores tumorais secretada em CRC tem o potencial para provocar ou manter características de macrófagos M1, ou que não está a conduzir M2 macrófagos diferenciação para a mesma extensão como em outros tipos de cancro, onde a infiltração de macrófago é claramente prejudicial para o prognóstico do paciente.

Aqui temos usado uma

sistema in vitro de cultura de células

para comparar o fenótipo (e funções) de tumorais activado macrófagos (TAMs) no CRC para que os fenótipos de macrófagos M1 e M2 estabelecidas para obter uma melhor compreensão de como o fenótipo de macrófagos é afetada por fatores tumorais segregada e como isso pode afetar o resultado do paciente. Descobrimos que os factores segregados a partir de células de CRC não induziu uma resposta completa macrófagos M1 ou M2, mas em vez de um fenótipo TAM M1 /​​M2 “mista”. Além disso, apesar de macrófagos M1 e M2 foram encontrados para ser facilmente re-edjucated na direcção oposta, factores segregados a partir de células de CRC não foram capazes de enviesar já presentes macrófagos M1 M2 no sentido de macrófagos, mas em vez disso surgiram para reforçar o fenótipo M1. Juntos, isso pode contribuir para a criação de uma “boa resposta inflamatória”, onde as funções de tumor-supressora de macrófagos estão dominando.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Os monócitos humanos foram obtido a partir de crostas inflamatórias de dadores de sangue saudáveis ​​anónimos que tinha dado o seu consentimento informado por escrito (de acordo com as directrizes locais no centro de sangue do Hospital Universitário Umeå). De acordo com o comitê de ética em pesquisa local (Ethical Review Board Regional em Umeå, Suécia) aprovação ética não seja exigida para estudar leucócitos isolados de buffy coat obtido a partir de doadores de sangue anônimos (DNR 2012-327-31M).

celular cultura

As linhas celulares de CRC RKO, SW480 e Caco2 (ATCC) foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) em 37 ° C com dióxido de carbono a 5%. O meio condicionado a partir de linhas celulares de CRC foi preparado por células em tampão fosfato salino (PBS) de lavar roupa, após o que as células foram cultivadas a cerca de 90% de confluência em meio RPMI suplementado com 10% FBS e antibióticos, durante 48 horas. O meio condicionado foi recolhido, centrifugado a 3000 rpm durante 30 minutos e armazenado no congelador a -80 ° C até à sua utilização. As células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) foram purificadas a partir de dadores de sangue de crostas inflamatórias através de Dextrano de sedimentação e centrifugação em gradiente de Fiqoll-Paque. Os monócitos foram ainda purificados a partir das PBMC quer por 1,5 horas de adesão, seguido de 2 lavagens em PBS morno, suplementado com FBS a 5%, ou por célula magnética-activado triagem (MACS) de acordo com as instruções do fabricante (Miltenyi Biotec), resultando numa população de monócitos de cerca de 95% de pureza. monócitos purificados foram cultivadas em RPMI com 10% de FBS e antibióticos suplementadas com 20 ng /ml de FEC-M, com o meio trocado cada dois dias. No dia 6, os monócitos foram ainda estimuladas durante 40 h com a adição de LPS a 100 ng /ml e 20 ng /ml de IFN-y (para macrófagos M1), ou 20 ng /ml de IL4 ou IL10 (por macrófagos M2). Para tumorais activadas subconjuntos de macrófagos, monócitos foram no dia 6 incubadas em meio condicionado de tumor suplementadas com 20 ng /mL de M-CSF durante 40 h. As células foram colhidas e submetidas a análises posteriores. Os fenótipos de macrófagos diferenciados foram avaliados para cada buffy coat por análises de citometria de fluxo da expressão de marcadores M1 e M2 típicos. A morte celular (apoptose /necrose) foi controlada com citometria de fluxo utilizando anexina V /coloração de PI (Abcam) como recomendado pelo fabricante. O EtOH foi adicionado a uma concentração de 5% por 30 minutos como um controlo positivo para a morte celular.

Para a investigação morfológica 8 × 10

6 células mononucleares purificadas por poço foram semeadas em placas de cultura de 6 poços, adicionalmente purificado por meio de adesão, e diferenciadas em diferentes populações de macrófagos, como descrito acima. fotografia ao vivo foi tirada com uma DeltaPix Invenio 3S montado em um microscópio Leitz Diavert.

