Abstract
A proteína quinase CK2 tem diversas funções que promovam e manutenção de fenótipos cancerosas. Investigou-se o efeito de inibição CK2 em células de cancro do pulmão com resistência mediada por T790M ao inibidor da TK EGFR. sublinhas resistentes de PC-9 a gefitinib (PC-9 /GR) e erlotinib (PC-9 /ER) foram estabelecidas pelo estudo anterior, e T790M mutação secundária foi encontrada em ambas as sublinhas resistentes. Uma diminuição de EGFR por meio de tratamento de siARN controlada de forma eficaz o crescimento de células resistentes, o que sugere que eles ainda têm de EGFR-dependência. CX-4945, um inibidor de CK2 potente e selectivo, autofagia induzida no PC-9 /GR e PC-9 /ER, e que foi apoiado pela indução de vacúolos autofágicos e cadeia leve de expressão associada a microtúbulos proteína 1 3 (LC3), e o aumento dos sinais fluorescentes punctata em células resistentes pré-transfectada com proteína fluorescente (GFP) LC3 tagged verde. No entanto, a retirada de CX-4945 levou à recuperação das células cancerosas com autofagia. Verificou-se que a indução de autofagia por CX-4945 em ambas as células resistentes era dependente CK2 usando pequeno ARN interferente contra CK2. O tratamento com CX-4945 sozinho induziu uma inibição do crescimento mínimo em células resistentes. No entanto, o tratamento combinado de CX-4945 e EGFR-TKI inibiu eficazmente a proliferação de células do cancro e a apoptose induzida. CX-4945 aumentou a translocação do EGFR da superfície da célula para o autophagosome, subsequentemente, levando à diminuição do EGFR, enquanto a inibição da autofagia por 3MA-alvo ou Atg7 siARN pré-tratamento reduziu a diminuição do EGFR por CX-4945. Por conseguinte, a apoptose por uma combinação de CX-4945 e EGFR-TKI foi suprimida por 3MA-alvo ou Atg7 siRNA de pré-tratamento, o que sugere que o EGFR sub-regulação mediada por autophagosome teria um papel importante sobre a morte celular por apoptose por EGFR-TKI. O tratamento combinado do inibidor de CK2 e EGFR-TKI pode ser uma estratégia promissora para superar a resistência mediada por T790M
Citation:. Então, KS, Kim CH, Rho JK, Kim SY, Choi YJ, Song JS, et al . (2014) Autophagosome-Mediated EGFR Regulação para Baixo induzida pela CK2 Inhibitor aumenta a eficácia de EGFR-TKI em células EGFR-mutante do câncer pulmonar com resistência por T790M. PLoS ONE 9 (12): e114000. doi: 10.1371 /journal.pone.0114000
editor: Spencer B. Gibson, da Universidade de Manitoba, Canadá |
Recebido: 02 de agosto de 2014; Aceito: 02 de novembro de 2014; Publicação: 08 de dezembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Portanto, et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. Este trabalho foi financiado por uma concessão do coreano Saúde Tecnologia R D Project, Ministério da Saúde Bem-estar (HI12C1146000013) e uma subvenção (2011-0529), do Instituto Asan para Ciências da Vida, Seul, República da Coreia. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Segmentação o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), com pequenas moléculas, inibidores da tirosina quinase tornou-se uma estratégia terapêutica essencial para o cancro do pulmão de células não pequenas, (NSCLC) com mutação do EGFR. Depois de confirmar o benefício de sobrevivência em comparação com a de quimioterapia citotóxica convencional [1], [2], o EGFR-TKI foram aprovadas como agentes de primeira linha. No entanto, apesar da resposta inicialmente notável, resistência adquirida eventualmente se desenvolve, limitando, assim, a duração da resposta média de menos de um ano [3], [4]. Aproximadamente metade da resistência é provocada por uma mutação-segundo local na posição 790, ou seja T790M [5], [6]. O resíduo de metionina mais volumoso na T790M poderiam dificultar a ligação do fármaco ou o aumento da afinidade de ATP no bolso de ligação de ATP, e, assim, minimizar a eficácia do fármaco [5], [7].
