Abstract

Fundo

O câncer de ovário é a quinta maior causa de morte por câncer entre as mulheres. doença em estágio inicial, muitas vezes continua a ser detectado devido a falta de sintomas e biomarcadores confiáveis. A identificação de alterações genéticas precoces poderiam fornecer insights sobre novas vias de sinalização que podem ser exploradas para a detecção precoce e tratamento.

Metodologia /Principais Achados

Mouse epiteliais da superfície do ovário células (MOSE) foram usados ​​para identificar as alterações dependentes do estágio nos níveis de expressão de genes e vias de transdução de sinal pelo mouse analisa toda microarray do genoma e ontologia gênica. Estas células foram sujeitas a transformação espontânea em cultura de células e a transição do não-tumorigénico a fenótipos intermediários e agressivos, malignas. Significativamente genes alterados foram sobre-representados em um número de vias, mais notavelmente o citoesqueleto categoria funcional. Concomitante com mudanças de expressão gênica, a arquitetura do citoesqueleto tornou-se progressivamente desorganizada, resultando em expressão aberrante ou distribuição subcelular de proteínas reguladoras do citoesqueleto-chave (quinase de adesão focal, α-actinina e vinculin). A desorganização do citoesqueleto foi acompanhada por padrões alterados de serina e tirosina fosforilação, bem como expressão mudou e localização subcelular de integrante intermediários sinalização APC e PKCβII.

Conclusões /Significado

Os nossos estudos identificaram genes que são expressas de forma aberrante durante a progressão neoplásica de células MOSE. Mostramos que a desregulação fase inicial de filamentos de actina é seguido por desorganização progressiva de microtúbulos e filamentos intermédios, em fases posteriores. Estas mudanças, passo a passo específico do estágio fornecer mais insights sobre o tempo e espacial sequência de eventos que levam ao estado totalmente transformado uma vez que estas mudanças também são observados em linhas de ovário humano agressivos de células cancerígenas independentes do seu tipo histológico. Além disso, nossos estudos suportam uma ligação entre a organização do citoesqueleto aberrante e regulação de importantes eventos de sinalização a jusante que podem estar envolvidos na progressão do cancro. Assim, o nosso modelo de células derivadas de MOSE representa um modelo único para em profundidade estudos sobre os mecanismos de progressão do câncer de ovário

Citation:. Creekmore AL, Silkworth WT, Cimini D, Jensen RV, Roberts PC, Schmelz EM (2011) mudanças na expressão gênica e celular Arquitetura numa progressão Modelo câncer de ovário. PLoS ONE 6 (3): e17676. doi: 10.1371 /journal.pone.0017676

editor: Robert Oshima, Sanford-Burnham Medical Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de novembro de 2010; Aceito: 08 de fevereiro de 2011; Publicação: 03 de março de 2011

Direitos de autor: © 2011 Creekmore et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os estudos foram apoiados pelo NIH R01 CA118846 (a EMS, PCR) e AICR conceder 04B071 (EMS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

contas cancro do ovário para apenas 3% dos cânceres diagnosticados, mas é a quinta maior causa de mortes por câncer entre mulher, com taxas de sobrevivência de cinco anos de apenas 45% [1]. A idade média do diagnóstico é de 63 anos de idade, ea maioria dos pacientes (62%) apresentam com doença metastática no momento do diagnóstico [1]. O câncer de ovário é uma doença heterogênea, com vários subtipos his- ou clínico-patológicas que desenvolvem e apresentam de forma diferente. O ponto de vista convencional que é, aproximadamente, 90% dos cancros do ovário são derivados a partir da camada de célula única de epitélio de superfície que circunda o ovário [2]. Como o epitélio ovariano se transforma em um fenótipo maligno, que se diferencia em vários subtipos que foram classificados em carcinoma seroso, mucinoso, endometrioid e clara, com base na sua morfologia, em vez de seu genótipo [3]. No entanto, a origem dos subtipos individuais podem variar e uma maior contribuição da trompas de Falópio e do endométrio para cânceres mais agressivos está atualmente em discussão [4]. A origem de ambos epitelial do ovário e de Falópio é o mesmo ou seja, o epitélio, celômica [2], que pode contribuir para a controvérsia.

