Abstract

Plumbagina, um quinonóide encontrados nas plantas da Plumbaginaceae, possui propriedades medicinais. Neste estudo investigou-se a actividade anti-proliferativa e apoptótica de plumbagina, utilizando duas linhas celulares de cancro do cólon humano, HT29 e HCT15. IC50 de Plumbagina para as células HT29 e HCT15 (22,5 pM e 62,5 pM, respectivamente) eram significativamente diferentes. Para estudar a resposta de células cancerosas durante as estratégias de tratamento, as células foram tratadas com duas concentrações diferentes, 15 uM, 30 uM para 50 uM e HCT15, 75 uM para células HT29. Embora a ativação do NFkB, caspases-3, níveis elevados de

TNF-α

, citosólica citocromo C foram observadas em ambos os HCT15 células HT29 tratado com plumbagina, apoptose aberrante com diminuição do nível de pEGFR, pAkt, pGsk-3β, PCNA e ciclina D1was observado somente em 15 mM e 30 mM plumbagina tratados HCT15 e 75 mM plumbagina tratada HT29 células. Isto sugere que plumbagina induz a apoptose em ambas as células e HCT15 HT29 tratados, ao passo que, a proliferação foi inibida apenas em 15 uM e 30 uM plumbagina tratados HCT15 e 75 uM plumbagina tratados HT29 células, mas não em 50 uM plumbagina tratados HT29 células. A expressão de COX-2 foi reduzida em 75 uM plumbagina células HT29 quando tratados em comparação com 50 pM plumbagina tratada HT29 células, ao passo que as células não possuem HCT15 COX. Por conseguinte, a resistência ao observado para a indução de apoptose em 50 uM plumbagina células HT29 são tratados atribuído à expressão de COX-2. Em conclusão, plumbagina induz a apoptose em células de cancro de cólon por meio de TNF-α via mediada dependendo expressão de COX-2

citação:. Subramaniya BR, Srinivasan L, Mohammed Sadullah SS, Davis N, Baddi Reddi Subhadara L , Halagowder D, et al. (2011) Indução de Apoptose Efeito de Plumbagina em células cancerígenas do cólon Depende expressão da COX-2. PLoS ONE 6 (4): e18695. doi: 10.1371 /journal.pone.0018695

editor: Alfons Navarro, da Universidade de Barcelona, ​​Espanha |

Recebido: 17 de dezembro de 2010; Aceito: 09 de março de 2011; Publicação: 29 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Subaramaniya et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por uma bolsa da National plantas medicinais do Conselho de Administração, Governo da Índia, ao Dr. S. Niranjali Devaraj. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é uma preocupação de saúde pública primária para a humanidade e é o terceiro câncer mais comum nos Estados Unidos [1]. Dados recentes sobre o câncer colorretal é alarmante com uma estimativa de 153,760 casos de CRC incluindo 52,180 mortes em 2007 [1], [2]. A progressão de células epiteliais do cólon normais em um carcinoma colo-rectal é um processo de múltiplos passos. Apesar de haver muitos factores, tais como, perda ou mutação em genes supressores de tumor, alterações epigenética controlam a sobrevivência celular, a proliferação celular e angiogénese, a inflamação desempenha um papel crucial no desenvolvimento e progressão de CRC [3] – [8].

NF-kB é um mediador inflamatório chave envolvida na iniciação, progressão e metástase de CRC [9]. Uma variedade de promotores de tumores cancerígenos e têm sido mostrados para activar o NF-kB e a expressão constitutiva de NF-kB é frequentemente encontrada em células tumorais. Vários genes envolvidos na iniciação do tumor, promoção, e metástase são regulados pelo NF-kB, assim como a activação de NF-kB suprime a apoptose e promove a proliferação. Assim, os agentes que podem regular negativamente a activação de NF-kB, por conseguinte, teria o potencial para inibir o desenvolvimento do cancro.