A segunda geração de EGFR-TKI , tal como BIBW2992 (afatinib) e PF00299804 (dacomitinib), ter sido recomendado, a fim de superar a resistência mediada por T790M considerando que estes potente e irreversível de EGFR-TKI já não competem com o ATP, uma vez que tornaram-se covalentemente ligado ao domínio quinase [ ,,,0],8], [9]. No entanto, é incerto se irreversível EGFR-TKI pode superar a resistência causada por T790M como alguns resultados preliminares em curso ensaios clínicos têm sido bastante decepcionante em termos de superar a resistência, embora, a sobrevida do paciente livre de progressão mais bem sucedido poderia ser alcançado quando utilizado como o agente de primeira linha em comparação com o EGFR-TKI reversíveis [10], [11]. Portanto, ainda mais investigação clínica irá ser necessária a fim de proporcionar estratégias mais eficazes vencedores.
Proteína cinase CK2 é um, serina ubíqua /treonina quinase constitutivamente activa e altamente conservada que está envolvido numa variedade de sinalização celular relacionada nas o ciclo celular, proliferação e apoptose [12] – [14]. expressão CK2 aberrante e atividade têm sido relatados em muitas doenças humanas, incluindo câncer [15]. A sobre-expressão de CK2 atenua a apoptose de células cancerosas, ao passo que a sua infra-regulação aumenta a morte celular causada por droga ou radiação, e sugerindo assim o seu importante papel regulador sobre a determinação do destino das células do cancro [16] – [19]. fosforilação dependente de Cdc37-CK2 é necessário para a função acompanhante de Hsp90 em numerosas oncoproteínas do cliente, incluindo CK2, em si [20]. Uma vez que a Hsp90 é essencial para a maturação e estabilidade oncoproteínas, a sobrevivência de células cancerosas é criticamente dependente do seu funcionamento adequado, sugerindo, portanto, que o controlo de HSP90, directa ou indirectamente, através da inibição da CK2 iria ser promissora para o tratamento do cancro. Além disso, pode regular CK2 EGFR e a sua sinalização a jusante, especialmente a actividade de membros da via PI3K-Akt-mTOR [21] – [24]. A inibição desta via tem sido mostrado para potenciar o efeito dos inibidores de EGFR [25].
Neste estudo, investigou-se a actividade de CX-4945, um inibidor selectivo e potente CX-2, EGFR sobre cancro do pulmão células mutantes com mutação T790M levando a resistência ao EGFR-TKI. Foi também analisada a se poderia aumentar o efeito de EGFR-TKI, a fim de superar a resistência.
cultura celular Materiais e Métodos Comprar e reagentes
Gefitinib /Erlotinib- linhas de células resistentes (PC-9 /GR e PC-9 /ER) foram estabelecidos em um estudo anterior [26]. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo 10% de soro fetal bovino, 100 unidades /mL de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA) a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5%. A solução de MTT foi adquirido de Sigma (St Louis, MO, EUA). Gefitinib, erlotinib, 17-DMAG, CX-4945, e foram adquiridos a partir de 3MA Selleck Chemicals Co. Ltd (Houston, TX, EUA).
ensaios de sobrevivência celular
Para realizar o ensaio de MTT , as células foram plaqueadas em placas de 96 poços de plástico esterilizadas. As células foram expostas a doses variáveis de CX-4945. Após 72 h, a 15 ul de solução de MTT (5 mg /mL) foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas durante 4 h. formazano cristalino foi solubilizado com 100 uL de uma solução 10% (w /v) de solução de SDS durante 24 h. A absorvância a 595 nm foi lida espectrofotometricamente utilizando um leitor de microplacas. Para validar os efeitos combinados de CX-4945 ou dependência do EGFR, as células foram tratadas com siRNA CX-4945, o EGFR-TKI, uma combinação de CX-4945 e gefitinib ou erlotinib, ou EGFR alvo durante os tempos indicados. A viabilidade celular foi determinada utilizando um contador de células automático ADAM-MC (NanoEnTek, Seul, Coreia) de acordo com as instruções do fabricante.