Análise de citometria de fluxo

expressão do marcador de superfície foi analisada por citometria de fluxo (BD FACS Calibur Citómetro de fluxo) com R-ficoeritrina (R-PE) -conjugated anticorpo monoclonal contra CD14 (clone M5E2, BD Pharmingen) e CD1a (HI149 clone, ImmunoTools); isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated anticorpo monoclonal contra CD86 (clone FUN-1, BD Pharmingen), HLA-DR (clone MEM12, Abcam), e CD40 (clone 5C3, BD Pharmingen); Aloficocianina (APC) -conjugated anticorpo monoclonal contra o receptor de manose (MR) (clone 15-2, BioLegend) e CD163 (clone 215927, R D Systems). controlos de isotipo foram incluídos em todas as experiências. Antes de coloração, receptores Fc foram bloqueadas com 5% humano TruStain FCX ​​™ (BioLegend). Os dados foram analisados ​​com o software Pro CellQuest (Árvore Star) após gating sobre a população de macrófagos in /janela SSC FSC.

Endocytosis

FITC-dextrano (Sigma-Aldrich) internalização foi usado para monitorar a endocitose por populações de macrófagos. Os monócitos foram submetidos a purificação MACS e diferenciadas durante 6 dias em meio RPMI suplementado com 10% FBS e 20 ng /ml de M-CSF. No dia 6, os macrófagos foram recolhidas e os números de células foram ajustadas a 5 x 10

5 células em 1 ml de meio RPMI e semeadas numa placa de 24 poços. Os macrófagos foram ainda mais diferenciado em diferentes subtipos de macrófagos, como descrito acima. Após 40 horas de estimulação, as células foram pré-incubadas em gelo durante 30 minutos e depois incubadas com 20 ug /ml de FITC-dextrano durante 90 min a 37 ° C ou a 4 ° C para detectar ligação à superfície celular. As células foram lavadas três vezes com 1 ml de PBS com 5% de FBS e intensidades de fluorescência média (IFM) foi determinada por citometria de fluxo.

Migração de Células

experiências câmara de Boyden foram realizadas para analisar como a migração de macrófagos diferenciados foi influenciada pelo meio condicionado a partir de células de CRC. 75 000 macrófagos de fenótipos diferentes, conforme indicado, foram colocados em uma inserção de cultura de células de 24 poços (tamanho de poro de 8 um; BD Biosciences) em 500 ul de meio de cultura RPMI com 10% de FBS e deixadas a aderir durante 3 horas. A seguir, as inserções de cultura foram colocadas em meio condicionado a partir de RKO, SW480 ou células ou meio de cultura celular RPMI contendo 10% de FBS e incubadas por 24 h Caco2 CRC. Após lavagem em PBS, as pastilhas foram colocadas em metanol arrefecido em gelo durante 1 minuto e novamente lavadas em PBS. As células aderentes ao interior do inserto foram raspadas com uma mecha de algodão, e as células no lado de fora foram coradas com 0,5% azul de Coomassie. Após lavagens em PBS, o filtro foi cortado e as células foram contadas três campos seleccionados aleatoriamente e apresentadas como número médio de migração de células /campo.

Matriz de citocinas e quimiocinas PCR

A expressão do gene os perfis das diferentes populações de macrófagos foram estudados com o citocinas Matriz quimiocinas PCR (HAP-150A, SABiosciences) de acordo com as recomendações do fabricante. Resumidamente, o ARN total foi isolado a partir de diferentes populações de células usando o kit NucleoSpin® ARN II (Macherey-Nagel). 1 ug de ARN total foi tratado com DNase e o ADNc foi preparado utilizando RT

2 First Strand kit. Para cada análise, as amostras de cDNA foram misturados com RT

2 qPCR Master Mix e distribuído por toda a matriz de PCR placas de 96 poços e interrompida com PCR em tempo real (ABI 7900HT, Applied Biosystems). dados de amplificação (dobrável mudanças no C

valores de t de todos os genes) foi analisada com o software SABiosciences.

Estatísticas

A significância estatística das diferenças foi avaliada por meio das estudantes 2-atado

t

teste. A

valor p

de menos que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. As figuras mostram uma média de 3 experiências independentes, a não ser que indicado de outra forma. As barras de erro indicam o desvio padrão (SD).

