Abstract

Somente nos últimos anos têm fosfolipase

2 enzimas (PLA

2s) emergiu como alvos de câncer. Neste trabalho, relatamos a primeira detecção de elevados PLA

2 atividades no plasma de pacientes com colorectal, pulmão, pâncreas, e cancros da bexiga, em comparação com controles saudáveis. conjuntos independentes de amostras de plasma clínicos foram obtidos a partir de dois locais diferentes. O primeiro set foi de pacientes com câncer colorretal (CRC; n = 38) e controles saudáveis ​​(n = 77). O segundo set foi de pacientes com pulmão (n = 95), bexiga (n = 31) ou cânceres de pâncreas (n = 38) e controles saudáveis ​​(n = 79). PLA

2 actividades foram analisadas por um método de ensaio fluorescente quantitativo validado e subtipo PLA

2 actividades foram definidos na presença de inibidores selectivos. O natural

2 atividade PLA, bem como cada subtipo de PLA

2 atividade foi elevado em cada grupo de câncer, em comparação com controles saudáveis. PLA

2 atividades foram aumentados em fase tardia vs. casos em fase inicial na CRC. PLA

2 atividades não foram influenciados pelo sexo, tabagismo, consumo de álcool, ou índice de massa corporal (IMC). As amostras dos dois locais independentes confirmaram os resultados. Plasma PLA

2 atividades tinham aproximadamente% de especificidade e sensibilidade de 70 para detectar o câncer. O marcador e valores de segmentação de PLA

2 atividade têm sido sugeridos

Citation:. Cai H, Chiorean EG, Chiorean MV, Rex DK, Robb BW, Hahn NM, et al. (2013) Elevated fosfolipase

2 Actividades em amostras de plasma a partir de vários tipos de câncer. PLoS ONE 8 (2): e57081. doi: 10.1371 /journal.pone.0057081

editor: Mohammad O. Hoque, Johns Hopkins University, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de setembro de 2012; Aceito: 17 de janeiro de 2013; Publicação: 22 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Cai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiado em parte pelo Projeto Engenharia Cancer Care, Departamento de Defesa, USAMRMC, W81XWH-08-1-0065 e W81XWH-10-1-0540 (https://www.grants.gov/search/search.do?mode = AGENCYSEARCH agência = DOD), bem como Institutos Nacionais de Saúde R21 CA133744 (https://www.cancer.gov/researchandfunding) e da Fundação de Caridade Mary Fendrich Hulman para YX. Financiamento para o Hoosier Oncologia Study Group foi fornecido pelo Instituto Fundação do Câncer Walther, Indianapolis, IN. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes. Os autores têm preenchido um pedido de patente PCT “Atividade PLA2 como um marcador para ovário e outros cancros ginecológicos”, em 2011. Este não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

introdução

o cancro é um dos principais problemas de saúde em todo o mundo. Mais de 1,6 milhões de novos casos de câncer e mais de 577.000 mortes por câncer são projetados para ocorrer nos Estados Unidos em 2012 [1]. O cancro do pulmão (LC) e cancro colorectal (CRC) estão entre os tipos mais freqüentes de câncer. Pancreáticas e bexiga cancros contar para (3-7% de todos os cânceres), mas o câncer de pâncreas (PC) é um dos cancros mais mortas, com uma taxa de sobrevida em 5 anos sombrio de 6% [1]. O sucesso dos tratamentos atuais contra o câncer depende fortemente da época do diagnóstico, com a detecção precoce e identificação de populações de pacientes de alto risco, resultando em a sobrevida mais favoráveis ​​nestas doenças [1], [2]. Espera-se que a detecção precoce e rastreio de populações de pacientes de alto risco podem ter o impacto mais significativo na sobrevida global alterando nestas doenças. Assim, existe uma necessidade urgente de métodos de detecção precoce eficientes e sensíveis [3]. Enquanto os métodos de detecção baseados em imagem, incluindo tomografia axial computadorizada espiral (CT) e colonoscopia são métodos de detecção precoce eficazes para LC e CRC, respectivamente [4], eles são bastante caro e inconveniente. Além disso, modernas técnicas de imagem têm uma alta incidência de descoberta de nódulos pulmonares, muitos dos quais são falsamente positivo, mas ainda pedir exames complementares e, por vezes dolorosas [5]. abordagens moleculares para diagnóstico de câncer através de biomarcadores medidos por meios não-invasivos podem melhorar significativamente a especificidade e sensibilidade de detecção de câncer [5]. Em particular, os biomarcadores sorológicos pode ser o mais útil na detecção precoce devido à mínima invasão, relação custo-eficácia e conveniência. Além disso, os biomarcadores sorológicos identificar novos genes e /ou moléculas relacionadas com o cancro pode fornecer uma nova visão sobre a biologia dos cânceres e pode também tornar-se alvos atraentes para o tratamento [3].