epiteliais cancros do ovário mostram um alto grau de heterogeneidade genética como um resultado de mutações, silenciamento e exclusões. Uma vez que as alterações na expressão do gene, quer através de mutação, regulação epigenética, ou eventos de splicing diferencial, o desenvolvimento do tumor influência, progressão, a capacidade de resposta de drogas e, finalmente, a sobrevivência do paciente, a identificação do subtipo do tumor e a sua impressão digital genética é essencial. Recentemente, uma nova classificação dos tumores ovarianos epiteliais em tipo I e tipo cancros II foi proposto: tipo 1 são benignos para limítrofes tumores com genótipos relativamente estáveis ​​enquanto o tipo II inclui tumores agressivos e alto grau que são geneticamente instáveis ​​e apresentam alterações genéticas substanciais [ ,,,0],5]. A maioria dos cancros epiteliais seguir um esquema de progressão na qual iniciada células progridem para a adenomas e adenocarcinomas metástase, acumulação de alterações genéticas em uma forma passo a passo durante a progressão [6]. Esta sequência também foi descrita para os carcinomas do ovário de baixo grau; é, no entanto, debatido se todos os cancros do ovário seguir esta o desenvolvimento do câncer desde lesões precursoras para os tumores do ovário mais agressivos (tipo II) não foram conclusivamente identificadas [5]. Recentemente, Lee et al. propuseram que a fímbria da trompa de Falópio pode ser a origem de células carcinomas serosos “Tipo II” [7]. Eles propõem que tipo surgir tumores II a partir de lesões “assinatura p53” precursores provenientes de amplificação de células epiteliais secretoras. mutações subsequentes, em seguida, facilitar a progressão para carcinoma intraepitelial tubária serosa e, finalmente, para carcinoma seroso.

Atualmente, os padrões de expressão genética só foram usados ​​com sucesso para distinguir entre células mucinoso e clara de carcinomas serosos [8] ou entre baixo grau e de baixo potencial de malignidade e de alta qualidade, tumores metastáticos [9], [10], [11]. marcadores moleculares ou clínicos confiáveis ​​para identificar mudanças nos estágios iniciais de progressão ainda não foram estabelecidas, e desde os primeiros estágios da doença são relativamente assintomática o diagnóstico muitas vezes só ocorre em estágios tardios. Portanto, a caracterização dos perfis de lesões precursoras estágio inicial de câncer de ovário poderiam fornecer novos insights e identificar novos alvos para os esforços de prevenção e tratamento.

Temos anteriormente desenvolvidos e caracterizados um modelo celular de progressão do câncer epitelial de ovário de expressão gênica para estudar a sequência de eventos que levam à epiteliais do cancro do ovário [12]. As células de ovário de ratinho singeneico superfície epitelial (MOSE), derivados dos ratinhos C57BL6, foram submetidos a transformação espontânea em cultura de células. As células MOSE heterogéneos sofrer alterações distintas fenotípicas como eles são continuamente passadas em cultura, com as primeiras passagens que representam uma pré-malignas, fenótipo não-tumorigénico, passagens intermédias de um fenótipo de transição, e passagens posteriores, progredindo para um fenótipo maligno altamente agressivo quando administrado a imunocompetentes murganhos . estados de transição da progressão se distinguiam por alterações nas taxas de crescimento, tamanho celular, perda de inibição de contacto do crescimento, ea capacidade de crescer como esferóides sob condições não-aderentes. Importante, tanto o MOSE-I (passagem intermédia) e MOSE-G (passagem tardia) as células também adquiriram a capacidade de formar tumores quando injectadas na cavidade peritoneal de ratinhos imunocompetentes singénicos, ainda que o primeiro era menos invasiva [12].

no presente estudo, foram identificadas mudanças significativas nos padrões de expressão gênica como não transformada transição células MOSE derivado a mais fenótipos agressivos e ferramentas de ontologias gene utilizados para determinar suas categorias funcionais. Os estados de transição desse modelo nos permitiu identificar genes dependente de palco, produtos de genes e vias de transdução de sinal envolvidos na progressão do tumor de ovário. Aqui destacamos mudanças progressivas que levam a um citoesqueleto altamente desregulado. Muitas dessas mudanças foram confirmadas em conjuntos de dados arquivados humanos ovarianos microarray câncer. Importante, nós demonstramos que a desorganização do citoesqueleto podem ter efeitos profundos sobre a localização subcelular de sinalização intermediários importantes, os quais, em última análise pode conduzir a vias de sinalização modulados contribuem para o desenvolvimento do cancro do ovário. Esses genes, seus produtos de genes e as vias de sinalização associados podem representar novos alvos para a intervenção precoce de progressão neoplásica.