Plumbagina (5-hidroxi-2-metil-1,4-naftoquinona), uma quinonóide, encontrada nas plantas das famílias Plumbaginaceae, Droseraceae, Ancestrocladaceae e dioncophyllaceae. A principal fonte de Plumbagina é a raiz de

Plumbago zeylanica

L. (também conhecido como “Chitrak”). Plumbagina tem demonstrado exercer efeitos anticancerígenos, anti-ateroscleróticos e antimicrobianos [10] – [13]. A raiz do

P. zeylanica

L. tem sido usada na medicina indiana para ~2,750 anos e seu componente possuem antiaterogênico, cardiotônico, hepatoprotetor e propriedades neuroprotectoras [11].

Sugie et al. [14] mostraram que plumbagina inibiu significativamente a carcinogênese intestinal induzida por azoximetano em ratos, sugerindo a sua actividade quimiopreventivo. Plumbagina também tem sido demonstrado induzir S-G2 /M paragem do ciclo celular através da indução de p21 (um inibidor de quinase dependente de ciclina) [15]. Estudos recentes mostraram que Plumbagina induz a apoptose através da inibição de NF-kB em várias linhas celulares de cancro incluindo leucemia mielóide crónica humana, mieloma múltiplo humano, carcinoma do rim embrionárias humanas de cancro da mama e células [16], [17]. Neste estudo, nós examinamos a atividade anti-proliferativa e apoptótica de plumbagina pelo

in vitro

modelos experimentais utilizando duas linhas celulares de cancro do cólon humano, HT29 e HCT15. Além disso, o mecanismo de actividade anti-cancro de plumbagina foi estabelecida por análise de regulação do ciclo celular e moléculas de sinalização relacionados com a sobrevivência celular e apoptose.

Materiais e Métodos

cultura celular e manutenção

cólon humano linhas celulares de tumor HT29 e HCT15 foram obtidos a partir de NCCS Pune. As células foram cultivadas em Dulbeccos Modified Eagle Médium (DMEM, Gibco BRL, Alemanha) suplementado com FBS a 10% (Sigma, EUA), 100 unidades /mL de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 10-20 ug /ml fungisone (Himedia, Índia ), pH 7,4 em 25 cm

2, frascos de cultura de tecidos (himedia, Índia) a 37 ° C sob 5% de CO

2 e 95% de ar.

Tratamento

plumbagina foi adquirido a Sigma. Uma solução de 100 mM de plumbagina foi preparada em sulfóxido de dimetilo (DMSO), armazenado em pequenas alíquotas a -20 ° C e depois diluiu-se conforme necessário no meio de cultura celular. Os estudos de dose-resposta foram realizadas para determinar a dose apropriada para a inibição do crescimento celular e a indução de apoptose.

Ensaio MTT

Sensibilidade de HT29 e células HCT15 a plumbagina foi determinada pelo MTT ensaio colorimétrico [18]. As células (1 x 10

3 por poço) foram cultivadas numa placa de 96 poços de fundo plano e incubadas durante 24 h a 37 ° C e em 5% de CO2. Ambas as linhas celulares foram expostas a plumbagina (1, 2,5 e 5 | iM, durante 24 h). As células tratadas DMSO solventes serviu como controle. As células foram então tratadas com o reagente MTT (10 ul /poço) durante 4 h a 37 ° C e, em seguida, isopropanol (100 uL) foi adicionada a cada poço para dissolver os cristais de formazano. A densidade óptica (OD) foi registada a 570 nm num leitor de microplacas. Percentagem de viabilidade celular residual foi determinada como [1- (OD de células tratadas /OD de células de controlo)] x 100.

Efeito de plumbagina em PBMC

de PBMC foi isolado a partir de sangue venoso heparinizado obtido a partir de um voluntário humano saudável por Ficoll-Paque (Histopaque 1077, Sigma Aldrich Inc., EUA) centrifugação com gradiente de densidade de acordo com o procedimento padrão [19]. (1 × 105 células /poço) As PBMC foram cultivadas em meio RPMI-1640 completo, como de costume e incubadas com plumbagina durante 48 h seguida por ensaio MTT.

análise do ciclo celular usando citometria de fluxo

Ambos HT29 e HCT15 células foram semeadas numa placa de 6 poços a uma densidade de 1 × 10

