Sumário
microRNAs (miRNAs) são pequenas moléculas que regulam a expressão do gene posttranscriptionally. Em um estudo anterior, identificou-miR-96 a ser regulada em amostras de câncer de próstata em comparação com o tecido normal adjacente e de ser um marcador independente de recidiva bioquímica em um modelo de predição multivariada. Por conseguinte, foram investigados o papel funcional de miR-96 na carcinogénese da próstata. células de cancro da próstata LNCaP e DU145 foram transientemente transfectadas com o miR-96 precursores e alterações fenotípicas foram analisados. O miR-96 aumentou a proliferação e apoptose induzida por auditivos camptothecine nestas células. Na análise de previsão alvo FOXO1 identificados silico como potencial pró-apoptótica miR-96-alvo. miR-96 era capaz de se ligar a ambos os locais de ligações na FOXO1 UTR 3 ‘num ensaio de gene repórter de luciferase. A sobre-expressão de miR-96 em células LNCaP resultou numa expressão FOXO1 reduzida. A sobre-expressão de FOXO1 induziu um forte fenótipo apoptótico que foi parcialmente resgatados por co-expressão de miR-96. RT-qPCR e imuno-histoquímica de 69 espécimes de cancro da próstata revelou uma regulação negativa da FOXO1 e uma correlação inversa de miR-96 e proteína FOXO1 expressão. Em conclusão, mostramos que miR-96 pode regular a apoptose no câncer de próstata, inibindo o fator de transcrição FOXO1
Citation:. Fendler A, Jung M, Stephan C, Erbersdobler A, Jung K, Yousef GM (2013 ) A função anti-apoptótica de miR-96 em cancro da próstata por inibição da FOXO1. PLoS ONE 8 (11): e80807. doi: 10.1371 /journal.pone.0080807
editor: Kin Mang Lau, da Universidade Chinesa de Hong Kong, Hong Kong
Recebido: 21 Janeiro, 2013; Aceito: 16 de outubro de 2013; Publicação: 19 de novembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Fendler et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O trabalho da FA e KJ foi financiado pela Fundação para a Urologic Research, Berlim ea Sonnenfeld Stiftung, Berlim. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
MicroRNAs (miRNAs) são uma nova classe de pequenos RNAs não-codificantes e regular a expressão do gene posttranscriptionally através da inibição da tradução, mas também através da degradação de ARNm correspondente. Aproximadamente 30% de todos os ARNm são previstos para ser alvo de miARNs [1]. Dependendo de suas metas, miRNAs função como tumorsupressors ou oncogenes, controlando principais vias de carcinogênese, incluindo proliferação celular, apoptose e motilidade celular [2].
O câncer de próstata (PCA) é o tumor maligno mais comum em homens ea segunda principal causa de câncer no mundo ocidental [3]. Mecanismos de CaP tumorigênese ainda não são totalmente elucidada e há uma falta de marcadores de diagnóstico e prognóstico.
A desregulamentação dos miRNAs no CaP tem sido comprovada por vários estudos [4-9]. Sua expressão se correlaciona com o estágio do tumor e agressividade [10]. Temos anteriormente identificados miR-96 em um conjunto de miRNAs desregulados em CaP. Sua expressão está correlacionada com a pontuação de Gleason e é um marcador independente de recidiva bioquímica [6].
Na previsão alvo silico usando miRecords identificados FOXO1 entre outros como um alvo putativa de miR-96. FOXO1 é um membro dos factores de transcrição forkhead box. Exerce a sua função de regular a transcrição tumorsuppressive através dos reguladores importantes de ciclo celular e apoptose [11,12]. FOXO1 actividade de transcrição é regulada por meio da via PI3K /AKT [13]. Em cancros da mama e do endométrio, bem como linfomas de Hodgkin FOXO1 tem sido mostrado previamente para ser regulada por miR-96 [14-16].
A hipótese que miR-96 também pode ter uma função oncogénica em CaP. Para provar esta hipótese, nós (a) estudaram a influência do miR-96 expressão das características celulares fundamentais tais como a proliferação, apoptose e migração em linhas de células APC, (b) realizado em previsão alvo silico, (c) estudaram a ligação do miR- 96 a locais previstos de ligação na FOXO1 UTR 3 ‘e alterações subsequentes no ARNm e os níveis de proteína, (d) estudaram o salvamento da apoptose induzida por FOXO1 por miR-96 e (e) correlacionaram o miR-96 de expressão com transcrição FOXO1 e proteínas expressão em CaP humano e do tecido normal adjacente correspondido. Nós mostramos que o miR-96 inibe a apoptose induzida por camptotecina e regula a expressão FOXO1 por ligação ao 3’-UTR. Nos espécimes APC, identificamos uma correlação negativa dos níveis de proteína FOXO1 e miR-96 expressão.