Resultados

genes regulados diferencialmente em rato progressão do câncer de ovário

Para identificar as alterações de expressão gênica durante a progressão do câncer epitelial de ovário e determinar possíveis padrões específicos de estágio, usamos a análise do genoma microarray inteiro para comparar os níveis de expressão de genes em células que representam benigna (MOSE-e), intermediário (MOSE-I), e malignos ( estágios do câncer de ovário do rato MOSE-L). Três réplicas biológicas foram usadas para ter em conta as variações no âmbito das culturas heterogéneas. Dos 45,102 conjuntos de sondas no microarray (representando 18.136 genes anotados), 960 conjuntos de sondas foram encontrados para ser significativamente regulada para cima (701 genes anotados) e 1006 foram significativamente regulada para baixo (711 genes anotados) maior que 2 vezes (p≤ 0,05) entre as células MOSE-L MOSE-e e. Destes 1966 mudando conjuntos de sondas, 58,9% não apresentaram qualquer alteração significativa nos níveis de expressão durante a progressão entre MOSE-E e MOSE-I, indicando que a maioria das alterações na expressão de genes estão associadas com eventos posteriores na progressão maligna no nosso modelo, com 608 aumentar e 549 diminuindo à medida que as células transição de MOSE-I para Mose-L. Por outro lado, 33,3% dos genes afetados mostrou um aumento progressivo (conjuntos 272 de sonda) ou diminuir (conjuntos 382 de sonda) na expressão como células transição de MOSE-E para Mose-I para Mose-L células (Figura 1). Um pequeno número de conjuntos de sondas afectados, 3,9%, demonstraram proporções MOSE-I /MOSE-E que estavam dentro de 0,4 vezes de MOSE-L rácios /MOSE-E, o que indica que estas alterações de expressão de genes podem ser associados a eventos precoces nas maligna progressão das nossas células. Em conjunto, estes dados indicam que a maioria das mudanças nos níveis de expressão de genes quer ocorrem continuamente, de forma gradual, ao longo da evolução do nosso modelo ou se desenrole em fases posteriores, enquanto apenas uma mudança subconjunto limitado durante os estágios iniciais. O conjunto de dados completo pode ser encontrado na base de dados GEO (GSE24789).

De 45,102 conjuntos de sondas analisadas, 970 foram significativamente (p≤0,05) regulado para cima (A) e 1006 foram regulados negativamente (B ) maior do que duas vezes. As setas indicam padrão de expressão muda com o número de conjuntos de sondas indicadas ao lado da seta. conjuntos de sondas indicados como outros não seguiu os padrões descritos.

Over-representados gene Categorias de ontologias na progressão do câncer de ovário

Para detectar caminhos que podem contribuir para a promoção e progressão do ovário cancro, o programa Gene fuga foi utilizado para identificar as categorias funcionais de genes que demonstram alterações estatisticamente significativas nos seus níveis de expressão entre as células MOSE-L-e e MOSE. Gene Trail é uma ferramenta de análise conjunto de genes de enriquecimento avançado que determina sobre-representados categorias ontologia gene em conjuntos de dados [13]. A sobre-representados componente celular, processo biológico, e moleculares do gene categorias ontologia função encontrada na MOSE-l, em função conjuntos de genes diferencialmente expressos MOSE-E listados na Tabela 1 (p 0,01). Sobre-representação dos genes nas categorias do ciclo celular e proliferação celular foi antecipada devido ao aumento da taxa de crescimento anteriormente relatados das células MOSE-L [12] e o envolvimento da proliferação descontrolada de células no câncer [14]. Curiosamente, o citoesqueleto e categorias de ligação de ião metálico /Cation representado um número significativo dos genes expressos diferencialmente, com uma sobreposição substancial dos genes categorizados em ambas as categorias ontologia. No entanto, em contraste com a ampla gama de funções dos genes na categoria de ligação de ião metálico /catiónica, genes compilados na categoria ontologia gene citoesqueleto eram funcionalmente muito específica. Uma vez que se pensa que as alterações nos níveis de proteínas do citoesqueleto e os seus reguladores de expressão estão associados com a progressão e metástase [15], [16], [17], as alterações nos genes envolvidos na estrutura e regulação do citoesqueleto durante a progressão de nosso modelo MOSE foram objecto de uma investigação mais aprofundada.