5 células por poço. As células foram tripsinizadas e colhidas por centrifugação a 1700

g

. A análise de citometria de fluxo de ciclo celular foi realizada por coloração de células permeabilizadas com iodeto de propídio (PI) para o teor de ADN. As células foram ressuspensas em PBS, fixadas com etanol a 70%, coradas com uma solução de PI (0,05 mg /PI mL, 2 mg /ml de RNase A, 0,1% Triton X-100 em PBS) e incubadas durante 30 min à temperatura ambiente (TA) em escuridão. A intensidade de fluorescência foi medida por citometria de fluxo (Becton-Dickinso) utilizando comprimentos de onda de excitação e emissão de 488 e 525 nm, respectivamente. Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

Comet ensaio

O ensaio cometa foi realizada de acordo com o método de Singh et al. (1988) [20] com pequenas modificações. HT29 e HCT15 células (5 × 10

5) foram semeadas em placas de 24 poços e expostas às concentrações desejadas de plumbagina (a concentração final de DMSO não excedeu 0,1%, os controlos foram tratados simultaneamente com 0,1% de DMSO) durante prazos especificados. Após o tratamento, as células foram sedimentadas por centrifugação a 1500 rpm. O sedimento foi ressuspenso em 60 ul de PBS (pH 7,4). 10 ul de suspensão de células foi misturado com 100 ul de 1% de agarose de baixa fusão e 75 ul desta mistura de células-agarose foi espalhada em lâminas microscópicas pré-revestidas com 1% de agarose. Uma terceira camada de 0,5% de agarose de fusão baixo (75 ul) foi aplicado sobre a camada de agarose com a suspensão de células. As lâminas foram incubadas durante 1 h em solução de lise (NaCl 2,5 M, Na2EDTA 100 mM, Tris 10 mM, 1% de Triton X-100, 1% de SDS, pH 10). Subsequentemente as células foram expostas a um tampão alcalino (NaOH a 300 mM, EDTA de dissódio a 1 mM) durante 30 min. As lâminas microscópicas foram submetidas a electroforese a 0,8 V /cm-1 durante 30 min, após o que as lâminas foram imersas em tampão de neutralização (Tris 0,4 M, pH 7,5) durante 15 min. Após a coloração com brometo de etidio (20 ug /ml) lâminas foram analisadas sob um microscópio de fluorescência (Nikon PCM-2000). Imagens de, pelo menos, 50 células de três lâminas foram analisados ​​usando o software Cometscore ™. Para foram selecionados a cada dois cometas áreas: todo o DNA celular e uma área contendo apenas a região da cabeça do cometa. Em cada selecção as densidades foram medidos e os resultados foram apresentados como momento de cauda definido como o resultado de a percentagem de ADN na cauda multiplicado pelo comprimento da cauda.

Isolamento de ARN

Para a preparação de ARN total, o fenol – foi usada tiocianato de guanidínio com base Tri Reagente (genei ™, Bangalore). Para 10

7, células de 1 ml de reagente Tri foi adicionado e lisados ​​por pipetagem repetitiva e deixada em repouso durante 5 min seguida pela adição de 200 ul de clorofórmio para a separação de fases .Vigorously agitada em vórtice durante 15 seg e deixada em repouso durante 15 min seguido de centrifugação a 12000 g durante 15 min a 4 ° C. A camada aquosa superior contendo ARN foi transferido para um tubo de microcentrífuga tratada com DEPC estéril fresco. Para isso, foi adicionado 500 uL de isopropanol frio de gelo, misturada suavemente e deixada em repouso durante 10 min e centrifugada a 12000 g durante 15 min a 4 ° C. O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento de ARN foi lavado com 1 ml de 75% de etanol em água tratada com DEPC e centrifugado novamente a 14000 g durante 10 min a 4 ° C para obter o ARN total. Este sedimento foi dissolvido em 25 ul de ARNase livre de água esterilizada por aquecimento a 55 ° C durante 20 min e armazenadas a -20 ° C até à sua utilização.