Materiais e Métodos
Os tecidos e linhas celulares
amostras de tecidos normais e malignas emparelhados de 69 pacientes CaP foram coletadas após prostatectomia radical entre 2001 e 2005 no Hospital Universitário Charité. Para cada paciente dados clinico-patológicos foram recolhidos (Tabela 1). O estudo denominado “microRNAs como assinaturas de diagnóstico e prognóstico em tumores urológicos” (EA1 /153/07) foi aprovado pelo conselho de ética do Hospital Universitário Charité e consentimento informado por escrito foi obtida.
Pacientes para RT-qPCR (N = 69)
pacientes para análise TMA (N = 64)
N (%)
N (%)
idade, anos Median6363Range50-7246-74Pre-operatório PSA
a, ng /mlMedian7.076.24Range1.71-41.92.00-26.0T estágio
apT2a2 (3) 1 (2) pT2b11 (16) 3 (5) pT2c30 (43) 39 (61) pT3a20 (29) 18 (28) pT3b6 (9) 3 (5) estágio N
apN0 /pNx67 (97) pN12 (3) M estágio
AM0 /Mx69 (100) M10 (0) Surgical marginsR041 (60) R127 (39) Rx1 (1) Gleason score53 (4) 1 (2) 620 (29) 24 (37) 728 (41 ) 27 (42) 811 (16) 8 (12) 97 (10) 3 (5) 100 (0) 1 (2) Follow-up, a recorrência monthMedian50.0035.63Range1-930-86Biochemical
a10 ( 15) 12 (19) Tabela 1. características dos tumores e os dados clinico-patológico de coortes de pacientes.
aBiochemical recidiva foi definida como o primeiro PSA pós-operatório de maior do que 0,1 ng /ml, tal como foi confirmado por, pelo menos, um valor de aumento subsequente ( aumento PSA persistente) depois de atingir PSA indetectável no pós-operatório, definido como um limite de detecção inferior a 0,04 ng /ml.RT-qPCR, quantitativo em tempo real PCR, TMA, tissue microarray, PSA, antígeno específico da próstata, estágio T, estágio do tumor, N fase, fase de metástases linfáticas, M palco, metástases palco. CSV Transferir CSV
Os tecidos foram congelados imediatamente após a cirurgia e as amostras como descrito anteriormente [6]. Resumidamente, as áreas de tumor e tecido normal foram identificados pela coloração de hematoxilina-eosina por um patologista e soco-biópsia com uma agulha de arranjo de tecido-micro. Apenas núcleos com conteúdo do tumor, pelo menos, 90% foram consideradas para análise adicional.
LNCaP, DU-145, PC3 e células 22rv-1 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), com suplemento de 10% de soro de vitela fetal e penicilina /estreptomicina. As células foram cultivadas num incubador a 37 ° C em 5% de atmosfera de CO2. Células BPH-1 foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 20% de soro de vitelo fetal, 20 ng /ml de DHT, 5 ug /ml de transferrina, 5 ng /mL de selenite de sódio e 5 ng /mL de insulina. As linhas de células foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (ATCC) ou a Colecção Alemã de Microrganismos e Culturas Celulares (DSMZ). As linhas de células são periodicamente monitorizados quanto a contaminação mycoplasmic por RT-qPCR de acordo com van Kuppeveld et al [17]. Além disso, a identidade das células cancerosas da próstata foi verificada pelo Cancer Consortium alemão próstata.