fosfolipase

2 enzimas (PLA

2s) são as principais enzimas que produzem a) substrato de ciclo-oxigenase-2 (COX-2, ácido araquidónico (AA), bem como lisofosfolípidos. Ambas as classes de produtos são moléculas de sinalização envolvidos em cancros. No entanto, somente nos últimos anos têm PLA

2s emergiu como alvos de câncer [6]. Mais do que 30 enzimas que possuem PLA

2 ou actividade relacionados foram identificados em mamíferos [7]. Eles são divididos em quatro grupos com base na sua localização celular, especificidade de substrato, e de cálcio-dependência [8], incluindo citosólica (CPLA ​​

2),-cálcio independente (ipla

2), segregada (sPLA

2), e associada a lipoproteína de PLA

2 (Lp-PLA

2). No cancro, a maior parte da atenção tem sido focada na sPLA

2 e CPLA

2 [8]. Nós e outros mostraram que IPLA

2 é funcionalmente envolvido na promoção do desenvolvimento de câncer de ovário (OC) e de outros cancros,

in vitro

e

in vivo

[9] – [ ,,,0],13]. sPLA

2 e de Lp-PLA

2 são secretadas enzimas. Em contraste, tanto CPLA

2 e ipla

2 são enzimas citosólicas e a sua existência extracelular só foi mostrado estar relacionado com os exossomas a partir de células RBL-2H3 (uma linha de célula mastro e basófilos) [14]. Os exossomas são vesículas de membrana 40-100 nm de diâmetro libertados a partir de corpos multivesiculares por células intactas e são conhecidos para participar na sinalização intercelular [15]. Temos recentemente detectado IPLA extracellular- e livre de exosome

2 e CPLA

2 actividades em ascite e tecidos de pacientes de OC [16].

No presente trabalho temos nos concentrado em PLA

2 actividades em vez de expressão de cada PLA

2 enzimas e examinou PLA

2 actividades em amostras de plasma de sangue de pacientes com diferentes tipos de câncer, em comparação com os de controles saudáveis. Nós usamos nosso quantitativa recentemente validado, conveniente, altamente reprodutível PLA

2 método de ensaio [16] e mostraram pela primeira vez que o plasma PLA

2 atividades de pacientes com CRC, LC, PC, e cancro da bexiga (BC) foram significativamente maiores do que os dos controles saudáveis. Além disso, PLA

2 atividades foram correlacionados com estágios tumorais no CRC. Outros fatores influentes potenciais, incluindo sexo, idade, tabagismo e consumo de álcool também foram examinados neste estudo.

Materiais e Métodos

recolha de amostras e tratamento humanos

Dois conjuntos de amostras de plasma clínicos coletados de forma independente foram obtidas para este estudo. O primeiro conjunto da Escola Indiana University of Medicine (IUSM) focado em pacientes com CCR e controles saudáveis ​​selecionados por colonoscopia e considerado negativo para pólipos adenomatosos e CRC. As amostras de sangue recolhidas na presença de EDTA foram centrifugadas a 1750 g durante 15 min a 15-24 ° C, aliquotas em tubos Eppendorf siliconizados e armazenado a -80 ° C. O segundo conjunto de amostras foi de pacientes com pulmão, da bexiga, ou cancros pancreáticos, bem como controlos saudáveis. Essas amostras foram coletadas pelo Grupo de Oncologia Hoosier (HOG) em Indianapolis, IN, como parte do estudo “Uma amostra Coleção Protocolo biológica de pacientes com e sem metastático de órgãos sólidos Tumores malignos: Hoosier Oncologia Study Group BANK09-138”. As amostras de sangue foram centrifugadas a 3500 rpm durante 30 min. As amostras aliquotas foram armazenadas a -70 ° C. HOG é uma organização sem fins lucrativos de pesquisa médica. Embora seja uma entidade separada, IUSM é uma organização de apoio para as nomeações de tabuleiro e aprovações IRB para HOG. Três protocolos IRB separados de recolha e /ou utilizar as amostras de sangue relacionadas com este trabalho foram aprovados pelos mesmos IUSM Institutional Review Board (números de protocolo: 0670-81, 0808-24, 0905-20). formulários de consentimento informado por escrito foram obtidas de todas as disciplinas e toda a investigação clínica tinha sido conduzido de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki.