transcriptase reversa de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR)

para sintetizar ADNc, uma solução de reacção de transcrição inversa contendo 1,0 ug de ARN total na RNase /água isenta de ADNase e 1,5 ul de iniciador hexâmero aleatório (GeNeiTM, Bangalore) foram incubadas durante 10 min a 72 ° C e arrefeceu-se imediatamente. Para isso, 5,0 ul de pré-misturado 10 solução de dNTP mM (GeNeiTM, Bangalore), 3,0 ul de 10 × M-MLV tampão de transcriptase reversa (GeNeiTM, Bangalore), 1,0 ul (200 unidades /ul) de M-MLV de transcriptase inversa (GeNeiTM, Bangalore) , foram adicionados e feitos até 50 ul usando RNase água estéril /isenta de ADNase.

para amplificar o cDNA, reação em cadeia da polimerase (PCR) pronto mix (GeNeiTM, Bangalore) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. Todas as amostras de PCR foram desnaturados a 94 ° C durante 5 min antes da ciclagem e foram estendidos durante 10 min a 72 ° C a seguir ao ciclo. O ensaio de PCR utilizando iniciadores foi realizada durante 39 ciclos a 94 ° C durante 60 s, 60 ° C durante 60 s, e 72 ° C durante 60 s. Os iniciadores para GAPDH, a COX-2, TNF-α são mostrados na Tabela 1. Os iniciadores foram concebidos utilizando o software Primer3 livre disponível na https://fokker.wi.mit.edu/primer3/input.htm e sequência de ácido nucleico foi acessado https://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fci?val=Reference Tabela ID. Os iniciadores foram adquiridos a partir de tecnologias de ADN integrado, EUA. Além disso, a expressão de COX-2 e TNF-α foi analisado semi quantitativamente usando software de TI SCAN ONU.

Isolamento de proteína

Para 0,5 ml sobrenadante fenol-etanol, 3 volumes de acetona foram adicionados para precipitar as proteínas. As amostras foram misturadas por inversão durante 10-15 segundos para se obter uma solução homogénea e deixou-se repousar durante 10 min à temperatura ambiente. A proteína foi precipitada por centrifugação a 12.000 g durante 10 min a 4 ° C. O sobrenadante foi removido e sedimento disperso em 0,5 ml de cloridrato de guanidina 0,3 M em etanol a 95% com 2,5% de glicerol (V:V). Após dispersar o sedimento, mais 0,5 ml de alíquota da solução de lavagem de cloridrato de guanidina /etanol /glicerol foi adicionada à amostra e armazenado durante 10 min a temperatura ambiente. A proteína foi sedimentado a 8000 g durante 5 min a 4 ° C. A solução de lavagem foi removido e mais duas lavagens foram realizadas em 1 ml de cada uma das soluções de lavagem de guanidina /etanol /glicerol. lavagem final foi realizada com 1 ml de etanol contendo 2,5% de glicerol (V:V). A proteína foi sedimentado por centrifugação a 8000 g durante 10 min a 4 ° C e seco ao ar durante 5 min. Após breve secagem ao ar, o sedimento de proteína foi dissolvido em SDS a 1%. As concentrações de proteína de lisados ​​de células foram estimadas de acordo com Lowry et al., 1951 [21] e concentrações iguais de fracção de proteína foram corridos em electroforese em gel de sulfato de dodecilo-poliacrilamida de sódio (SDS-PAGE) e immunobloted com anticorpos específicos.

siRNA transfecção

gene COX-2 foi silenciado por transfecção de COX-2 siRNA. Numa placa de cultura de tecidos de seis bem, 2 × 10

5 células por poço, foram semeadas em 2 ml de meio de crescimento normal de antibiótico-livre suplementado com FBS. As células foram incubadas a 37 ° C num CO

