Abstract
As microcistinas são inibidores potentes da fosfatase e toxinas celulares. Eles exigem transporte ativo por OATP1B1 e OATP1B3 transportadores para a absorção em células humanas, ea alta expressão desses transportadores no fígado é responsável por sua toxicidade hepática seletiva. Vários tumores humanos têm demonstrado ter níveis elevados de expressão de OATP1B3 mas não OATP1B1, o principal transportador em células do fígado. Nossa hipótese é que as variantes de microcistina poderia ser isolados que são transportados preferencialmente por OATP1B3 relação ao OATP1B1 para avançar como agentes anticancerígenos com toxicidade hepática clinicamente tolerável. microcistina variantes foram isoladas e testadas quanto à citotoxicidade em células cancerosas estavelmente transfectadas com OATP1B1 e OATP1B3 transportadores. Microcistina variantes com foram encontrados OATP1B1 citotóxico /OATP1B3 IC
50 índices que variaram entre 0,2 e 32, o que representa um intervalo de 150 vezes na seletividade transportador. Como estrutura de microcistina tem um impacto significativo sobre a selectividade do transportador, é potencialmente possível o desenvolvimento de análogos com ainda mais pronunciada seletividade OATP1B3 e, assim, permitir o seu desenvolvimento como drogas anticâncer
Citation:. Niedermeyer THJ, Daily A, Swiatecka-Hagenbruch M, Moscow JA (2014) selectividade e potência de microcistina aparentados contra OATP1B1 e OATP1B3 Expressando células cancerosas. PLoS ONE 9 (3): e91476. doi: 10.1371 /journal.pone.0091476
editor: Matias A. Avila, Universidade de Navarra Escola de Medicina e Centro de Investigação Médica Aplicada (CIMA), Espanha |
Recebido: 19 de Dezembro 2013; Aceito: 13 de fevereiro de 2014; Publicação: 10 de março de 2014
Direitos de autor: © 2014 Niedermeyer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte por DanceBlue, um esforço do estudante-run que suporta cuidados clínicos e de investigação em oncologia pediátrica na Universidade de Kentucy, e em parte pelo Ministério Federal Alemão de Economia e Tecnologia (KF2766301SB0). acesso aberto publicação é apoiada pela Deutsche Forschungsgemeinschaft e Open Fundo de publicação de acesso, da Universidade de Tuebingen. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Timo Niedermeyer e Monika Swiatecka-Hagenbruch são funcionários da Ciano Biotech GmbH. Não existem produtos comercializados a declarar. Ciano Biotech GmbH deu permissão para publicar o manuscrito. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
As microcistinas (MCs) são heptap�tidos cíclicos produzidos por vários gêneros de cianobactérias tais como
Microcystis
,
Oscillatoria
,
Planktothrix
,
Nostoc
, e
Anabaena
. Elas podem ser consideradas entre os metabólitos secundários de cianobactérias mais bem estudados [1] – [4]. A característica estrutural comum de microcistina é uma sintase de policétido de aminoácidos derivada com o acrónimo “Adda”, (2S, 3S, 8S, 9S) -3-amino-9-metoxi-2,6,8-trimetil-10-phenyldeca- 4,6-dienóico, que é também um dos dois subestruturas obrigatórias para a fosfatase de serina potente proteína /treonina (PP) e um PP2A inibição observados para os microcistina [5] – [9]. Não é apenas a biossíntese destes compostos por sintases de policétido e sintetases de péptidos não ribossómicos notavelmente bem compreendida [10] – [12], mas também mais do que 90 membros individuais desta família composto quimicamente altamente diversificada têm sido descritas na literatura científica a data (Fig. 1) [13] – [56]. Particularmente propensas a variação são os L-aminoácidos situados nas posições 2 e 4 do backbone MC. compostos relacionados são os nodularins, encontrados em
Nodularia
sp, que também contêm Adda, mas são pentapeptides cíclicos em vez de heptap�tidos (Fig. 1) [57] -.. [60]
A prevalência de resíduos encontrados dentro de microcistinas (esquerda) e nodularins (à direita) é proporcional ao tamanho da fonte do respectivo resíduo. Os dados utilizados para gerar este valor é depositado no https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.880756.