análise Western blot
lisados celulares totais foram preparados usando tampão de lise EBC ( Tris-HCl 50 [pH 8,0], NaCl 120 mM, 1% de Triton X-100, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 0,3 mM, ortovanadato de sódio 0,2 mM, NP40 a 0,5%, e 5 U /ml de aprotinina) e foram, em seguida, centrifugada. O sobrenadante resultante (20 g) foi separada em 8% a 12% de SDS-PAGE e transferidos para membranas de PVDF (Invitrogen). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado-PBS-0,1% de Tween 20 durante uma hora à temperatura ambiente antes de serem incubadas durante a noite com anticorpos primários específicos para a p-CK2α que foi adquirido de Sigma (St Louis, MO, EUA) e CK2α quais foi comprado de Abcam (Cambridge, Reino Unido). p-EGFR (Tyr1173), EGFR, caspase-3, Akt, p-Erk, Erk, e β-actina foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA). P-Akt (Ser473), PARP clivada (Asp214), Atg7 LC3 e foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Berverly, MA, EUA). Os anticorpos conjugados com peroxidase de rábano foram utilizados como anticorpos secundários. As membranas foram desenvolvidos utilizando kits ECL (PerkinElmer, Waltham, MA, EUA).
Acridina coloração laranja
A autofagia foi analisado por coloração das células com o corante vital, laranja de acridina (Sigma, St Louis, MO). As células foram tripsinizadas e foram incubadas com laranja de acridina, a uma concentração final de 5 ug /mL durante 30 min a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5%. As análises foram realizadas num FACScan (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, EUA). Os dados foram analisados utilizando o software CellQuest (Becton Dickinson). Os resultados são representativos de pelo menos três, experimentos independentes, e as barras de erro significam desvios-padrão (SDS).
expressão LC3-GFP
As células foram transfectadas com um plasmídeo, vector pEGFP-LC3 (Addgene Inc., Cambridge, MA, EUA) e foram cultivadas durante 24 h. As células foram então tratadas com CX-4945 durante 24 h. Os padrões de puntiformes LC3 em células transfectadas foram examinadas por microscopia de fluorescência.
Ensaio de Apoptose
A apoptose foi quantificada utilizando o kit de apoptose Anexina V-FITC (BD Biosciences, San Diego, CA, EUA) em conformidade com as instruções do fabricante. Em resumo, as células foram tripsinizadas, sedimentadas por centrifugação e ressuspensas em tampão de Anexina V (NaCl 150 mM, CaCl 18 mM
2, 10 nM de HEPES, 5 mM de KCl, 1 mM MgCl
2) de ligação. Anexina V conjugada com FITC (1 ug /ml) e iodeto de propídio (50 ug /ml) foi adicionado às células que foram incubadas durante 30 min à temperatura ambiente no escuro. As análises foram efectuadas num FACScan (Becton Dickinson). Os dados foram analisados utilizando o software CellQuest (Becton Dickinson). Os resultados são representativos de pelo menos três, experiências independentes e as barras de erro significam desvios-padrão (SDS).
pequeno RNA de interferência transfecção
pequeno RNA de interferência (siRNA) oligonucleotídeos específicos para EGFR, Atg7, CK2α e o ARNsi de controlo foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz). As células foram semeadas numa placa de 60 mm, que foi então deixada durante 24 h. Uma alíquota de 2 mL de solução de siARN (10 uM) e cinco ul de Lipofectamina 2.000 (Invitrogen) foram cada uma misturadas com 100 ul de meio RPMI isento de soro 1640. Eles foram incubadas durante 20 min à temperatura ambiente depois de combinar as duas misturas, e isto foi então adicionado às células que tinham sido semeadas no prato. Após 24 h, as células colhidas foram submetidas a análise de mancha de Western. As células também foram processadas para análise de viabilidade celular e a apoptose.
microscopia confocal
As células foram cultivadas numa câmara de corrediça na presença ou ausência de CX-4945 durante 48 h. Eles foram fixadas durante 10 min com metanol frio e, em seguida, lavada três vezes com PBS. As células foram incubadas com anticorpo anti-EGFR (Santa Cruz, 1:50) e LC3 (sinalização celular, 1:100) durante a noite a 4 ° C. incubação do anticorpo secundário estão incluídos 1:100 diluição de qualquer Alexa Fluor 488 anti-rato ou anticorpos 568 anti-coelho Alexa Fluor. Os núcleos foram corados com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) e foram então lavadas e cobrir-deslizado. As lâminas foram vistos sob um microscópio confocal de varredura a laser LSM710 (Carl Zeiss, Jena, Alemanha), e as imagens foram fotografadas.