Reagentes e inibidores

O PLA

2 substrato 1 -O- (6-Dabcyl-amino-hexanoil) -2-O- (6- (12-BODIPY-dodecanoil) amino-hexanoil) -sn-3-glicerilo fosfatidilcolina (DBPC) foi de Echelon Bioscience (Salt Lake City, UT, EUA) . lactona Bromoenol (BEL) e arachidonylfluorophosphonate metilo (MAFP) foram de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA).

PLA

2 atividade enzimática analisa

PLA

2 atividades foram analisados ​​utilizando o BPDC substrato fluorescente, uma fosfatidilcolina substrato fluorogénico [17]. As amostras de plasma (0,1 ul) foram misturados com DBPC (0,2 ug em PBS) a um volume final de 200 uL. A fluorescência foi lida em intervalos ao longo de várias horas em um Victor

leitor de placas de 3V (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA). PLA

2 actividades foram expressas como alterações na intensidade da fluorescência /min /mL de plasma. Tal como descrito anteriormente [16], que seleccionado condições para distinguir PLA

2 actividade derivadas de diferentes subtipos: a) o “natural” PLA

2 Actividade sem quaisquer aditivos exógenos, b) o ipla

2 actividade a presença de 5 mM de EDTA (um quelante de catiões divalentes para bloquear todo o PLA

2s necessitando de cálcio, incluindo sPLA

2 e CPLA

2), c) o

2 actividade sPLA na presença de 1,2 cloreto mM de cálcio (a concentração de cálcio ionizado natural no sangue [18]) e MAFP (10? M, um inibidor dual de CPLA

2 e ipla

2), e d) o

2 actividade CPLA na presença de 100 mM de cloreto de cálcio e lactona bromoenol (BEL, 10 mM, um inibidor seletivo para IPLA

2).

Análise estatística

As variáveis ​​categóricas foram resumidas como conta com percentagens e contínua variáveis ​​foram resumidas como médias e desvios padrão (SD) através do controle saudável, e grupos de câncer. O teste do qui-quadrado foi usado para testar as associações entre estados de doença e co-variáveis ​​categóricas, tais como sexo, raça, tabagismo e consumo de álcool. Para co-variáveis ​​contínuas, como idade e IMC, one-way ANOVA foi utilizada para testar a diferença geral e estudante

t

-test foi usado para testar a diferença de pares em toda a estados de doença. regressão linear foi utilizada para avaliar a associação univariada entre PLA

2 medições e co-variáveis. A regressão logística foi utilizada para avaliar o desempenho da classificação de PLA

2 medições. Bootstrap foi usado para validar internamente o desempenho da classificação através 1000 amostras [19]. Cada amostra tinha o mesmo tamanho que o conjunto de dados inicial e foi utilizado para desenvolver o modelo. Os resultados foram então testados nos dados originais. As áreas sob a curva (AUC) foram calculados para cada repetição. Todos os testes foram em frente e verso. Dada a natureza exploratória deste estudo, não foram adoptadas quaisquer ajustes para comparações múltiplas.

valores P Restaurant 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Todas as análises foram realizadas utilizando a Versão software SAS 9.3 (SAS Institute Inc., Cary, NC, EUA).