Sendo potentes de proteína serina /treonina fosfatase inibidores, microcistinas e nodularins ter um profundo efeito sobre a sinalização celular e a manutenção do citoesqueleto, conduzindo à morte das células afectadas [61], [62]. No entanto, as relativamente grandes e anfifílicos MCs são incapazes de atravessar as membranas das células por difusão passiva. Em vez disso, eles contam com captação ativa por células. Três membros do ânion transporte de polipeptídeos (OATP) familiar orgânica é capaz de mediar essa absorção de MCs, ou seja, OATP1B1, 1B3 e 1A2 [63], [64]. OATP1B1 e OATP1B3 são os transportadores microcistina mais eficientes, e, como nos seres humanos saudáveis ambos os transportadores se encontram exclusivamente para ser expresso em tecido do fígado [64], [65], microcistina e nodularins são conhecidos por causar dano hepático grande [66] – [68 ]. Assim microcistinas tornou-se famoso como hepatotoxinas causando danos aos seres humanos e gado quando estes compostos acumulado em fontes de água potável durante tempos bloom de algas de água [69], [70]. Inibidores destes transportadores OATP melhorar a hepatotoxicidade de microcistina e nodularins [68], [71], [72]. Em contraste com OATP1B1, que é expresso em hepatócitos em todo o lobo hepático, localização OATP1B3 é restrita em torno da veia central [64]
OATPs estão actualmente em discussão como alvos para a terapia do cancro [73] – [76]. . Mais interessante, OATP1B3, mas não OATP1B1, foi encontrada para ser funcionalmente expressos em vários tecidos de cancro, especialmente tumores do cólon, mas também tumores da mama, tumores do pulmão, do pâncreas e tumores hepatocelulares [75], [77] – [79] . Como a toxicidade diferencial de microcistina naturais variantes em linhas celulares que expressam tem sido observada quer OATP1B1 ou OATP1B3 [78], [80], estas descobertas levantou a questão de saber se microcistina pode ser adequado como conduz para fármacos contra estes tipos de cancro, e se houver microcistina entre os mais de 90 variantes conhecidas que são selectivamente transportadas por OATP1B3 relação ao OATP1B1. A selectividade que favorece OATP1B3 sobre OATP1B1 deve conduzir a uma diminuição da depuração hepática e aumento da absorção de MCs em tumores que expressam OATP1B3, a criação de uma janela terapêutica do respectivo composto, diminuindo a taxa de depuração hepática e toxicidade. MCs são interessantes como novos estruturas de chumbo, porque eles têm um mecanismo de acção ainda não utilizado, mas actualmente discutido para a terapia do cancro (a inibição da fosfatase) [81] – [83], e em contraste com a maioria dos fármacos anti-cancro actualmente disponíveis, eles precisam activa transporte em células e, assim, poupar todos os tecidos não expressar as OATPs mencionados.
Nós isolamos vários congéneres microcistina de cianobactérias do gênero
Microcystis
,
Planktothrix
, e
Nodularia
para testar a hipótese se diferentes seletividades transportador pode ser atingível. Como ferramentas para testes de selectividade, células HeLa e células de cancro do colo do útero RKO cancro do cólon estavelmente transfectadas com vectores de expressão para OATP1B1 e 1B3 foram utilizados. No presente manuscrito, os resultados de ensaios de MCs isolado nestas linhas celulares são descritos. Os determinados IC
50 valores, bem como as diferenças de seletividade observados mostram claramente que pequenas diferenças estruturais do MCs testado de fato ter um impacto significativo sobre a selectividade transportador e potência citotóxica.
Resultados e Discussão
os aminoácidos (AA) composições do mcs testadas estão resumidas na Tabela 1
as estruturas dos compostos afins microcistina foram determinadas com base em HRMS em tandem [51], [52], [84 ], apoiado por espectroscopia
1H- e COSY-NMR. Todos os MCs conter a porção Adda característica na posição 5 e d-Ala na posição 1 da molécula. Apenas um dos isolados congéneres apresenta um
O
-methylated d-iso-Glu em vez de d-iso-Glu na posição 6 (22). d-iso-β-MeAsp e d-iso-Asp na posição 3 são quase igualmente distribuído, como são MDHA e Dhb na posição 7. Os L-aminoácidos na posição 2 compreendem Leu, Tyr, Arg, HTY, Hil (ordem decrescente de contagem), na posição 4 Arg, Tyr, Trp, Phe, FAT, e Har são encontrados. Além de 22 variantes mc, nodularina (23), como um Adda contendo pentapéptido cíclico, bem como o ácido ocadaico (24) como um inibidor de PP não relacionados estruturalmente-MC foram testados.