2 incubadora até que as células eram 60-80% confluentes. A viabilidade celular foi avaliada antes da transfecção. Foram preparadas as seguintes soluções: Solução A: Por cada transfecção, diluiu-se 6 ul de duplex de siRNA (isto é, 0,25-1 ug ou 20-80 pmol siARN) em 100 ul de Transfection siRNA Médio (Santa Cruz, EUA). Solução B: Por cada transfecção, dilui-se 6 ul de siRNA Transfection Reagent (Santa Cruz, EUA) em 100 ul de Transfection siRNA Médio. ARNic em cadeia dupla solução (solução A) foi misturada com diluída Transfection Reagent (Solução B) e incuba-se a mistura 45 minutos à temperatura ambiente. Para cada transfecção, 0,8 ml de Transfection siRNA meio foram adicionados a cada tubo contendo a mistura de siRNA Transfection Reagent (Solução A Solução B +), misturado suavemente, sobrepostos em células lavadas e incubadas durante 5-7 horas a 37 ° C num CO

2 incubadora. Após a incubação, 1 ml de meio de crescimento normal contendo 2 vezes o (2 × meio de crescimento normal) e soro normal de concentração de antibióticos foram adicionados sem remover a mistura de transfecção. As células foram incubadas durante mais 18-24 horas. O meio foi substituído por 1 ml de meio de crescimento normal fresco, 1 × e usado para posterior ensaio.

A análise estatística

Os valores foram registados como a média de X ± desvio padrão de três experiências. Os resultados experimentais foram analisados ​​pelo Teste t de Student. P 0,00 foi considerado como o nível de altamente significado e P . 0,05 foi considerado como significância para valores obtidos para os grupos tratados em comparação com o grupo controle

Resultados

Plumbagina induz citotoxicidade em HCT15 e HT29 células cancerígenas do cólon

Empregando linhas celulares de cancro do cólon HCT15 e HT29, avaliou pela primeira vez o efeito da citotoxicidade de plumbagina por ensaio MTT. Além disso a via de sinalização Wnt aberrante em ambas as linhas celulares, células HT29, são conhecidos por expressar COX2, ao passo que as células não possuem expressão HCT15 COX2. Ambas as linhas de células eram sensíveis a plumbagina, indicando que plumbagina poderia induzir citotoxicidade de ambas as células de cancro do cólon, independentemente do estado de COX2 (Fig. 1A e 1B). No entanto, HCT15 células eram mais sensíveis a plumbagina como IC

50 às 24 horas foi de 22,5 uM, o que é significativamente menor do que a IC

50 de plumbagina tratada HT29, que é de 62,5 uM. Apenas as alterações não significativas na viabilidade de (células normais) de PBMC foram observadas mesmo in100? M de Plumbagina células (Fig. 1C)

um incubadas. Citotoxicidade efeito de várias concentrações de Plumbagina em HCT15 células

. Dose efeitos citotoxicidade dependente de Plumbagina em células HCT15 foram representados no gráfico acima. HCT15 células foram mais sensíveis ao plumbagina como IC

50 às 24 horas foi de 22,5 mM. Todas as experiências foram feitas em triplicado e expressos como a média ± DP. A signif icância é indicada como *

P 0,001

.

b. Citotoxicidade efeito de várias concentrações de Plumbagina nas células HT29

. Dose efeitos de citotoxicidade dependente de Plumbagina nas células HT29 foram representados no gráfico acima. células HT29 foram mais sensíveis a plumbagina como IC

50 às 24 horas foi de 62,5 uM. Todas as experiências foram feitas em triplicado e expressos como a média ± DP. A signif icância é indicada como *

P 0,001

.

c. Citotoxicidade efeito de várias concentrações de Plumbagina em células PBMC

. Dose efeitos citotoxicidade dependente de Plumbagina em células PBMC foram representados no gráfico acima. células PBMC foram resistência a plumbagina citotoxicidade induzida mesmo em concentração de 100 uM. Todas as experiências foram feitas em triplicado e expressos como a média ± DP. Significado é indicado como *

p . 0.001

Plumbagina inibe a proliferação de HCT15 e HT29 cólon células cancerosas

A proliferação de HCT15 células tratadas com 15? M e 30 uM de plumbagina aumentou ligeiramente às 24 h, e diminuiu significativamente em 48 h e 72 h, enquanto que as células de controlo não tratadas foram mantidas fase de crescimento exponencial. Em contraste, as células HT29 tratada com 50 uM plumbagina mostrou crescimento exponencial, semelhante ao de células de controlo não tratadas, ao passo que, o crescimento de células HT29, tratados com 75 uM plumbagina aumentou ligeiramente às 24 horas e diminuiu significativamente em 48 h e 72 h (Fig . 2A e 2B).