Tissue Microarray
tecido fixado em formalina, embebidos em parafina de 64 pacientes foi usado para a construção de um tissue microarray tal como descrito anteriormente [18]. Hematoxilina-eosina foi realizada para identificar áreas malignos e benignos. As áreas de interesse foram perfurar-biopsiados com uma agulha tissue microarray 1,5 mm e transferido para o bloco receptor. Cada tumor foi representado por um núcleo. tecido normal de próstatas cólon, pâncreas, rim e 2 e do tecido conjuntivo foi utilizado como controle.
isolamento do RNA
RNA total a partir de tecido e culturas de células congeladas frescas foi isolado utilizando o miRNeasy Minikit (Qiagen , Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante, conforme descrito anteriormente em detalhe [6].
para a extracção do ARN total a partir de cultura de células, as células foram semeadas em placas de 6 poços numa concentração final de 3 x 10
5 células por poço e foram transfectadas como descrito abaixo. Após 24 horas, 1 x 10
6 as células foram colhidas em Qiazol (Qiagen).
rendimento RNA e A260 rácio /280 foram monitorados com um espectrômetro de Nano Gota ND-100 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE) e Números RNA Integrity (RIN) foram avaliados com um 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara , CA). Somente amostras de RNA com um RIN 6 foram incluídos nas análises.
quantitativos PCR
níveis de mRNA em tempo real foram analisados por RT-qPCR. ARN a partir de células foi transcrito de forma reversa utilizando a transcriptase inversa Omniscript e iniciadores oligo-dT (Qiagen) de acordo com as recomendações dos fabricantes. As reacções foram realizadas num volume total de 20 ul usando 1 ug de ARN total. As reacções foram incubadas com um Passo Um termociclador (Applied Biosystems, Foster City, CA). Quantificação de FOXO1 de linhas de células foi realizada utilizando os 2 x rápidos SYBRgreen Mastermix (Applied Biosystems) utilizando ADNc de 1 ul em 20 uL de volume total. As sequências dos iniciadores são listados na tabela S1. Os iniciadores foram concebidos para produzir uma spanning amplicon pelo menos 1 intron. Especificidade da amplificação foi assegurada por jacto de iniciadores e analisa curva de fusão.
ARNm a partir de amostras de tecido foi transcrito de forma inversa utilizando o Kit de transcriptor First Strand cDNA Synthesis (Roche, Mannheim, Alemanha) a partir de 1 ug de ARN em 20 ul de volume total de . Quantificação de FOXO1 foi realizada utilizando a sonda UPL # 11 (Roche) e Universal Sondas mestre Mastermix (Roche) em 10 uL de volume total.
miARNs foram detectados por RT-qPCR utilizando o Ensaio TaqMan miARN como previamente descrito [6 ].
Todas as amostras foram analisadas em triplicado e valor médio e SD foram calculados. FOXO1 expressão foi normalizada para TUBA1B [19], enquanto que o miR-96 foi normalizada a [6] miR-130b. As curvas padrão foram medidos para cada gene para corrigir a eficiência (FOXO1: E = 1,95; TUBA1B: E = 1,96; miR-96: E = 1,83; miR-130b: E = 1,83). A normalização foi realizada como previamente descrito [6].
Construção de vectores de luciferase
‘gene alvo sequências UTR 3 foram clonados no vector de relatório PMIR (Ambion Austin TX, EUA). As sequências alvo da UTR FOXO1 3 foram amplificados a partir de ADNc BPH1 usando AmpliTaq Gold ADN polimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA) e os iniciadores específicos do gene (tabela S1), clonado no pCR2.1-TOPO vector (Invitrogen) e amplificada em TOP10 As células quimicamente competentes (Invitrogen). O DNA de plasmídeo a partir de clones positivos foi extraída com o QIAprep spin Miniprep Kit (Qiagen) e enviado para sequenciação usando uni M13 (-21) e os iniciadores M13 rev (-29) (Eurofins MWG GmbH, Ebersberg, Alemanha). As digestões de restrição de vectores pCR2.1 positivos e os vectores de relatório PMIR foram realizadas com Saci e Spel (New England Biolabs, Ipswich, MA). inserções restritos e relatório PMIR vector foram ligados utilizando 1 U de T4 ADN-ligase (Invitrogen) e amplificado em células competentes DH5a (Invitrogen quimicamente). Os clones positivos foram identificados por PCR de colónia. O DNA de plasmídeo foi isolado usando o Kit QIAprep spin Miniprep (Qiagen).
A transfecção de linhas celulares de APC com o pré-miARNs, inibidores de miARN e o ADN plasmídico
células LNCaP e DU145 foram transfectadas com pré- precursores de miARN, inibidores anti-miARN ou pré-miR-NC # 1 (Applied Biosystems) em uma concentração final de 10 nM ou 500 ng FOXO1 comprimento completo do clone (Origene, Rockville MD, EUA) utilizando siPort NeoFX agente de transfecção (Applied Biosystems) . Para cada ensaio, um controlo sem transfecção foi realizada ao longo de. Para os ensaios de gene repórter da luciferase células foram adicionalmente transfectadas com 500 ng PMIR vector relatório e controle β-galactosidase vetor.