Resultados

Para obter uma melhor compreensão de como o tumor como tal afecta o fenótipo e função dos macrófagos no CRC, temos utilizado um

em células in vitro

modelo de cultura para estudar as interações de macrófagos de sangue periférico diferenciados e linhas celulares de CRC. Num

In vitro

configuração, o fenótipo de macrófagos M1 classicamente activado pode ser conseguida por exposição a ligandos de TLR, tais como LPS e a citoquina Th1 típico IFNy. macrófagos M2 alternativamente activados diferenciar em microambientes ricos em citocinas típicos Th2 (por exemplo, IL4 e IL13) e são por vezes referido como macrófagos de cicatrização. Em resposta a citocinas imuno-supressora (por exemplo, IL10) macrófagos adotar um fenótipo imuno-reguladora M2-like [4], [8].

Verificação de M1 e M2 macrófagos Populações

monócitos purificados foram diferenciadas para macrófagos aderentes por estimulação com a citoquina de M-CSF durante 1 semana e mais diferenciados pela adição de LPS e IFN-y (para M1), e de IL4 ou IL10 (por macrófagos M2). Como mostrado na Figura 1A, os macrófagos M1, de um modo geral, apresentada uma morfologia mais redonda, enquanto M2 macrófagos eram mais alongadas. Os macrófagos conduzidos na presença de M-CSF sozinho também mostrou uma morfologia alongada mais parecido com o fenótipo M2, embora menos pronunciada do que para que as diferentes populações de macrófagos M2. Olhando em mais detalhes sobre a morfologia, IL4 macrófagos estimulados M2 mostrou o alongamento mais pronunciado, com saliências especialmente longos (Figura 1A). IL10 macrófagos estimulados eram mais semelhantes ao M-CSF macrófagos estimulados, com a excepção de ser um pouco mais aderente. Para excluir a possibilidade de as diferenças morfológicas observadas entre M1 e M2 macrófagos não eram devidas a um aumento da apoptose ou necrose, analisou-se a ligação de anexina V a fosfatidilserina celular e da superfície, assim como a absorção de iodo de propidio (PI), respectivamente. Como mostrado na figura 1B, os diferentes fenótipos de macrófagos continha baixos níveis razoáveis ​​de células apoptóticas e necróticas, respectivamente. Ao olhar para a expressão de M1 ou M2 marcadores típicos por citometria de fluxo, macrófagos M1 mostraram expressar níveis da superfície celular elevados de MHC de classe II do receptor HLA-DR, bem como os receptores co-estimulantes de células T, CD86 e CD40, mas níveis mais baixos dos marcadores típicos M2, CD163 e MR (Figura 1C). macrófagos M2 em vez expressa níveis elevados de CD163 e MR, enquanto mostra baixa expressão dos marcadores M1 (Figura 1C). As duas populações M2 pode ainda ser distinguido pelo que a IL4 macrófagos estimulados mostraram maior expressão de MR, enquanto IL-10 estimulada macrófagos expressaram níveis mais elevados de CD163 (Figura 1C). Além disso, todos os subtipos de macrófagos foram encontrados para expressam tipicamente a de monócitos /macrófagos CD14 marcador (Figura 1C). CD1a, o marcador para as células dendríticas de origem monocítica, não foi expressa por qualquer uma das populações de macrófagos (dados não mostrados).

(a) Avaliação morfológica dos macrófagos fenótipos. (B) A apoptose e necrose das populações de macrófagos foi avaliada através de coloração com anexina V e PI, respectivamente, seguido por citometria de fluxo. É mostrado por cento /células em apoptose necróticas (média ± SD) de três experiências independentes. (C) A expressão de marcadores extracelulares para populações de macrófagos como avaliados pela imuno e citometria de fluxo. Intensidade relativa média flourescense (IMF) ± DP de três ou mais experiências independentes é mostrado, em que cada amostra foi normalizado contra o respectivo controlo de isotipo. diferenças estatisticamente significativas relevantes estão assinalados com * (p 0,05), ** (p 0,01), ou *** (p 0,001), não significativo

valores p

são indicados por ns

Migração do M1 e M2 macrófagos

Para estudar se o tumor fatores secretados de alguma forma preferencialmente recrutar macrófagos de um determinado fenótipo, olhamos para a capacidade migratória de M1 e M2 macrófagos em um

in vitro ensaio de migração celular

. Descobrimos que os macrófagos M1 tinha muito baixa capacidade migratória para meio de controlo RPMI, enquanto que M-CSF e estimulados macrófagos M2 migrou mais para meio sozinho (Figura 2). Ao permitir que as diferentes subpopulações de macrófagos a migrar para o meio condicionado de linhas celulares de CRC RKO ou SW480, descobrimos que preferencialmente IL4 macrófagos estimulados M2 mostraram aumento da migração para meios de tumor condicionado, sugerindo que fatores tumorais secretado recrutar preferência macrófagos de um fenótipo de cicatrização (Figura 2).