Os valores de CI50 de todos os isolados MCs contra OATP1B1- e linhas de células HeLa que expressam ou RKO OATP1B3 foram determinados. Os resultados são mostrados na Tabela 2.
Curiosamente, marcadas diferenças de tanto a potência e a selectividade do indivíduo congéneres MC pode ser observada.
Selectividade
enquanto que a substituição de d-iso-β-MeAsp
3 para d-iso-Asp
3 (por exemplo, compostos 1/2 e 13/14) parece não ter uma influência significativa sobre nem a potência nem a seletividade, a influência do presença de qualquer MDHA
7 ou (
e) Dhb
7 (por exemplo, 3/4, 5/6, 8/9 e 14/15) é ambígua: Enquanto no caso de 3/4 e 5/6 substituição de MDHA
7 para (
e
) Dhb
7 levam a um aumento acentuado na seletividade para OATP1B3 sobre OATP1B1, não foi observado este efeito para 8 /9 e 14/15. Como os seis compostos menos OATP1B3 seletivos (1, 2, 3, 5, 7, 23), todos apresentam MDHA
7 ou Mdhb
7 while (
E
) Dhb
7 é encontrados em 3 dos 6 a maioria dos compostos OATP1B3 seletivos (4, 10, 12, 15, 16, 18), é provável que (
E
) Dhb
7 tem uma influência na seletividade, mas é não é a única característica estrutural que confere selectividade.
com efeito, em especial os resíduos de aminoácidos nas posições 2 e 4 do núcleo da estrutura MC parecem ser importantes tanto para a potência e a selectividade. Enquanto 80% dos compostos mais selectivos OATP1B1 apresentam Leu na posição 2, este aminoácido é completamente ausente na maioria dos compostos selectivos OATP1B3. No entanto, também é encontrado Leu na posição 2 de vários congéneres que são fracamente selectiva OATP1B3 (6, 8, 9), assim Leu sozinho não faz um OATP1B1 composto selectivo. Arg na posição 2 parece induzir OATP1B3 seletividade, enquanto Arg na posição 4 não tem qualquer influência sobre a selectividade. Isso é óbvio, com os compostos 13 e 16, em que a troca dos aminoácidos nas posições 2 e 4 tem um enorme impacto sobre a selectividade. Arg em combinação com os aminoácidos aromáticos Phe, Tyr, e HTY monómeros são proeminentes encontrados em compostos selectivos OATP1B3. Especialmente combinações de Arg
2 e Phe
4 (12) ou Arg
2 e Tyr
4 (16) parece conferir OATP1B3 seletividade. Mas, novamente, a presença de Arg na posição 2 não parece ser obrigatória para selectividade OATP1B3 (4).
Curiosamente, o pentapéptido nodularina (23) é o mais OATP1B1 selectiva de entre os compostos que contêm Adda examinados.
Potência
a potência de morte celular induzida por MC no sistema de ensaio utilizado para este estudo tem duas facetas. Por um lado, a toxicidade dos congêneres MC depende da extensão da sua inibição PP [85]. Por outro lado, a potência está de acordo com o transporte de capacidade do respectivo OATP. Estes dois efeitos não foram distinguidas no presente estudo. Enquanto alguns estudos anteriores sugerem que
in vitro
e
in vivo
toxicidade estão relacionados com a inibição enzimática, em vez de transportes [78], [85], outros relatórios mostram inibição PP comparável de diferentes congéneres de microcistina , o que implica que as diferenças de transportes contribuir para a
in vivo
toxicidade [80], [86].