Resultados

dados demográficos Assunto

Os dados demográficos para o estudo participantes estão resumidos na Tabela 1. Para as amostras conjunto IUSM CRC, 41,7% dos participantes globais eram do sexo masculino, 88,7% eram brancos, ea média de idade foi de 53,1 anos. A idade, o sexo e composição corrida não foram significativamente diferentes no controle vs. grupos de CRC (

valores

P 0,05; Tabela 1). Para o segundo conjunto de amostras, a idade no grupo controlo saudável foi significativamente menor do que cada um dos três grupos de cancro (Tabela 1). Embora os machos eram dominantes em cada grupo, eles não foram significativamente diferentes a partir do segundo conjunto de controles saudáveis. 71,2% dos participantes globais eram do sexo masculino, 90,4% eram brancos, ea média de idade era de 58,3 anos (Tabela 1).

Reprodutibilidade e estabilidade do PLA

2 ensaios

Temos recentemente validado a natureza quantitativa da PLA à base de BPDC

2 ensaios e otimizado as condições para fluidos e tecidos biológicos amostras [16]. Quando cada uma das 8 amostras de plasma foram analisadas representativas três vezes, o PLA

2 actividade valores reprodutíveis, com um desvio médio padrão (DP) 13,5 (1,3%). Nós também testou a estabilidade PLA

2 actividade, comparando-os em amostras antes do armazenamento para aquelas nas mesmas amostras armazenadas a -80 ° C durante um mês, bem como o efeito de congelação-descongelação e-no PLA

2 actividades em 8 amostras representativas. Como relatado anteriormente [16], PLA

2 actividades eram estáveis ​​com DPs 35,8 (5,8%). Além disso, mostrámos que, na presença de todos os outros componentes do ensaio, incluindo inibidor (es) usado neste estudo, mas na ausência de sangue ou de outras amostras biológicas, a hidrólise não específica do substrato DBPC foi negativo e negligenciável (dados não mostrados).

O PLA naturais

2, CPLA

2, IPLA

2, e sPLA

2 atividades foram elevados em amostras de câncer vs. controles saudáveis ​​

sangue IPLA

2 e CPLA

2 atividades não tenham sido previamente relatada em amostras humanas. Analisou-se o natural PLA

2 (definida como a PLA

2 actividades medidas nas condições sem quaisquer modificadores, que pode ser inferior à soma do subgrupo PLA

2 actividades medidos sob condições modificados), tal como bem como CPLA

2, IPLA

2, e sPLA

2 actividades em amostras de plasma.

Com exceção do saudável vs. CRC CPLA

2 atividade, todas as outras comparações mostraram que PLA

2 actividades foram significativamente elevadas nos grupos de cancro (Fig. 1A e 1B). PLA

2 valores de atividade em todo amostras de plasma de LC, BC, e os pacientes de PC não foram significativamente diferentes (

valores 0,05)

a comparação dos PLA

2 atividades. no controle saudável (colonoscopia normal; n = 77) e CRC (n = 38) grupos. A. Comparação de PLA

2 atividades na saudáveis ​​(n = 79) e de outros grupos de câncer. O cancro do pulmão (LC, n = 95), câncer de bexiga (BC, n = 31) e câncer pancreático (PC, n = 38). A distribuição dos grupos naturais e individuais de PLA

2 actividades foram analisadas como descrito em Materiais e Métodos. Os valores médios de PLA

2 atividades foram apresentados pelo “+” na figura. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01; ***

P

. 0,001

Desde sPLA

2 é secretado, espera-se que sPLA

2 atividade explicaria a maior parte do PLA

2 actividade detectada no sangue. No entanto, nos nossos resultados, os níveis elevados de ipla

2 e CPLA

2 e níveis baixos de sPLA

2 actividades foram observados em todas as amostras de plasma. exossomos de sangue podem ser os portadores dessas actividades [15]. Usamos passos de centrifugação diferenciais como descrevemos recentemente [16] para determinar se essas atividades poderiam estar associadas com plaquetas, exossomos, ou outros microvesículas. Duas amostras de sangue foram centrifugadas em primeiro 1.750 g durante 15 min para remover a maioria das células do sangue e o sobrenadante foi denominada S1. S1 foi centrifugado a 20.000

g

durante 20 min, o que resultou em S2 e o sedimento 2 (P2; e fragmentos celulares grandes vesículas). S2 foi ultracentrifugado a 110.000

g Compra de 2 horas, o que resultou em S3 e P3 (exosomes). A centrifugação final do S3 em 200.000

g Compra de 2 horas resultou em S4 e P4 (outros microvesículas). Descobrimos que todos os PLA

2 atividades foram retidos no S1 através de frações S4, sugerindo que eles eram “livre” e não associadas com microvesículas (dados detalhados não mostrados). Isso é semelhante ao que temos relatado recentemente na ascite de cancro do ovário humanos e novos mecanismos de secreção para IPLA

2s e CPLA

2s podem estar envolvidos [16].