Resultados
CX-4945 induz a autofagia em gefitinib PC /erlotinib resistente -9 células
Alguns estudos relatam que CX-4945 levou a uma inibição da proliferação de células de cancro humano [15], [24]. Para investigar se CX-4945 pode inibir o crescimento de células de cancro do pulmão com resistência mediada por T790M a EGFR-TKI, as células foram tratadas com CX-4945 de uma maneira dependente da dose. Como mostrado na Fig. 1A, CX-4945 de tratamento não mostraram uma inibição significativa do crescimento em células de gefitinib /erlotinib-resistente. No entanto, descobrimos que o tratamento CX-4945 provocou a acumulação de vacúolos autofágicos (AV), ao passo que estas células foram restaurados ao seu estado anterior após a retirada da droga (Fig. 1B). Para confirmar ainda mais a indução de autofagia por CX-4945, analisou-se a expressão do marcador autofagia, LC3-II, e o número de células coradas com acridina laranja realizando Western blotting e análise por FACS. Consistente com a indução de vaculoles autofágicos, tratamento CX-4945 mostraram um forte aumento da quantidade de endógena LC3-II e na percentagem de células laranja acridina-positiva (Fig. 1C e D). Além disso, CX-4945 tratamento exibiram padrão pontuada característica da LC3, enquanto que as células tratadas com o veículo mostraram fluorescência verde associada a LC3 difusa e fraca (Fig. E). Este autofagia induzida por CX-4945 foi também observada em células PC-9 parentais (dados não mostrados). Estes resultados demonstraram que CX-4945 tem a capacidade de desencadear a indução de autofagia em células parentais, bem como /células PC-9 erlotinibe resistentes a gefitinib.
A, As células foram tratadas com diferentes concentrações de CX-4945 durante 72 h, e a taxa de inibição foi determinada por ensaio MTT. B, as células foram tratadas com ou sem CX-4945 (5 uM) durante 48 h e, em seguida, foram incubadas durante 24 horas com um meio isento de droga contendo 10% de FBS. Imagens que mostram a formação autofágica vacúolo (avos) foram tomadas no × 20 ampliação. C e D, as células foram tratadas com CX-4945 durante 48 h. Os lisados celulares foram sujeitos a análise de Western blot. Detecção quantitativa de organelos vesiculares ácidas por coloração com alaranjado de acridina de células foi determinada por análise FACS. * P 0,01 e ** P 0,001 comparado com o controlo. E, as células foram transfectadas com um plasmídeo para expressar LC3-GFP. Após 24 horas de transfecção, as células foram tratadas com CX-4945 (5 uM) durante 24 h. padrão pontuada de LC3 localização analisadas por microscopia de imunofluorescência. F e G, as células foram incubadas com CX-4945 (5 uM), 17-DMAG (100 nM) ou de rapamicina (20 uM) durante 48 h. Fotos foram tiradas no × 20 ampliação. A indução de LC3-I /II foi demonstrada por análise de Western blot.
Hsp90 é essencial para numerosas oncoproteínas maturação e estabilidade incluindo CK2α [20]. Além disso, a função acompanhante de Hsp90 necessária a fosforilação de Cdc37 por CK2α [27], [28]. Para avaliar ainda mais se a Hsp90 foi envolvido em autofagia CX-induzido-4945, as células foram tratadas com 17-DMAG, inibidor de Hsp90. Como mostrado na Fig. 1F e G, a inibição da Hsp90 não mostram a indução de autofagia. Embora as células foram tratadas com as mesmas doses de cada fármaco, autofagia induzida por CX-4945 foi mais potente do que a rapamicina, um inibidor de mTOR.
Embora CX-4945 tem a selectividade para CK2, pode inibir outras quinases, tais como FLT3, PIM1, e CDK1. Assim, nós examinamos se a autofagia induzida por CX-4945 é dependente da CK-2. Consistente com o resultado do tratamento CX-4945, a supressão de CK2α induziu apenas uma inibição de crescimento mínimo, enquanto que resultam num aumento de vaculoles autofágicos e endógena LC3-II (Fig. 2). Estes resultados sugeriram que a autofagia induzida por CX-4945 pode ser dependente da CK2.
A e B, as células foram transfectadas com ARNsi de controlo ou CK2α (100 nM) durante 48 h. Os números de células foram determinados com um contador automático de células ADAM-MC. Imagens que mostram a formação autofágica vacúolo (avos) foram tomadas no × 20 ampliação. * P 0,01 comparado com o controlo. C, após 48 h de transfecção, CK2α e LC3-I /II foi mostrado por análise de Western blot.