a. HCT15 células. b. células HT29

. Proliferação de HCT15 células tratadas com 15 mM e 30 mM de células Plumbagina e HT29 tratados com 75 mM plumbagina aumentou significativamente às 48 horas e 72 horas, enquanto que, 50? M plumbagina tratada HT29 células tendem a proliferar. Todas as experiências foram feitas em triplicado e expressos como a média ± DP. Significado é indicado como *

p . 0.001

Plumbagina induz a apoptose em HCT15 e células cancerígenas do cólon HT29

Para determinar o DNA danificando propriedades de plumbagina, HCT15 As células foram incubadas com 15 uM e 30 uM plumbagina durante 24 h, enquanto que, HT29 células foram incubadas com 50 uM e 75 uM plumbagina durante 24 h. O aparecimento de caudas de cometa correspondentes com a indução de dano do DNA eram visíveis (fig. 3). células HCT15 tratados com células Plumbagina e HT29 30 mm tratadas com 75 mM plumbagina mostraram aumento existente de danos no DNA. A extensão da cauda do cometa era dez e seis vezes maior do que as células de controlo HCT15 e 15 uM plumbagina tratada HCT15, respectivamente, ao passo que, a 50 fiM e plumbagina 75 uM – tratada células HT29 mostra quatro e dois tempo de extensão de cauda, ​​respectivamente, em comparação com células de controlo HT29. danos ao DNA não foi observada, como o halo em torno núcleos celulares era claramente visível nas células de controlo.

HCT15 células tratadas com células Plumbagina e HT29 30 mm tratadas com 75 mM plumbagina mostraram aumento existente de danos no DNA. O comprimento da cauda do cometa era dez e seis vezes o do controlo e 15 uM plumbagina tratada HCT15, respectivamente, ao passo que, a 50 fiM e plumbagina 75 uM – células HT29 tratados mostra quatro e dois tempo de extensão de cauda, ​​respectivamente, em comparação com células HT29 de controlo. danos ao DNA não foi observada, como o halo em torno núcleos celulares era claramente visível nas células de controlo.

Análise de NFkB, caspase-3 ativação e liberação de citocromo C em plumbagina incubadas células HCT15 e HT29

Activação de caspase-3, NFkB (p65) e a libertação de citocromo C citosólica foram analisados ​​por western blot (Fig. 4a). A activação de NFkB (p65) foi significativamente aumentada em ambos os 15 uM e 30 uM plumbagina – HCT15 tratados, bem como no 50 uM e plumbagina 75 uM – tratada células HT29, quando em comparação com células de controlo HCT15 e HT29. Activação da caspase-3 e níveis de citocromo C citosólica foram significativamente elevados, em ambos os 15 uM e 30 uM plumbagina – células tratadas com HCT15, quando em comparação com células não tratadas HCT15. Contudo a activação de caspase-3 e níveis de citocromo C citosólica foram elevados apenas em 75 uM plumbagina tratada HT29 células, mas não em células HT29 plumbagina tratados com 50? M.

uma. Immunoblotting análise da activação NFkB, caspase-3 ativação e citocromo C liberação

. Pista 1- Controle HCT15; Pista 2- 15 uM plumbagina tratada HCT15; Pista 3- 30 uM plumbagina tratada HCT15; Pista 4- Controle HT29; Pista 5- 50 uM plumbagina tratada HT29; Pista 6- 75 uM plumbagina tratada HT29.

b.i. análise do ciclo celular de células de controlo e HCT15 tratamento plumbagina e HT29 por citometria de fluxo

. Comparado com HCT15 controle, HCT15 tratado com plumbagina mostra aumento acentuado na fração de sub-G1 sugerindo que estas células estão passando por apoptose. células HT29 expostas a 75? M de Plumbagina sozinha exibiram aumento na fracção sub-G1 enquanto que HT29 células expostas a 50? M de fracção sub-G1 Plumbagina era muito menor.