Os parâmetros clínicos e PLA

2 actividades em amostras de plasma cancro

Curiosamente, o natural, ipla

2, e sPLA

2 actividades no plasma de pacientes com CCR foram aumentados em indivíduos com estágios tardios (III e IV), em comparação com fase mais precoce (I e II) da doença (

P

= 0,0335, 0,0367, 0,0778 e 0,0345 para PLA

2, IPLA

2, CPLA

2, e sPLA

2 , respectivamente; Fig. 2), sugerindo que estas actividades enzimáticas podem estar envolvidos na progressão da CRC. Nós comparamos o PLA

2 atividades em dois pontos (n = 24) vs. rectal amostras (n = 14). Embora a natureza, bem como o sub-grupo PLA

2 actividades em pacientes com câncer de cólon foram maiores do que os de pacientes com câncer retal, as diferenças não foram estatisticamente significativas (

P Art 0,05 em todos os casos ; Mesa 2). Além disso, nenhuma diferença foi encontrada em PLA

2 atividades entre diferentes subgrupos de pacientes com CCR com tratamentos anteriores (cirurgia, quimioterapia, radioterapia, ou não tratada; Tabela 2). Em contraste, descobrimos que PLA

2 atividades não foram correlacionadas com o fases T ou N do LC, BC, ou PC (Tabela 3).

Os grupos naturais e individuais dos PLA

2 atividades foram progressivamente aumentada estágio do tumor. Fase I e II (n = 7), a fase III e IV (n = 31). * Teste t de Student,

P

. 0,05

Impacto de outros factores na PLA

2 atividade

ter recolhido outros fatores que podem influenciar PLA

2 actividades, incluindo o tabagismo, consumo de álcool e índice de massa corporal (IMC). Para o estudo CRC, a partir dos 80 indivíduos com informação disponível fumo (27 CRC e 53 casos saudáveis), a maioria (96%) das pessoas não fumar quando as amostras foram coletadas, com uma média de 50,5% das pessoas nunca fumaram e 45,7% do fumador passado, e apenas 9,4% e 19,2% as pessoas tinham em segunda mão a exposição em cada grupo de fumar. Os status de fumar foram igualmente distribuídos em dois grupos (

P

valores 0,05; dados detalhados na Tabela 4) e não houve diferença estatística em PLA

2 atividades entre os diversos status fumadores (Fig 3A. ). No segundo conjunto de estudos, os status de fumar foram significativamente diferentes entre controles saudáveis ​​e cada um dos grupos de câncer com percentagens mais elevadas de pessoas que estavam atual, passado ou fumantes de segunda mão em grupos de câncer (

valores P

0,05, excepto em uma comparação, a Tabela 5). No entanto, não foram observadas diferenças estatísticas na PLA

2 atividades entre os diversos status fumadores, apoiando o conceito obtido a partir do primeiro conjunto de estudos que o plasma PLA

2 atividades não são afetados pelo fumo (Fig. 3B).

actividades PLA2 em amostras saudáveis ​​e CRC com diferentes status fumadores (a) e status do fumo (b). A. Comparação de atividades PLA2 entre diferentes estados para fumantes (a) e status do fumo (b) em participantes com LC, BC, e PC.

O consumo de álcool na grupos CRC controle e não foram significativamente diferentes (Tabela 4). Os consumidores de álcool nos grupos CRC tendem a ter níveis mais elevados de plasma PLA

2 atividades, mas as diferenças não foram estatisticamente significativas (Fig. 4). No entanto, devido aos baixos números em grupo consumo não-álcool (n = 7), devemos interpretar estes dados com cautela. Para outros tipos de câncer, foram obtidos resultados semelhantes. Embora houvesse maiores percentagens significativas de assuntos de consumo de álcool em outros grupos de câncer (Tabela 5), ​​o PLA

2 atividades não foram significativamente relacionados ao álcool (Fig. 5).