Não surpreendentemente, 22, com
O
-methylated d-iso- Glu
6, é um dos compostos menos potentes. Modificações do ácido carboxílico livre do Glu são susceptíveis de conduzir a uma perda de eficiência devido à perda de interacção com uma arginina carregado positivamente no centro activo das fosfatases de proteínas [7], e Glu (OMe) contendo congéneres foram encontrados para inibir a PP1, em muito menor grau do que contendo MCs análogas Glu [87] e têm menor
in vivo
toxicidade [26]. Curiosamente, também 10, 11 e 21 exibido toxicidade mais fraca do que a maioria dos outros congêneres. Enquanto 10 inibe a PP2A cerca de vinte vezes mais fraca em comparação com um [78], [80], [85], [86], a sua toxicidade no presente ensaio é de cerca de 500 vezes menor. Isto indica que, no caso de 10 (e igualmente o seu análogo 11), é provável que a toxicidade não é apenas uma questão de PP eficiência inibição, mas também da capacidade de transporte da OATP, como MC-RR é um dicatião sob condições fisiológicas e, portanto, menos provável de ser transportados através das membranas celulares por transportadores de aniões. Em geral, a citotoxicidade em nosso ensaio não se correlaciona com a potência de inibição da proteína fosfatase, como descrito na literatura para os compostos 1, 2, 6, 7, 8, 9, 10, 13, 18, 19, 20, 23 [56], [ ,,,0],78], [80], [85], [86]. Nossos dados indicam, portanto, que as diferentes eficiências de transporte tem um impacto maior no
In vivo
toxicidade do que diferindo potência de inibição da proteína fosfatase.
Curiosamente, os MCs mais potentes, com IC
50 valores o intervalo de sub-nanomolar (5, 6, 7, 8, 17, 18, 19), todas as combinações de características de ambos Leu
2 e Tyr /Phe /Trp
4 ou Tyr /FAT
2 e Tyr /FAT
4. Arg está ausente dos congéneres mais potentes. Os congéneres potentes menos com IC
50 valores 100 nM (10, 11, 21, 22), todos possuem quer Tyr
2 e Arg /Har
4 ou Arg
2 e Arg
4. Presença de Arg, em geral, diminui a potência, mais uma vez apoiando a hipótese de que a carga positiva resíduos Arg prejudicar a eficiência dos transportes, além de reduzir a inibição PP2A, e, portanto, menor
in vivo
toxicidade.
Resumo e conclusões
no nosso rastreio de 23 variantes MC naturais, temos encontrado vários MCs com um IC
50 na faixa de baixa nanomolar e com seletividade transportador que favorece OATP1B3 sobre OATP1B1 por um fator de até trinta. Embora a presença de Arg em geral, reduz a potência de MC citotoxicidade, a sua presença na posição 2 da estrutura do núcleo MC também parece ser importante para a selectividade OATP1B3, o que implica que este transportador pode ser mais tolerante à natureza catiónica de Arg sob condições fisiológicas que OATP1B1. Além disso, a presença dos aminoácidos aromáticos ligeiramente ácidas Tyr ou HTY na posição 4 para além de Arg na posição 2 parece ser benéfica para a selectividade OATP1B3.
São necessários estudos adicionais para discriminar se as diferenças observadas na potência são devidos a diferentes inibição PP ou capacidade de transporte diferente da OATP. No entanto, os resultados anteriores sugerem que
in vivo
toxicidade é dependendo principalmente cinética de transporte PTAO do que nas diferenças de inibição PP [80], [86].
Embora as relações estrutura-actividade deduzidas são ambíguas em partes, as características estruturais observadas para a seletividade OATP1B3 podem ser condensados ao actualmente mais provável seletiva estrutura geral ciclo (D-Ala
1-l-Arg
2-D (Me) Asp
aminoácido 3-l-aromático
4-Adda
5-d-Glu
6 – (
E
) Dhb
7). Esta estrutura geral pode ser utilizado como um ponto de partida para a geração de novos compostos e.g. pela alimentação precursor ou estratégias biocombinatorial
Um desafio de usar MCs como droga leva ainda permanece:. Mesmo com variantes seletivos MC, a toxicidade do fígado pode ainda ser um desafio significativo, tornando-se necessário para gerar variantes MC que poderiam ser metabolicamente desintoxicados por células saudáveis do fígado e /ou eficiente effluxed na bile e, assim, tirar partido dos mecanismos de desintoxicação e eliminação hepática que não seriam encontrados em tumores.