Ensaio
gene repórter luciferase
células LNCaP foram cultivadas a 80% de confluência e semeadas em 6 bem placas a uma densidade final de 2 x 10
5 células por poço. Quarenta e oito horas após a transfecção as células foram descoladas com um raspador e a proteína total foi extraída em 80 ul de tampão de lise (Applied Biosystems). Luciferase e a actividade β-galactosidase nos extratos foi detectada utilizando o Dual-luz combinada Reporter Gene Assay System (Applied Biosystems) de acordo com as instruções do fabricante. a expressão de luciferase foi normalizada para p-galactosidase expressão. Cada reacção foi realizada em duplicado e os resultados estão apresentados como média de três ensaios independentes.
Western Blot
Para a extracção da proteína total a partir de cultura de células, as células foram semeadas em placas de 6 poços numa concentração final de 3 x 10
5 células por poço e foram transfectadas como descrito acima. A proteína foi extraída após 72 horas em 100 de tampão NENT ul (Tris-HCl 20, 50 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 2% de NP40, 0,2% de SDS, pH 7,5) ou tampão RIPA (NaCl 150 mM, 1% de NP40, 0,5 % de desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, Tris base 50, 100 uM de PMSF, 1 ug /mL de aprotinina, 10 ug /ml de inibidor de tripsina de soja, 2 mM de EDTA). A proteína total foi resolvido em géis de 10% SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de 0,45 um polyvinyldifluoride. O Membran foi bloqueado em 2% de leite desnatado e sondados com os anticorpos seguintes: anticorpo de coelho anti-FOXO1 pAb, de ratinho anti-ACTB mAb (Sigma Aldrich, Munique, Alemanha), de coelho anti-Akt pAb, de coelho anti-pAkt Pab (Cell Signaling Technologies, Danvers, MA), e de cabra anti-coelho, conjugado com HRP ou de coelho anti-rato, conjugado com HRP secundário Ab (DAKO, Hamburgo, Alemanha). As membranas foram coradas com ECL (Pierce, Bonn, Alemanha) ou solução avançada ECL (GE Healthcare, Munique, Alemanha) durante 5 min e desenvolvido na multiimager Fluoro-S (BioRad, Munique, Alemanha). Para determinar a concentração de proteína relativa, intensidade da banda foi calculado com ImageJ 1.43r (https://rsb.info.nih.gov/ij) e normalizadas para beta-actina.
ensaio e análise de ciclo celular
Proliferação de miR-96 pré-células LNCaP transfectadas foi avaliada por conversão metabólica de 3- [4,5-dimetiltiazol-2-il] -2,5-difenil tetrazólio Bromid (MTT) (Sigma Aldrich). As células foram cultivadas até à confluência de 80% e semeadas em placas de 96 poços a uma concentração final de 6 x 10
3 células por poço e foram transfectadas, como descrito acima. As células foram deixadas em repouso durante 24 horas e subsequentemente foram privadas de soro. As culturas foram incubadas em 5 mg /mL de MTT durante 4 horas e foram lisadas em SDS a 10% em HCl 0,01 M. Os lisados foram incubados a 37 ° C durante a noite e absorvência de forma zano foi medida a 550 nm. Cada reacção foi efectuada em triplicado e os resultados estão apresentados como média de três ensaios independentes. Para análise do ciclo celular de células foram cultivadas até à confluência de 80% e semeadas em placas de 6 poços a uma concentração final de 1,5 x 10
5 células por poço e foram transfectadas, como descrito acima. As células foram deixadas em repouso durante 24 horas e foram, subsequentemente, durante 24 horas privadas de soro. As células foram coradas com /mL de iodeto de propídio 20 ug suplementado com 200 ug /ml de RNAse em 0,1% de Triton X-100 e analisadas utilizando o citómetro de fluxo FacsScan e o software CellQuest (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canadá). Cada amostra foi medida em duplicado e os resultados são apresentados como média de três ensaios independentes.