Comparação das actividades PLA2 entre ” sem álcool “e” grupos álcool “com os participantes saudáveis ​​e CRC. A. Comparação de atividades PLA2 entre “sem álcool” e “álcool” groupsin o segundo conjunto de estudos com saudável, LC, BC, e os participantes PC.

comparação atividade PLA2 em machos e fêmeas em os saudáveis ​​e os grupos de CRC. comparação atividade PLA2 A. em homens e mulheres nos grupos de câncer saudáveis ​​e outros. Os dados de todos os indivíduos em cada conjunto de estudos também são apresentados.

As diferenças de PLA

2 actividades entre os sexos não atingiram significância estatística na nenhum grupo de câncer de controle ou em qualquer conjunto de estudos (Figs. 5A e 5B). Da mesma forma, não houve diferença ou correlação em PLA

2 actividades em indivíduos com IMC 25 contra IMC ≥25 grupos em estudo CRC (. Figuras 6A e 6B), embora o IMC médio no CRC e grupos PC foram significativamente menos do que aqueles em grupos de controle (Tabelas 4 e 5)

O sujeito em grupos saudáveis ​​e CRC foram divididos em dois grupos:. IMC de 18,5 a 25 (para todos os assuntos, n = 43) e BMI 25 (para todos os sujeitos, n = 80). A. O sujeito em grupos de câncer saudáveis ​​e outros foram divididos em dois grupos: BMI≤25 (Para todos os assuntos, n = 80) e IMC 25 (Para todos os assuntos, n = 148)

a idade é um dos fatores de risco mais claramente identificados para o desenvolvimento de CRC e outros cânceres. A American Cancer Society e da Força Tarefa US Preventive Services recomendar que as pessoas recebem exames de colonoscopia a cada 10 anos, com início aos 50 anos Analisamos, assim, os efeitos da idade sobre PLA

2 atividades por dividir os participantes em dois grupos (idade 50 anos, n = 37 e ≥50 anos, n = 78). Embora tenha havido uma tendência de aumento das PLA

2 atividades na ≥ 50 anos de idade grupo no grupo CRC, as diferenças não foram estatisticamente significativas (Fig. 7A). Da mesma forma, não foi detectada diferença entre os dois grupos etários na LC, BC, e um conjunto de PC, embora quando todos os assuntos (incluindo os controlos saudáveis) foram combinados, houve aumentos significativos no PLA

2 activa nos indivíduos mais velhos ( A Fig. 7B)

Os participantes em grupos saudáveis ​​e CRC foram divididos em dois grupos:. idade 50 (Para todos os assuntos, n = 42) e idade ≥50 (Para todos os assuntos, n = 153). Teste t de Student foi realizado para analisar as diferenças entre estes dois grupos. A. Os participantes em grupos de câncer saudáveis ​​e outros foram divididos em dois grupos: idade 50 (Para todos os assuntos, n = 61) e idade ≥50 (Para todos os assuntos, n = 144). Teste t de Student foi realizado para analisar as diferenças entre estes dois grupos. *** P . 0.001

Uma comparação directa dos dois conjuntos de controles saudáveis ​​mostrou que, apesar de seu sexo, idade, fumo de segunda mão, eo consumo de álcool eram diferentes, não houve diferenças em qualquer

2 atividade PLA medidos (Tabela 6). Este suporta ainda que o plasma PLA

2 atividades não são significativamente afetados por idade, sexo, consumo de álcool e /ou fumar.