materiais e Métodos
cianobactérias material
Vários
Microcystis aeruginosa
e
Planktothrix rubescens
estirpes, bem como um
Nodularia
tensão têm sido utilizados para produzir os congéneres microcistina estudados: 2 e 3,
Microcystis aeruginosa
CBT 265; 4 e 15,
Planktothrix rubescens
CBT 310; 5, 16 e 17,
Microcystis aeruginosa
CBT 850, 6, 9, 18, 19, e 20,
Planktothrix rubescens
CBT 862, 11,
Planktothrix rubescens
CBT 329, 12,
Microcystis aeruginosa
CBT 861, 14, 21 e 22,
Microcystis aeruginosa
CBT 480, 23,
Nodularia
sp. TCC 786. As amostras foram classificadas com base na análise por PCR e sequenciação de vários genes marcadores, bem como a sua morfologia, e foram depositados na colecção Ciano Biotech (TCC) de cultura sob os números de adesão acima indicados (Ciano Biotech, Berlim, Alemanha). As estirpes foram cultivadas em meio BG11 [88] a 20 ° C sob luz contínua (60-80 umol m
-2 s
-1) em 20 L fotobiorreactores e escala semi-colhida continuamente ao longo de um período de várias semanas.
Isolamento de microcistinas
cepas de cianobactérias foram testadas por HPLC-DAD /IT-TOF-MS (Kinetex C
18, 2,6 mm, 100 × 3 mm, Phenomenex, Torrance, EUA) utilizando um gradiente de aferição linear de solução aquosa CH
3CN (5 a 80% dentro de 25 min a 0,6 ml /min; 0,025% v /v de TFA) para confirmar a presença MC pelos seus espectros de UV característica, bem como a em tandem MS ion característica fragmento em
m /z
375 [52], [89]. cepas positivas seleccionados foram cultivados em meio BG11 [88] a 20 ° C sob luz contínua (60-80 mol m
-2 s
-1) em 20 L biorreatores foto escala. Após a colheita da biomassa e de criodessecagem, as biomassas foram ressuspensas em 50% de MeOH (v /v), tratado com uma vareta ultra-sons (Bandelin, Berlim, Alemanha) e extraiu-se num agitador para 30 min. Após a centrifugação, as biomassas foram subsequentemente extraída utilizando 80% de MeOH (v /v). Os 50% de MeOH e 80% extratos MeOH das respectivas biomassas foram combinados e secos
in vacuo
. Os extractos brutos foram fraccionados utilizando passos de gradientes de água-metanol em C
18 cartuchos em um sistema VersaFlash (Supelco, Bellefonte, EUA), e as fracções contendo MCs (monitorizada por HPLC) foram secos
in vácuo
. Após a reconstituição, estas fracções foram submetidas a HPLC semi-preparativa. Para uma descrição detalhada dos procedimentos de isolamento ver S1 Arquivo. Microcistinas RR, LW, e LF e ácido ocadaico foram obtidos a partir de Axxora, LLC (San Diego, CA), e microcistina LR e YR foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).