CX-4945 aumenta a eficácia de EGFR-TKI em células gefitinib /erlotinib resistente
a relação entre a indução de autofagia e a sensibilidade ao EGFR-TKI tem permanecido controversa [29] – [32]. Determinar se autofagia induzida por CX-4945 pode afectar a sensibilidade ao EGFR-TKI, as células foram tratadas com CX-4945, o EGFR-TKI ou uma combinação de ambos, durante 48 h. A combinação de CX-4945 e gefitinib ou erlotinib conduziu à inibição do crescimento significativa, ao passo que a autofagia induzida por CX-4945 foi diminuída em tratamento combinado (Fig. 3A). Além disso, o tratamento combinado com o EGFR-TKI e CX-4945 induzida caspase-3 e PARP-1 de clivagem, conduzindo assim à morte celular aumentada (Fig. 3B e C).
As células foram tratadas com CX-4945 ( 5 uM), gefitinib (1 uM), e erlotinib (1 uM) ou uma combinação de CX-4945 e CX-gefitinib ou erlotinib e 4945 durante 48 h. A, os números de células foram determinados utilizando um contador de células (painel superior). Detecção quantitativa de organelos vesiculares ácidas por coloração com alaranjado de acridina de células foi determinado por análise FACS (painel inferior). † p 0,01 comparado com sozinho CX-4945. B, A apoptose foi avaliada por coloração com iodeto de anexina V-FITC /propídio e citometria de fluxo. Diagramas de iodeto de anexina V-FITC /Prop�io citometria de fluxo em uma experiência representativa são apresentados no painel da esquerda. Os resultados são representativos de pelo menos 3 experiências independentes e as barras de erro significam desvio padrão (± DS). C, a clivagem de PARP-1 e a caspase-3 foi demonstrada por análise de Western blot. * P 0,01 e ** P . 0,001 em comparação com o controlo
Para investigar o mecanismo pelo qual CX-4945 restaurou as actividades antitumorais de EGFR-TKI em células resistentes, que em primeiro lugar, examinada a dependência sinalização do EGFR em ambos os tipos de células resistentes. Embora a eficácia para regular negativamente a EGFR diferiam, o crescimento de ambas as células resistentes foi significativamente inibida pelo tratamento com siRNA, e sugerindo assim a persistência da dependência EGFR apesar da resistência T790M mediada (Fig. 4A e B). A seguir, observadas as actividades de EGFR e as suas moléculas jusante quando as células foram expostas a cada fármaco. O efeito inibitório de um único tratamento com CX-4945, gefitinib ou erlotinib em actividades EGFR e AKT foi modesta, ao passo que a combinação de CX-4945 e gefitinib ou erlotinib EGFR completamente suprimida e a actividade de Akt (Fig. 4C). O tratamento com CX-4945 induziu a regulação negativa do EGFR total, como visto no tratamento de siARN. Estes resultados sugerem que a adição de CX-4945 ao EGFR-TKI pode superar a resistência mediada por T790M através do aumento da atividade de EGFR-TKI para suprimir os sinais de EGFR pela infra-regulação do EGFR.
A e B, Controlo e EGFR ARNsi (100 nM) foram introduzidos em células parentais ou resistentes, e supressão do EGFR foi confirmada por análise de Western blot. A viabilidade celular foi medida utilizando um contador de células 72 horas mais tarde. * P 0,01 e ** P 0,001 comparado com o controlo. C, as células foram tratadas com as drogas, como na Fig. 2. As células foram recolhidas, e a modulação da sinalização do EGFR nas linhas celulares indicadas foi detectado por análise de Western blot.
A inibição da autofagia induzida por CX-4945 atenua a apoptose em gefitinib /erlotinib resistente células
Foi observado que o tratamento CX-4945 levou à diminuição da regulação do EGFR. Para determinar se a indução de autofagia está associada com a regulação negativa do EGFR, as alterações na localização do EGFR foi confirmada por microscopia confocal utilizando o anti-EGFR e anti-anticorpo conjugados com fluoróforo LC3. Como mostrado na Fig. 5A, CX-4945 tratamento mostraram um aumento inLC3 /EGFR co-localização. Estes resultados demonstram que a autofagia induzida por CX-4945 podem prender EGFR a partir da membrana plasmática para o autophagosome e que as proteínas retidas pode ser degradado por lisossoma.