O desempenho classificação de plasma PLA

2 actividades

a regressão logística foi utilizada para avaliar o desempenho da classificação de PLA

2 actividades em cancros. Todos os quatro PLA

2 medições foram mantidos como preditores independentemente da sua importância. Os desempenhos de classificação foram resumidos por curvas receiver operating characteristic (ROC) (Fig. 8). fórmulas de predição foram gerados usando as estimativas dos parâmetros.

casos CRC versus indivíduos saudáveis. A. Todos os cânceres versus indivíduos saudáveis ​​no segundo set. cancer B. Lung vs. indivíduos saudáveis. câncer de bexiga C. vs. indivíduos saudáveis. câncer de pâncreas D. vs. indivíduos saudáveis. . E. Todos os cânceres contra todos os indivíduos saudáveis ​​com combinados dois conjuntos

A fórmula de previsão para separar os casos de CRC de indivíduos saudáveis ​​é: onde “

P

CRC” significa para a probabilidade de ter CRC. A curva ROC mostrado na Fig. 8A tem uma área sob a curva (AUC) = 0,7502.

Desde validações externas exigiria um estudo independente, nós em vez adoptados métodos internos para validar as performances de classificação. Entre os diferentes métodos de validação interna, tem sido demonstrado que supera de bootstrap de canivete, de validação cruzada e métodos de divisão de dados [19]. Portanto, de bootstrap foi adotada para validação. Em particular, a fórmula de previsão foi obtido ajustando o mesmo modelo para cada amostra de bootstrap. A fórmula foi aplicada aos dados originais para calcular as probabilidades de predição. O desempenho para esta amostra de bootstrap particular foi resumido por AUC da curva ROC. O desempenho global foi avaliada por resumindo AUC em todo 1000 amostras bootstrap. Em 95% das 1000 amostras de bootstrap, as AUCs são maiores do que 0,7143 por CRC vs saudável. Portanto, estes resultados confirmam internamente as performances de classificação dos modelos desenvolvidos anteriormente.

A fórmula de previsão ea curva ROC para separar todos os casos de câncer de indivíduos saudáveis ​​no segundo conjunto de estudo são os seguintes e mostrado na Fig. 8B, com um desempenho AUC = 0.8337.This foi validado em 1000 bootstrapped amostras. Em 95% dos 1000 bootstrapped amostras, AUCs são maiores do que 0,8205 por LC, PC, BC combinada vs. o segundo conjunto de controles saudáveis.

As fórmulas de previsão e as curvas ROC para a LC separado, BC, e os casos de PC de indivíduos saudáveis ​​no segundo conjunto de estudo estão listados abaixo e figos. 8C para 8E, com AUC 0,811, indicando boas performances de classificação dos testes. Para LC versus controlo saudável, a AUC = 0,8119 (Fig. 8C). Em 95% da amostra de bootstrap 1000, as AUCs são mais elevados do que 0.7923.For BC versus controlo saudável, a AUC = 0,8624 (Fig. 8D). Em 95% da amostra de bootstrap 1000, as AUCs são mais elevados do que 0.8161.For PC versus controlo saudável, a AUC = 0,8671. Em 95% da amostra bootstrap 1000, AUCs são maiores do que 0,8426.

Finalmente, uma vez que verificámos que o PLA

2 atividades foram essencialmente nenhuma diferença entre os dois conjuntos de controles saudáveis, nós combinamos tudo controles saudáveis ​​e todos os casos de câncer em ambos os conjuntos de estudos e gerado uma fórmula combinada, com uma AUC = 0,8011 (Fig. 8F). Em 95% das 1000 amostras de bootstrap, as AUCs são mais elevados do que 0.7907.The sensibilidades e especificidades podem ser obtidas a partir das curvas ROC mostrados na Fig. 8. Para o conjunto de CRC do estudo, a sensibilidade de 60,5% e 77,9% de especificidade foram obtidos (Tabela 7). Para a 2

nd conjunto de estudo e os dados combinados para ambos os conjuntos, sensibilidades 80% e as especificidades . 66% foram obtidos para todos os casos (Tabela 7)

O potenciais contribuições de outros fatores

Embora a maioria dos outros e ou fatores demográficos /ambientais testadas não foram significativamente diferentes nos grupos e controlo do cancro (Fig 3-7), testamos as suas contribuições potenciais para o desempenho quando são avaliadas em níveis individuais. Mantivemos todos

2 medições quatro PLA nos modelos, mas deixe outros preditores sujeito ao modelo seleções no nível de significância de 0,05.