-cicatrização de feridas ensaio
Para avaliar a phenotyp migrative de células DU-145 sobre miR-96 transfecção foi realizada um ensaio de cicatrização. As células foram cultivadas até 80% de confluência, semeadas em placas de 6 cavidades e foram transfectadas como descrito acima. As células foram deixadas a crescer até à confluência e monocamada foi riscada com uma ponta de pipeta de 100 uL. Remigração de células para a ferida foi avaliado por imagens de células vida durante 24 h sob privação de soro. Percentagem de área aberta foi medida pelo programa de software TScratch [20] nos pontos de tempo definidos (0,5,10,15,20 H). Todos os valores foram normalizados para a percentagem de área aberta a 0 h. Foram analisadas duas áreas escolhidas aleatoriamente de cada zero. Os dados estão representados como a média de três ensaios independentes.
Ensaio de Apoptose
células LNCaP e DU145 foram cultivadas até à confluência de 80% e semeadas em placas de 6 poços a uma concentração final de 2 x 10
5 células por poço e foram transfectadas, como descrito acima. A apoptose foi induzida com 10 uM de camptotecina (CPT) (Sigma Aldrich) em meio livre de soro durante 24 h. As células foram coradas com anexina V-FITC (Invitrogen) e iodeto de propídio (PI) (Invitrogen) As culturas foram analisados utilizando o citómetro de fluxo FacsScan e o software CellQuest (BD Biosciences, Mississauga, ON, Canadá). Cada amostra foi medida em duplicado, e os resultados são apresentados como a média de três ensaios independentes.
A imuno-histoquímica
A imuno-histoquímica foi realizada em 2 uM lâminas da micromatriz de tecido, como descrito anteriormente [21]. Em resumo, o tecido foi desparafinados em xilol e antígenos foram demasked em uma panela de Pressur. As lâminas foram sondadas com FOXO1 coelho anti-Acm (Cell Signaling Technologies), biotinilado ligante-Ab e Ac secundário conjugado com estreptavidina (DAKO) e coradas com Fast Red com a intensidade desejada. Os núcleos foram contrastadas com haemalaun. As lâminas foram cobertas utilizando Aquatex meio de montagem (Merck KGH, Darmstadt, Alemanha). Coloração de FOXO1 foi analisada em glândulas de tumor e tecido normal adjacente, para cada paciente, se aplicável. Desde coloração geral para FOXO1 um fraco nível, foi pontuada como presente (1) ou ausente (0), apenas.
Na pesquisa alvo silico
Em silico de busca alvo de miR-96 alvos era realizada utilizando miRecords (https://mirecords.biolead.org/). Utilizou-se o critério de que um alvo putativo tinha de ser detectado por TargetScan, Miranda, PicTar e dois outros algoritmos de previsão. Localização de locais de ligação de miR-96 na 3 ‘UTR de FOXO1 foram analisados utilizando TargetScan 5.1.
Análise estatística
As análises estatísticas foram realizadas com GraphPad Prism versão 5.01 (GraphPad Software, San Diego, CA), MedCalc versão 10.3.2 (MedCalc Software, Mariakerke, Bélgica) ou SPSS 19.0 (IBM, Somers, NY). Teste t de Student, unidirecional ou bidirecional ANOVA, Kolmogorov-Smirnof teste de normalidade, teste de Wilcoxon, teste de McNemar, análise de Kaplan-Meier e Cox de risco proporcional de regressão foram realizadas. Todos os testes foram realizados dois de cauda e P-valores. 0,05 foram considerados significativos
Resultados
Caracterização funcional de miR-96
Temos relatado anteriormente que miR- 96 é regulada positivamente e prediz recidiva bioquímica em ad cancro da próstata, por conseguinte a hipótese de uma função oncogénica de miR-96 na próstata. A maior expressão de miR-96 de expressão em células cancerosas da próstata linhas em comparação com a linha celular benigna da próstata BPH-1 (Figura S1A) mais aguçado para uma função oncogénica. Para estabelecer um papel funcional de miR-96, as células LNCaP e DU145 foram transfectadas com miR-96 moléculas precursoras sintéticos ou o inibidor anti-sentido. Primeiro, avaliamos o papel de miR-96 na proliferação celular. células LNCaP e DU145 transfectadas com miR-96 apresentaram uma taxa de proliferação mais elevada em comparação com os controlos de transfecção (Figura 1A + B). Este efeito pró-proliferativo foi parcialmente revertida pela co-transfecção com o inibidor anti-sentido.