Migração de fenótipos de macrófagos foi avaliada por experiências de câmara de Boyden, onde os macrófagos foram deixadas migrar no sentido de meio condicionado a partir de linhas de células RKO ou SW480 CRC, ou controlo do meio de cultura (RPMI + 10% de FBS) . número médio de células que migram (n) ± SD é mostrado. diferenças estatisticamente significativas relevantes estão assinalados com * (p 0,05), não significativo

valores p

são indicados por ns

O fenótipo de tumor de macrófagos activados (TAM)

a morfologia e fenótipo da superfície da célula de TAM diferenciadas na presença de meio condicionado de RKO, SW480 ou linhas de células Caco2 CRC foi analisada na Figura 3A e B, respectivamente. TAM foram alongadas, assim, a morfologia mais se assemelhava ao de M2 ​​populações de macrófagos (compare Figuras 3A e 1A). Ao olhar para a expressão de M1 e M2 marcadores da superfície celular específicos, TAM também foram encontrados para partilhar mais semelhanças com macrófagos M2 (Figura 3B). No entanto, o fenótipo era TAM não tão pronunciado quanto que para os macrófagos M2, uma vez que a elevada expressão de qualquer MR (como em macrófagos estimulados IL4 M2) ou CD163 (como em macrófagos estimulados IL10 M2) não foi geralmente observada. A excepção foi macrófagos activados pelo meio condicionado de células SW480, que apresentavam uma elevada expressão de MR semelhante ao de IL4 macrófagos estimulados m2 (Figura 3B). Por conseguinte, estes dados sugerem que as células SW480 pode distorcer macrófagos no sentido de um fenótipo M2 pronunciada, enquanto RKO ou células Caco2 não induz grandes alterações para o M-CSF macrófagos estimulados, pelo menos não alterações que foram detectadas aqui.

( A) avaliação morfológica de macrófagos estimulados com meio condicionado (CM) da RKO, SW480 ou linhas celulares Caco2. (B) Expressão de marcadores extracelulares foi avaliada por citometria de fluxo e imunocoloração em macrófagos de M1 e M2 subtipo ou em macrófagos estimulados com meio condicionado (CM) a partir de linhas celulares de CRC. Intensidade relativa flourescense média (MFI) ± SD de três ou mais experiências independentes é mostrado, onde cada amostra foi normalizado contra o seu respectivo controlo de isotipo e com a M-CSF estimulada amostra de controlo definido como 1.

endocitose Capacidade de M1 /​​M2 macrófagos Populações e TAM

A função de endocitose dos diferentes subconjuntos de macrófagos M1 e M2, bem como TAM, também foi investigado no nosso

in vitro

sistema de cultura celular . As células foram diferenciadas em diferentes fenótipos de macrófagos, e monitorizado para a sua capacidade de endocitar dextrano marcado fluorescentemente. macrófagos M1 mostraram ter uma capacidade endocítica inferior em comparação com os macrófagos M2, aproximadamente 20% para M1 em comparação com 50-100% de macrófagos M2, com IL10 macrófagos estimulados M2 exibindo a maior capacidade de endocitose (Figura 4). A fim de investigar a forma como factores tumorais secretada afectar endocitose macrófagos, foram comparadas à do M1, M2 e TAM (Figura 4). Esta análise mostrou que a endocitose de FITC-dextrano de MAT mais assemelhava-se de macrófagos M2.

endocitose por M1 e M2, macrófagos ou macrófagos estimulados com meio condicionado (CM) a partir de linhas de células RKO, SW480 ou Caco2 foi CRC avaliada medindo a internalização de FITC-dextrano por citometria de fluxo. É mostrado por cento endocitose relativa (média ± SD) com endocitose por IL10 macrófagos estimulados M2 definidos como 100%. As diferenças estatisticamente significativas estão indicadas por * (P 0,05) ou ** (P 0,01). Todas as outras diferenças foram testadas, mas encontrado não-significativa (não indicado na figura).