A, as células PC-9 /ER foram tratados com CX-4945 ( 5 uM) durante 48 h e, em seguida, foram fixadas com metanol, imunocoradas com anticorpo anti-LC3 (vermelho), anti-EGFR (verde), e DAPI (azul), e analisadas por microscopia confocal para determinar a localização intracelular do EGFR. B, A supressão de Atg7 por tratamento siARN foi detectado por análise de Western blot. As células PC-9 /ER foram tratados com CX-4945 (5 uM) durante 48 h na presença ou ausência de 3MA (2 mM) e Atg7 ARNsi (100 nM). A modulação do EGFR foi detectado por análise de Western blot. C e D, as células foram tratadas com as drogas, como na Fig. 2 sob a presença ou ausência de 3MA e Atg7 siARN. A clivagem de PARP-1 e a caspase-3 foi demonstrada por análise de Western blot. A apoptose foi avaliada por coloração com iodeto de anexina V-FITC /propídio e citometria de fluxo. Os resultados são representativos de pelo menos 3 experiências independentes e as barras de erro significam desvio padrão (± DS). * P 0,01 e ** p . 0.001 em comparação com a combinação de CX-4945 e gefitinib ou erlotinib
Para investigar se a autofagia induzida CX-4945 leva diretamente para a infra-regulação da EGFR, foi avaliado o nível de EGFR na presença ou ausência do inibidor autophagic (3-metiladenina, 3MA) e tratamento Atg7 siARN. O número de autofagossomas foi significativamente menor em células pré-tratadas com 3MA (dados não mostrados), e 3MA ou tratamento Atg7 siARN restaurou as actividades, bem como o nível total de EGFR (Fig. 5B). Além disso, a inibição da autofagia por 3MA ou supressão de Atg7 diminuição da caspase-3 e PARP-1 de clivagem e, consequentemente, levou à redução da morte celular por apoptose (Fig. 5C e D). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a indução de autofagia por CX-4945 pode ter um papel importante na superação da resistência mediada por T790M para EGFR-TKI.
Discussão
Investigações para fornecer estratégias eficazes para superar a resistência mediada por T790M são muito importantes, como a maioria dos doentes tratados com TKI EGFR T790M e a resistência adquirida foi a causa da resistência ao meio destes pacientes [5], [6]. Como a segunda geração, irreversível EGFR-TKI, como afatinib e dacomitinib, não conseguiu superar a resistência causada por T790M [33], [34], outras medidas, tais como EGFR dupla alveja com cetuximab e afatinib [35] e em terceiro lugar -geneneration, mutante de EGFR-selectiva-TKI [36] – [38] estão a ser avaliada activamente. Os relatórios preliminares sobre a eficácia do mutante seletivo EGF-TKI são bastante promissores [39]. Estes novos medicamentos são esperados como sendo clinicamente disponível no futuro próximo para pacientes com resistência mediada por T790M. No entanto, devido à heterogeneidade do tumor e a instabilidade genómica, o surgimento de resistência a estas drogas parece ser inevitável exigindo outras estratégias terapêuticas.
Chen et al. demonstraram que os siRNAs específica de EGFR-inibiu fortemente o crescimento celular e a apoptose induzida em células H1975 albergando tanto L858R e T790M [40]. Mesmo knock-down do transcrito T790M por ARNsi, quando combinado com afatinib, foi eficaz no controlo de T790M-mutante, células de cancro do pulmão. Em consonância com isso, também confirmou a persistência da dependência do EGFR no T790M-mutante, as células de câncer de pulmão. Este é teoricamente plausível, considerando que T790M só reduz a afinidade licitação de EGFR-TKI, mas não ativar o mecanismo redundante para a sobrevivência de células de câncer, exceto em casos raros com outra concomitante, mecanismos resistentes. Portanto, a regulação negativa do EGFR pode exercer efeitos anti-cancro nas células cancerosas com a dependência de EGFR, bem como aumentar a eficácia de EGFR-TKI na definição de uma diminuição do nível da expressão do EGFR. O nosso estudo em primeiro lugar demonstrado que a regulação negativa do EGFR causada por CX-4945 aumentou a eficácia da EGFR-TKI em células de cancro de pulmão de EGFR mutante com resistência mediada por T790M.