células LNCaP e DU145 foram transfectadas com 10 nM de pré-miR-96, anti-miR-96, pré-miR-NC # 1 ou combinação de pré-miR-96 e anti-miR-96. O efeito de (A) LNCaP e DU145 (B) sobre a proliferação celular em função da inanição de soro foi medida pelo ensaio de MTT ao longo de três dias. Todos os dados foram normalizados sobre a proliferação de culturas de controlo no Dia 1 e são apresentados como média (± DP) de três ensaios independentes. * P 0,05, Two-way ANOVA. transição do ciclo celular foi medida por coloração de PI em transfectadas (C) e células LNCaP DU145 (D). As células foram privadas de soro um dia após a transfecção por mais 24 horas e, subsequentemente, fixadas e coradas. Preto, G1-fase; cinza claro, fase S; cinza escuro, G2 /M-fase. Os dados são apresentados como a média de três ensaios independentes. Apoptose em CPT-tratado (E) LNCaP e células DU145 (F). 24 h após a transfecção as células foram tratadas com 10 CPT uM durante 24 h. As células foram coradas com anexina V-FITC e PI. Fracção de início (barras pretas) e (barras brancas) tardias células apoptóticas foi medida por citometria de fluxo. Os dados são apresentados como média (± DP) de três ensaios independentes. * P 0,05; Bonferroni pós-teste (P 0,001, Two-way ANOVA).
Em seguida, dirigiu-se à questão de saber se essa proliferação aumentada pode ser devido a uma liberação de controle do ciclo celular ou diminuição da apoptose. Para determinar o efeito de miR-96 na regulação do ciclo celular, o número de células LNCaP e DU145 em G1, S ou fase G2 /M foi avaliada por citometria de fluxo após a transfecção com o miR-96 em células privadas de soro. A maioria das células LNCaP foram em G1 sob privação de soro (71,0-76,7%) e as fracções mais pequenas estavam na fase S (4,8-5,3%) ou em G2 /M (18,6-23,7%, Figura 1C). Não houve diferenças significativas (Segunda-way ANOVA, P = 0,12) em transição do ciclo celular em células transfectadas com o miR-96 precursores e inibidores em comparação com os controlos. DU145 foram transição mais rápido através do ciclo celular, resultando em um maior número de células em G2 /M (30,1-34,4%) e a fase S (19,2-22,7%) e menos células em G1 (43,9-50,7, Figura 1D). Não foram observadas diferenças significativas em transição ciclo celular após transfecção, afirmando, assim, as observações em células LNCaP (Segunda-way ANOVA, p = 0,2).
Como a proliferação aumentada não pode ser explicado pelo aumento da transição do ciclo celular, foi investigado o efeito de miR-96 transfecção na apoptose. células LNCaP e DU145 foram transfectadas com pré-miR-96, miR-96 inibidores ou mexidos controle e a apoptose foi induzida com 10 mM camptotecina (CPT). CPT apoptose induzida em culturas de controlo de LNCaP com 13,2% de células apoptóticas no início e 5,6% de células apoptóticas e tardia em células DU145 (24,2% no início e 5,9% de células apoptóticas tarde) (Figura 1E + F). transfecção transiente com miR-96 precursores reduzida a fracção de apoptose precoce e de células apoptóticas tardias por 28% (LNCaP) e 25% (DU145) (Segunda-way ANOVA, P 0,001). A especificidade do efeito observado de miR-96 foram confirmadas por miR-21, que serviu como um controlo positivo [22] e exibiu uma inibição semelhante de apoptose e miR-16, que serviu como um controlo negativo e não afectou a apoptose nas células cancerosas da próstata.
Nós investigado migração de células DU-145 após transfecção com miR-96. DU-145 apresentaram um fenótipo migrative e foram capazes de migre novamente para 60% da área da ferida inicial dentro de 20 h (Figura S2). A transfecção com o miR-96 precursora ou miR-96 não teve qualquer efeito inibidor sobre a migração celular, em comparação com a transfecção com controlo mexidos ou o controlo não transfectadas (Segunda-Way ANOVA, P = 0,71).