macrófagos Plasticidade

Os macrófagos são conhecidos por serem células de plástico, que adotam várias formas, dependendo fatores na meio no qual eles se encontram. Ao analisar a plasticidade no nosso

In vitro

sistema de cultura de células, os macrófagos M1 e M2 foram, de facto verificou-se ser muito plástico em natureza, uma vez que os macrófagos diferenciados M1 pode ser conduzido para um fenótipo M2, e vice-versa, conforme avaliado por investigação morfológica e expressão de marcadores de macrófagos e M1-M2-típicos (Figura 5). A morfologia dos macrófagos M1 M2 que receberam estímulos foi mostrado para mudar para um mais alongado M2 aparência (Figura 5A), embora não completamente. Por outro lado macrófagos M2 apareceu a adoptar mais rapidamente a morfologia redonda de macrófagos M1 quando submetidos aos estímulos opostos (Figura 5A). Ao analisar a expressão de M1 e M2 marcadores, uma mudança entre os fenótipos também ficou evidente, uma vez que M1 marcadores típicos foram encontrados para ser regulada por M2-estímulos e vice-versa (Figura 5B). Sugere-se na literatura que a TAM está distorcida por fatores secretados tumorais para um fenótipo M2 [10] – [12]. No entanto, isto não foi claramente reflectida no nosso

In vitro

sistema de cultura de células, uma vez que uma população M2 distinta não foi geralmente induzida por factores segregados a partir de células de CRC. Por causa do comportamento plástico exibido pelas populações de macrófagos, procurou-se investigar se os macrófagos M1 diferenciados poderia ser afetada por fatores tumorais secretado. No entanto, meios condicionados de células CRC não foi capaz de distorcer macrófagos M1 já diferenciadas para um fenótipo M2. Em vez disso, o meio condicionado a partir de células de CRC aumentou a expressão do marcador CD86 M1, enquanto que a redução do marcador M2 CD163, e, assim, pareceu reforçar o fenótipo M1 (Figura 5C). IL4 ou IL10 macrófagos estimulados M2 não foram afectados por factores segregados a partir de células de CRC (dados não mostrados). Isto sugere que factores tumorais segregada por si só não é capaz de deslocar um macrófago fenótipo M1 estabelecida para um fenótipo M2 no CRC.

A morfologia e a expressão de marcadores extracelulares foi avaliada em macrófagos de diferentes subtipos M1 ou M2 antes e depois estimulação para o fenótipo oposto ou a estimulação por meio condicionado (CM) a partir RKO, SW480 ou linhas de células Caco2 CRC. (A) Avaliação morfológica de fenótipos de macrófagos. (B) A expressão de marcadores extracelulares para populações de macrófagos como avaliados pela imuno e citometria de fluxo. (C) A diferenciação de macrófagos M1 por estimulação com meio condicionado (CM) a partir de linhas celulares de CRC. Intensidade relativa média flourescense (IMF) ± DP de três experiências independentes é mostrado, em que cada amostra foi normalizado contra o respectivo controlo de isotipo e com a M1 ou M2 (IL10) estimulada amostra macrófagos definido como 100%. diferenças estatisticamente significativas relevantes estão assinalados com * (p 0,05), não significativo

valores p

são indicados por ns

citocinas Expression pela M1 e M2 macrófagos e TAM Populações

é evidente que a definição distinta simplificada do M1 e M2 macrófagos não se aplica a todos os macrófagos em um

in vivo

definição. No entanto, para analisar as diferenças que são causadas por fatores secretados tumorais sozinho, mais uma vez utilizada a