desorganização do citoesqueleto celular durante a progressão maligna

citoesqueleto de actina.

dos 141 genes categorizados dentro do citoesqueleto gene categoria ontologia, 90 têm produtos de genes que são subunidades de filamentos de actina (Tabela 2) ou estão envolvidas na organização e regulação do citoesqueleto de actina (Tabela 3; lista completa no quadro suplementar S1). Para a maioria desses genes, os níveis de expressão mudou gradualmente de uma forma faseada como células a transição de MOSE-E para Mose-I para Mose-L, indicando que estas mudanças estão ocorrendo continuamente ao longo progressão. Apenas três genes, γ-actina 1, Formin 1, e drebrin 1, demonstrou índices MOSE-I /MOSE-E que estavam dentro de menos de 0,4 vezes maior de MOSE-L rácios /MOSE-E, sugerindo estas são alterações precoces na progressão maligna (Tabela 2 e 3). Sete genes, incluindo integrina aV, -β1, e -β2, mostrou níveis de expressão que mudou pela maior magnitude em células MOSE-I, duas das quais foram confirmadas por qRT-PCR (Tabela 2 e Tabela 3). Um grande número destes genes são desregulado no cancro ou envolvidos em metástase incluindo todos os 15 genes que foram confirmados por qRT-PCR (Tabela 2 e 3).

Os produtos do gene de um subconjunto de genes confirmados por qRT-PCR foram também analisadas por western blot, bem como microscopia de imunofluorescência para determinar potenciais diferenças na sua localização subcelular. Os resultados de microarray indicaram uma diminuição progressiva da α-actina e ARNm γ-actina, que foi confirmado por qRT-PCR (Tabela 2), no entanto, não foram observadas alterações de β-actina. Isto correspondeu a uma diminuição nos níveis de proteína total de actina durante a progressão (Figura 2A). Além disso, o exame da arquitectura F-actina por microscopia de imunofluorescência revelou diferenças distintas da organização da actina subcelular. células MOSE-E exibiu longa e bem definida fibras de stress de cabo-like após coloração com Alexa Fluor

488 faloidina conjugada, enquanto as células MOSE-L malignas exibido estruturas F-actina menos distintas e organização. (Figura 3A, 1

coluna st). Em células MOSE-L, estruturas de actina variou de fibras de stress fina pequenas para zonas proeminentes “babados”, com filamentos de actina muito curtos, que lembram podosomes (Figura 3A e 3B, confocal imagem 2 inserção). Digno de nota, o MOSE-I exibiram F-actina desorganização semelhante ao de células MOSE-L (Figura 3A). Para comparar especificamente conteúdo F-actina celular entre linhas celulares MOSE, foi empregado um procedimento baseado na phalloidin conjugado fluorescente. Como mostrado na Figura 4, F-actina celular total foi reduzida em 78% (p 0,01). Em células MOSE-L em comparação com células MOSE-E, confirmando qRT-PCR e resultados ocidentais

Os extractos celulares totais de MOSE-e (e, barras brancas), MOSE-I (I, barras cinzentas), e MOSE-G (G, barras pretas), as células foram submetidas a análise de mancha de Western com anticorpos dirigidos contra as proteínas que regulam a actina (a) e ( proteínas B) microtúbulos. Os níveis de expressão são expressos como percentagem MOSE-E níveis normalização para a proteína ribossómica L19 (RPL19) ou γ-tubulina por três repetições biológicos realizados em duplicado ± o desvio padrão. Uma mancha representante das três repetições biológicas é mostrado. * P≤ 0,01.

(A) coloração de imunofluorescência de MOSE-E, MOSE-I e células MOSE-L para visualizar os filamentos de actina (phalloidin, verde), tubulina α- (2

nd coluna), tubulina β- (3

colunas rd) ou citoqueratina (4

th coluna), juntamente com o núcleo (azul, DAPI). (B e C) coloração tripla de células MOSE-L MOSE-E e com DAPI (azul), faloidina (F-actina, verde), e anticorpos contra α-actinina (vermelho, B) ou vinculina (vermelho, C). As imagens confocais mostrados são de 0,6