A fórmula de previsão ea curva ROC para separar CRC de indivíduos saudáveis ​​no primeiro conjunto de estudo são os seguintes e mostrado na Fig. 9A, com uma AUC = 0,8162. Em 95% da amostra de bootstrap 1000, as AUCs são mais elevados do que 0.7589.The fórmula de previsão e a curva ROC para separar todos os casos de cancro a partir de indivíduos saudáveis, no segundo conjunto de estudo são os seguintes e mostrado na Fig. 9B, com um desempenho AUC = 0.9728.This foi validado em 1000 bootstrapped amostras. Em 95% das 1000 amostras bootstrap, AUCs são maiores do que 0,9625 por LC, PC, e BC combinada vs. o segundo conjunto de controles saudáveis.

casos CRC versus indivíduos saudáveis. A. Todos os casos de câncer versus indivíduos saudáveis ​​no segundo set. cancer B. Lung vs. indivíduos saudáveis. câncer de bexiga C. vs. indivíduos saudáveis. câncer de pâncreas D. vs. indivíduos saudáveis. E. Todos os cânceres contra todos os indivíduos saudáveis ​​com combinados dois conjuntos.

As fórmulas de previsão e as curvas ROC para a LC separado, BC, e os casos de PC de indivíduos saudáveis ​​no segundo conjunto de estudo são listados abaixo e as Figs. 9C para 9E, com AUC 0,968, indicando alta sensibilidade e especifica dos testes. Para LC versus controlo saudável, a AUC = 0,9742. Em 95% da amostra de bootstrap 1000, as AUCs são mais elevados do que 0.9598.For BC versus controlo saudável, a AUC = 0,9682. Em 95% da amostra de bootstrap 1000, as AUCs são mais elevados do que 0.9398.For PC versus controlo saudável, a AUC = 0,9907. Em 95% da amostra bootstrap 1000, AUCs são maiores do que 0,9740.

Finalmente, uma vez que descobrimos que o PLA

2 atividades foram essencialmente nenhuma diferença entre os dois conjuntos de controles saudáveis, combinamos todos saudáveis controles e todos os casos de câncer em ambos os conjuntos de estudos e gerado uma fórmula combinada, com uma AUC = 0,9140 (Fig. 9F). Em 95% das 1000 amostras de bootstrap, as AUCs são mais elevados do que 0.9018.The sensibilidades e especificidades obtidos com estas curvas ROC com parâmetros adicionais são aumentados para 85% (com excepção da BF vs. casos saudáveis; Tabela 7).

Discussão

neste trabalho, apresentamos as primeiras medições de plasma natural e subtipo PLA

2 atividades e suas performances como potenciais marcadores para quatro tipos de câncer diferentes, CRC, LC, BC, e PC. Nós medimos o

2 atividades PLA em mais de 20 amostras de sangue com ou sem adição de cálcio 1,2 mM (a concentração de cálcio ionizado natural no sangue) para as misturas finais do ensaio e não detectou quaisquer diferenças significativas. Por isso, definimos as

2 atividades PLA obtidos sem quaisquer aditivos como o “natural” PLA

2 atividade. Nós selecionamos as condições ideais para medir cada sub-família de PLA

2 atividades. Estas condições modificadas não co-existem no sangue. Portanto, não é surpreendente que a soma da subfamília PLA

2 actividades é maior do que o “natural” PLA

2 actividade. No entanto, é importante notar que embora as condições modificadas foram usadas para obter as actividades para as subfamílias de PLA

2s, os resultados finais são dos naturais PLA

2s presentes nas amostras de sangue.

Embora as vantagens da utilização de marcadores serológicos convenientes são óbvias, não há marcadores sanguíneos fiáveis ​​para qualquer destes cancros estão disponíveis no momento. Para CRC, o desenvolvimento /validação de métodos de detecção não-invasivas ou minimamente invasivas é um grande foco no campo. Os métodos atuais incluem exames de fezes e sangue, tais como testes fecais imunoquímicos (convulsões) e testes de sangue oculto nas fezes baseada guaiac (GOT). Embora a especificidade é alta ( 85%), estes testes têm uma sensibilidade baixa ( 23%) para colorectal adenomas e são, portanto, pouco provável que seja capaz de aumentar a detecção precoce de CRC [20], [21]. exames de fezes genéticos detectar mutações nas fezes que podem ser encontrados no CRC.