Identificação de miR- 96 genes alvo
para identificar alvos regulados, o que potencialmente representam os efeitos apoptóticos, foi realizada in silico alvo de pesquisa em miRecords e considerada a previsão só é válida se o alvo foi identificado por Miranda, TargetScan e PicTar, e dois algoritmos de previsão adicionais. Assim, identificamos 209 metas para miR-96 (S2 tabela). O conjunto de genes-alvo previstos foi ainda analisada quanto à sua ontologia gênica (GO) termos para identificar genes relacionados com a apoptose. 21 dos 209 previstos miR-96 alvos teve um GO termo atribuído (tabela S2) relacionados com a apoptose. Nós também investigou o número de sítios de ligação e sua conservação evolutiva em TargetScan 5.1. e realizou uma pesquisa bibliográfica para identificar alvos com uma função tumorsuppressive conhecido na CaP. Uma das metas previstas, FOXO1 foi escolhido para posterior validação, devido à sua função tumorsuppressive conhecido no câncer de próstata. Correlação de miR-96 e transcrição FOXO1 expressão em células LNCaP e DU145 mostra uma correlação inversa de expressão (Figura S1A + B). O FOXO1 3 ‘UTR abriga dois 8-mer miR-96 sítios de ligação na posição 264-270 e a posição 2138-2145. Enquanto o primeiro sítio de ligação é altamente conservada, o segundo sítio de ligação miRNA não é. Construímos luciferase-repórteres que contêm longas sequências 200-300 pb envolvendo os sites de destino previstos. A cotransfecção de ambos os FoxO1 3 ‘UTR repórteres de luciferase com pré-miR-96 em células LNCaP mostraram uma redução de 40% da actividade de luciferase em comparação com o controlo de transfecção (One-way ANOVA, P 0,01), enquanto que a transfecção com o miR- 96 inibidor ou controlo scrambled não afectou significativamente a actividade de luciferase (Figura 2A). Além das sequências antisense miR-96 lançou sua inibição apenas ligeiramente. Embora o segundo local de ligação de miR-96 no FOXO UTR 3 ‘está apenas parcialmente conservada, uma actividade de ligação semelhante com a redução de 42% da actividade da luciferase (ANOVA, P 0,05) foi observada em comparação com o controlo (Figura 2B). A adição da sequência anti-sentido de miR-96 diminuiu parcialmente este efeito, enquanto que a sequência anti-sentido por si só não afectou a actividade da luciferase. A sequência de miARN mexidos resultou num pequeno, mas nenhuma inibição significativa da actividade de luciferase.
células LNCaP foram transfectadas com 10 nM de pré-miR-96, anti-miR-96, pré-miR-NC # 1 ou combinação de pré-miR-96 e anti-miR-96, bem como 500 ng relatório PMIR β-galactosidase plasmídeo controle e 500 ng PMIR plasmídeo relatório para FOXO1 3 ‘UTR a) local de ligação 1 na posição 264-270 e B) de ligação local 2 na posição 2138-2145. * P 0,05, ** P 0,01, ANOVA e teste de comparação múltipla de Tukey pós
Redução de miR-96 expressão do gene alvo in vitro
miRNAs. são sugeridos para inibir a tradução da proteína, principalmente, mas alguns miARNs também têm sido mostrados para conduzir a uma degradação pelo menos parcial do correspondente mRNA [23]. Para estabelecer o principal mecanismo pelo qual o miR-96 inibe FOXO1 em APC e para provar que a ligação mecânica de miR-96 para o 3-UTR pode resultar numa expressão diminuída do FOXO1, nós transfectadas células LNCaP e DU145 com miR-96 precursora e /ou o inibidor. miR-96 níveis em ambas as linhas de células foram de 400 vezes mais elevada nas células transfectadas miR-96 e em células co-transfectadas em comparação com as culturas de controlo (ANOVA, P 0,001; Figura 3A + B). Correspondentemente, FOXO1 ARNm foi reduzida mais de duas vezes em miR-96 células transfectadas (ANOVA, P 0,01, Figura 3C + D), enquanto que a transfecção com a sequência anti-sentido de miR-96 e a miARN mexidos mostrou nenhum efeito sobre FOXO1 Os níveis de expressão (Figura 3C + D). Adicionais para a redução da transcrição FOXO1, observou-se uma redução de 1,6 vezes e 2,6 vezes da proteína FOXO1 em LNCaP e células DU145 sobre a superexpressão ectópica de miR-96 precursora, enquanto que os níveis de proteína não foram significativamente alteradas em células transfectadas com o miR -96 inibidor ou o controlo scrambled (Figura 3E + F, Figura S3A + B). Tomados em conjunto, os dados suportam a hipótese de que o miR-96 inibe a expressão FOXO1.