b.ii. Os dados quantitativos de análise do ciclo celular

. Todas as experiências foram feitas em triplicado e expressos como a média ± DP. Significado é indicado como *

p . 0.001

análise do ciclo celular de controle e Plumbagina tratada HCT15 e HT29 células

HCT15 células expostas a 15 e 30 mM de Plumbagina exibiram aumento contínuo da fracção sub-G1, que pode incluir tanto a fracção apoptótica e detritos implicando juntos a extensão de morte celular. O dano foi mais aparente com 30 mM de Plumbagina. A fracção sub-G1 para o controle foi de 6,8%, enquanto que o mesmo foi 24.52 e 37.87% para 15 e 30 mM de Plumbagina tratada HCT15 células, respectivamente (Fig. 4b.i). Isto indica um aumento dependente da dose na apoptose em células por HCT15 Plumbagina. Os resultados também ilustrado acumulação associado de células na fase G0 /G1, indicando inibição do movimento de células do G0 /G1 fase para a fase S, atrasando assim ou inibir a entrada de células filhas no ciclo mitótico.

Em caso de células HT29 expostas a 75? M de Plumbagina sozinha exibiram aumento na fracção sub-G1 enquanto que HT29 células expostas a 50? M de fracção sub-G1 Plumbagina era muito menor. A fracção sub-G1 para controlo foi de 4,39%, enquanto que o mesmo foi 6,14 e 26,76% para 50 e 75 ^ M de Plumbagina tratada H29 de células, respectivamente, indicando a ocorrência de uma extensa apoptose apenas em 75 ^ M de Plumbagina tratada H29 células, quando comparado com 50 uM de Plumbagina tratada H29 células HT29 e controlar células. Os resultados também mostram que a acumulação de células na fase G0 /G1 apenas em 75 ^ M de Plumbagina tratada H29 células, causando diminuição significativa na população de S e fase G2 /M, o que indica atraso ou inibição da entrada destas células na fase de síntese e mitótico ciclo. Aumentou significativamente a população de células foram vistos em S e G2 fase /M em 50 mM de Plumbagina tratada H29 células indicando proliferação de células (Fig. 4.b.ii)

Análise de fosforilada Akt, EGFR fosforilada, PCNA e ciclina D1 em plumbagina incubadas HCT15 e HT29 células

a expressão de PCNA, ciclina D1 juntamente com a fosforilação de Akt e EGFR foram analisadas por western blot (Fig. 5). A expressão de PCNA foi diminuída em 15 uM e 30 uM plumbagina tratada significativamente – HCT15 células quando comparada com células não tratadas. diminuição significativa nos níveis de PCNA foi observada apenas em 75 uM plumbagina células HT29 tratados, mas não em 50 uM plumbagina tratada HT29 células. Diminuíram significativamente os níveis de EGFR fosforilado, Akt e GSK-3β foram observados em 15 uM e 30 uM plumbagina tratada HCT15 e 75 uM em plumbagina tratada HT29 células, quando comparado com células de controlo. Em 50 mM plumbagina tratada HT29 células, os níveis de EGFR fosforilada, Akt e GSK-3β mostrou alterações insignificantes. . Β – actina serviu como controle interno

Pista 1- Controle HCT15; Pista 2- 15 uM plumbagina tratada HCT15; Pista 3- 30 uM plumbagina tratada HCT15; Pista 4- Controle HT29; Pista 5- 50 uM plumbagina tratada HT29; Pista 6- 75 uM plumbagina tratada HT29. A expressão de PCNA, ciclina D1 juntamente com a fosforilação de Akt e EGFR foram significativamente diminuída em 15 uM e 30 uM plumbagina tratados HCT15 e 75 uM em plumbagina quando comparado com o Controle HCT15, Controlo HT29 e células HT29 tratada com plumbagina 75 uM. β-actina serviu como controle interno.

Análise do

TNF-α

e

cox-2

expressão em HCT15 e HT29 células tratadas com plumbagina

uma. b. c. d.