elucidação estrutural
as estruturas dos MCs isolados foram determinados por alta resolução espectrometria de massa tandem [51], [52], [84], e confirmada por um e bidimensional espectroscopia de RMN. As amostras para a espectroscopia de RMN foram dissolvidas em 600 ul d
6-DMSO. Os espectros de RMN foram registados a 600 MHz (
frequência 1H) num espectrómetro Bruker AV-III usando criogenicamente arrefecida sondas de 5 mm de ressonância TCI-triplos equipados com um eixo gradientes autoprotegidos. espectros DQF-COSY [90] foram gravados usando 2048 × 512 pontos de dados complexos usando 8 varreduras. Os espectros foram referenciados indiretamente ao tetrametilsilano via os sinais residuais de d
6-DMSO (2,5 ppm para
1H). dados Tandem MS foram adquiridos utilizando um HPLC acoplado a um espectrômetro de massa IT-TOF (Shimadzu Europa GmbH, Duisburg, Alemanha) com ionização electrospray no modo positivo e foram avaliadas por meio do fornecedor LCMSSolution versão de software 3.60.361 com a Fórmula Predictor versão 1.13. Para o cálculo da soma fórmulas, a massa monoisotópica média de pelo menos três verificações foi usado. Os compostos foram separados numa Kinetex C
18 coluna (2,6 mm, 100 × 3 mm, Phenomenex, Torrance, EUA) utilizando um gradiente variando de 5 a 80% de CH
3CN em água ao longo de 25 min (0,1% ácido fórmico adicionado como modificador). iões precursor correspondente a [M + H]
+ foram isoladas na armadilha de iões, fragmentado por colisão induzida dissociação (CID) usando árgon como gás de colisão (energia de colisão definida como 150%, gás de colisão para 100%, e Q ( Frequency) para 45,0 kHz), e separados no analisador TOF. varreduras de MS /MS foram calculados e convertidos para o formato mzXML usando o software do fornecedor e avaliados usando o software mMass (iões de fragmentos calculados: M, a, b, c, e Z; modificações: -H
2O, -NH
3, + CO, definidos, combinações; correspondentes com uma tolerância de 0,01 da) [91]. HRMS em tandem anotados e
RMN-1H espectros de todos os compostos isolados podem ser encontrados em S2 Arquivo.
As linhas celulares e ensaios de citotoxicidade
hepatócitos primários não são adequados para o estudo de toxicidade microcistina e transportes , como transportadores PTAO são reprimidos dentro de horas sobre as células colocando em cultura [92]. Assim as linhas celulares HeLa e RKO foram obtidas a partir de ATCC e transfectadas com vectores de expressão para OATP1B1 e OATP1B3. Os clones individuais foram isolados através de uma diluição limitante, e os clones isolados, mostrando níveis elevados de expressão através de PCR foram adicionalmente caracterizados como descrito anteriormente [72], [93]. clones HeLa e RKO individuais foram selecionados para um estudo mais aprofundado pela demonstração do aumento da captação de [
3H] -BQ123, um substrato para ambos os transportadores. Além disso, os clones OATP1B3 demonstrado aumento da captação de [
3H] -cck-8, um substrato específico para OATP1B3 mas não OATP1B1, enquanto os clones OATP1B1 não mostrou captação de [
3H] -cck-8. Além disso, as células RKO e HeLa transfectadas estavelmente com um vector de expressão vazio foram usadas como controlos. Para os ensaios de citotoxicidade, as células foram plaqueadas em triplicado em placas de microtitulação de 96 poços em meio contendo 5% de soro fetal de bovino nas densidades de 1000 células /poço. Após 24 horas, o meio contendo as variantes estruturais MC foi adicionado às células. Após mais 3 dias, a sobrevivência celular foi determinada com um ensaio baseado em sulforodamina como já descrito anteriormente [93] – [95]. Como as curvas de resposta à dose para a apoptose, causando microcistina são íngremes e descer para 0 dentro de 72 horas, o ensaio de sulforrodamina é indicativa de morte celular [72], [93]. A IC
50 foi calculada a partir da curva de resposta à dose como a concentração do fármaco que produziu uma diminuição de 50% na absorvência média em comparação com os poços não tratados e relatados como a média de pelo menos três determinações independentes efectuadas em triplicado usando o software Prism .
Informações de Apoio
arquivo S1.
Detalhes sobre o isolamento da microcistina aparentados
doi:. 10.1371 /journal.pone.0091476.s001
(PDF)
S2 arquivo.
Anotados em tandem HRMS e
RMN-1H espectros de todos os compostos isolados. Os dados de RMN cru e MS destes compostos são disponíveis gratuitamente através da Internet em https://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.880755.
doi:10.1371/journal.pone.0091476.s002
(PDF)
Acknowledgments
TN e MSH agradecer Ciano Biotech GmbH para o apoio e permissão para publicar este manuscrito. Agradecemos R. Lethaus-Weiß por sua ajuda no cultivo das cepas de cianobactérias e extraindo a biomassa, e P. Schmieder e B. Schlegel (FMP Berlin-Buch) para gravar os espectros de NMR.