células cancerosas da próstata foram transfectadas com 10 nM de pré-miR-96, anti-miR-96, pré-miR-NC # 1 ou combinação de pré-miR-96 e anti-miR-96. miR-96 de expressão de (A) LNCaP e (B) células DU145 e expressão FOXO1 em (C) e células LNCaP DU145 (D). Os dados são apresentados como média (± DP) de três ensaios independentes. ** P 0,01, *** P 0,001, ANOVA one-way. FOXO1, a expressão da proteína AKT, e pAKT em (E) células DU145 (F) e LNCaP foi visualizado por Western blotting. p-actina foi utilizado como um controlo de carga.
atividade FOXO1 está diretamente regulada por fosforilação de Akt em sinais de crescimento externo, resultando em translocalização do núcleo. Para verificar se o miR-96 superexpressão altera significativamente a sinalização Akt a montante, avaliou-Akt e expressão Akt fosforilada em miR-96 células com superexpressão. Nem Akt nem os níveis de Akt fosforilada foram significativamente alterados após a transfecção com o miR-96 precursores ou inibidores (Figura 3E + F), demonstrando que a actividade de FOXO1 não foi afectada por alterações na expressão ou actividade de Akt.
Para apoiar ainda mais a hipótese de que o miR-96 controles FOXO1 no câncer de próstata e, assim, protege as células da apoptose, nós transfectadas células LNCaP e DU145 com um comprimento total de cDNA FOXO1. A expressão ectópica de FOXO1 resultou numa forte regulação positiva de FOXO1 como validada por RT-PCR e westernblotting em ambos LNCaP e células DU145 (Figura 4A-D). Devido à forte intensidade de coloração de FOXO1 em células transfectadas, FOXO1 em células de controlo não é ainda visível no blot e só se tornaram visíveis após tempos de exposição mais longos. Co-transfecção com miR-96 reduziu os níveis de mRNA FOXO1 por 2.5- e 1,7 vezes em LNCaP e células DU145 (One-way ANOVA, p 0,001), enquanto os níveis de proteína foram reduzidas em 2,8 e 2.1- vezes (Figura 4C + D, Figura S3C + D).
células LNCaP e DU145 foram transfectadas com 500 ng FOXO1 clone de comprimento completo ou vector vazio, 10 nM pré-miR-96 ou um pré-miR-NC #. FOXO1 expressão em células de (A) LNCaP e (B) DU145. Os dados são apresentados como média (± DP) de três ensaios independentes. *** P 0,001, ANOVA one-way. a expressão da proteína FOXO1 em (C) e células LNCaP DU145 (D) foi visualizado por Western blotting. p-actina foi utilizado como um controlo de carga. Apoptose em-tratada CPT (E) LNCaP e (H) DU145 células. 24 h após a transfecção as células foram tratadas com 10 CPT uM durante 24 h. As células foram coradas com anexina V-FITC e PI. Fracção de início (barras pretas) e (barras brancas) tardias células apoptóticas foi medida por citometria de fluxo. Os dados são apresentados como média (± DP) de três ensaios independentes. ns, P 0,05, * P 0,05, ** P 0,01, *** P 0,001, Two-way ANOVA, pós-teste de Bonferroni). transição do ciclo celular foi medida por coloração de PI em LNCaP transfectadas (F) e (I) células DU145. As células foram privadas de soro um dia após a transfecção por mais 24 horas e, subsequentemente, fixadas e coradas. Preto, G1-fase; cinza claro, fase S; cinza escuro, G2 /M-fase. Os dados são apresentados como a média de três ensaios independentes. *** P 0,001, ANOVA one-way. Análise do pico subG1 em (G) LNCaP e células DU145 (J). Os dados são apresentados como a média de três ensaios independentes. *** P 0,001, ANOVA one-way
Na próxima etapa, avaliamos, seja FOXO1 tem um papel oposto a miR-96 em células de câncer de próstata e se o efeito pode ser resgatado. por co-transfecção com o miR-96. FOXO1 apoptose induzida fortemente em ambas as linhas celulares (two-way ANOVA, p 0,001, Figura 4E + H). O tratamento com CPT teve apenas um efeito adicional suave sobre as células. a sobre-expressão simultânea de miR-96 parcialmente resgatados da apoptose induzida em FOXO1 não tratada, bem como células tratadas com CPT, embora o efeito era pequena e não significativa em todos os tratamentos (Figura 4E + H).
Proliferação também foi fortemente reduzida em células LNCaP e DU145 FoxO1 transfectadas, mas miR-96 não reverteu significativamente o efeito (Figura S4A + B).