Até agora, tem sido controversa permaneceu se autofagia está associada com sensibilidade ou resistência a EGFR-TKI. No entanto, alguns papéis sugerido recentemente que a indução de autofagia é necessário para o efeito citotóxico do EGFR-TKI em células primárias e resistentes com o EGFR mutante [29], [32], [41]. Eles também mostraram que o aumento da autofagia é necessário para a sobrevivência em células de câncer de pulmão EGFR-mutante independente de EGFR [41]. No nosso estudo, ambas as células resistentes ainda tinha EGFR-dependência e a inibição da autofagia levou à redução da morte celular. Consistente com estudos anteriores, os nossos resultados mostraram que a indução de autofagia tem um papel importante para superar a resistência adquirida a EGFR-TKI embora os mecanismos para induzir autofagia pode ser diferente.
expressão do EGFR na superfície da célula é rigorosamente controlado por um complexo, mecanismo de endocitose [42]. Após a activação e a internalização mediada por ligando, EGFR ou é reciclado de volta para a superfície celular ou transportados para a degradação lisossómica [42] – [44]. A alteração deste equilíbrio delicado pode alterar o nível de EGFR na superfície da célula. autofagossomas aumentados ao citoplasma poderia fundir-se com endossomas contendo EGFR, e causando deste modo a formação de amphisomes. Subsequentemente, autolysomes desenvolvidos pela fusão com lisossomas pode levar a degradação do EGFR (Fig. 6). Em nosso estudo, CX-4945 autofagossomas induzida mais potente do que a rapamicina, um inibidor de mTOR bem conhecido no EGFR-mutante, as células de câncer de pulmão com T790M. Diminuição da expressão de EGFR nestas células por CX-4945 seria causada pelo processo mencionado anteriormente. Isto é apoiado pelos resultados mostrando que o aumento do EGFR internalizado em autofagossomas por CX-4945 pode ser visualizado na coloração citoquímica fluorescente e a inibição da autofagia por 3MA ou tratamento Atg7 siARN restaurado o nível de EGFR. Por conseguinte, a indução de autofagia levando ao aumento da degradação do EGFR, quando combinado com o EGFR-TKI, poderia ser uma das opções terapêuticas prometedoras para as células cancerosas resistentes a TKI EGFR com dependência de EGFR.
EGFR é entregue a partir da membrana plasmática a endossomas precoces em vesículas endocíticas. Estas vesículas são de volta para a membrana plasmática através da via de reciclagem. No entanto, as vesículas podem também fundir-se com authophagosomes, e, em seguida, directamente com lisossomas levando à degradação dos EGFR.
autofagia CX-4945-induzida não pode ser mediado pela inibição da função de Hsp90 chaperoning porque 17-DMAG não poderia induzir autofagia. Estudos anteriores mostraram que a supressão da CK2 induz a morte celular autophagic através da modulação da mTOR e de sinalização MAPK em células de glioblastoma humano [45]. Em consonância com isso, descobrimos que a regulação baixa ou inibição de CK2α poderia levar a indução de autofagia em células de câncer de pulmão com mutação EGFR. No entanto, a morte das células não resistentes ocorrem quando as células foram tratadas com CX-4945 ou CK2α siARN. Este resultado pode ser causado pela característica das células cancerosas EGFR mutante. sinalizações jusante (PI3K /AKT e MAPK) de células com a mutação do EGFR são altamente dependentes da actividade de EGFR. Assim, a inibição de apenas CK2 pode não ser suficiente para a modulação da mTOR e de sinalização MAPK nestas células. Além disso mecanismos detalhados devem ser exploradas pelos seguintes estudos.
No entanto, sugerimos que CX-4945 poderia ser útil para o tratamento de câncer de pulmão EGFR-mutante com resistência mediada por T790M. No entanto, para a sua aplicação clínica, a questão da segurança relacionada com esta nova droga parece ser resolvido uma vez que podem inibir a função da Hsp90 que é importante na maturação e estabilidade de ambas as proteínas normais e oncoproteínas. Por isso, é incerto se ele pode atingir concentração sérica eficaz sem efeitos adversos significativos considerando que usado principalmente 5uM de CX-4945 em nosso estudo. Portanto, novos estudos são necessários para lidar com a dose apropriada de CX-4945 e perfis de segurança.
Em resumo, EGFR mediado por autophagosome infra-regulação induzida por CX-4945, um inibidor de CK2 potente e seletivo, melhora a eficácia de EGFR-TKI em células cancerosas de pulmão de EGFR mutante com resistência por T790M.