in vitro

sistema de cultura celular para olhar para potenciais diferenças e semelhanças entre as citocinas e quimiocinas padrões de M1 e M2 macrófagos de expressão, ou populações TAM. Para isso, utilizou-se uma matriz de expressão com base em PCR de citocina e o gene de quimiocina (resultados apresentados em detalhe na Tabela S1). genes seleccionados de interesse são apresentadas na Figura 6. Tal como esperado, foram encontradas macrófagos M1 a expressar níveis mais elevados de citocinas pró-inflamatórias, IL-1, IL6, IL12, IL23 e TNFa, os quais não foram expressos pelos macrófagos M2 (Figura 6A) . As citocinas reguladoras imunes IL10 e TGF-p foram expressos principalmente por macrófagos M2, em particular os macrófagos imuno-reguladora M2-como derivados de IL10 (Figura 6A). Ao olhar para o padrão de citocinas e expressão de quimiocinas na TAM ficou claro que cada linha de células CRC induziu um padrão de expressão individual. Quando se compara o perfil de macrófagos M1 e M2 para a do TAM diferente expressão do gene, MAT foram encontrados para expressar níveis mais elevados de citocinas pró-inflamatórias que macrófagos M2, embora na maioria dos casos era muito mais baixa do que para os macrófagos M1. Uma exceção foi TNFa, que foi encontrado para ser expressa pela TAM para níveis semelhantes aos de macrófagos M1. O quimiocinas IL10 imuno-reguladora e TGF-p2 foram expressos também pelo TAM diferente, em alguns casos, para uma extensão ainda maior do que os macrófagos M2. Procurámos investigar as diferenças na resposta quimiotáctica induzida por macrófagos e TAM M1 ou M2 compreender como o tumor no CRC afecta o recrutamento de macrófagos induzida de outras células do sistema imunológico (Figura 6B). Ao olhar para factores que preferencialmente recruta linfócitos do tipo Th1 (por exemplo, CXCL9 e CXCL10), MAT estimulada por meio condicionado de células RKO ou Caco2 foram encontrados para expressar níveis mais elevados do que os macrófagos M2, mas ainda quantidades muito baixas em comparação com a expressão de estes factores por macrófagos M1. O factor quimiotáctico para neutrófilos CXCL2 [19] foi secretada por TAM estimulada por meio condicionado de células SW480. Isto sugere que, embora os efeitos foram modestas, algumas características de macrófagos M1 pode ser encontrada também na TAM. Ao olhar para factores que recrutam linfócitos do Treg e Th2 tipo (por exemplo, CCL17, CCL18, CCL22 e CCL24), que são expressos principalmente pela população M2, estes foram encontrados para não ser expressa por TAM, com a excepção de CCL24 na TAM estimulada por meio condicionado de células SW480. Isto sugere que nem todas as características M2 são encontrados em TAM. Finalmente, olhou para genes que foram mais altamente expressos na TAM em geral, comparada com a de M1 ou M2 macrófagos. O monócitos atraindo fator CCL2 quimiotáctica foi encontrado para ser altamente expresso em todas as populações da TAM. Também complementar proteína C5 foi encontrado para ser altamente expressa em TAMs em particular. Juntos, isto sugere que os fatores tumorais secretado induz TAMs de um fenótipo “misto”, com algumas características que são específicas TAM e algumas características que podem ser semelhantes ou diferentes para que, em M1 ou M2 macrófagos.

A expressão gênica foi estudado em M1 e M2 macrófagos, ou macrófagos estimulados com meio condicionado (CM) a partir RKO, SW480 ou linhas celulares de CRC Caco2 usando uma citocina Matriz de quimiocina PCR. (A) Expressão de citocinas pró-inflamatórias e anti-inflamatórias. (B) Expressão de factores quimiotácticos. Mostrado é dobrar a expressão do gene, com IL4 macrófagos estimulados M2 definidos como 1.

Discussão

Em um estudo anterior, onde analisamos a distribuição de macrófagos M1 e M2 em um grupo de pacientes de CRC , descobrimos que um aumento da infiltração de macrófagos de um fenótipo M1 pode ser correlacionada com um aumento na sobrevida em pacientes CRC [18]. No entanto, a infiltração de macrófagos M1 foi encontrada para também ser acompanhada por infiltração de macrófagos M2. As células tumorais são conhecidos para a produção de factores que afectam o fenótipo de macrófagos e, assim, também a resposta de macrófagos para o tumor, sugeriu a favorecer a invasão tumoral e metástase [12], [20]. Possíveis explicações para o papel positivo dos macrófagos visto no prognóstico no CRC, poderia ser qualquer um que CRC alguma forma sustenta uma resposta em curso M1 macrófagos, ou menos eficiente distorcer a resposta de macrófagos para uma resposta M2 do que outros tipos de câncer, onde a infiltração de macrófagos é um mau marcador de prognóstico