Abstract
Para analisar simultaneamente mutações e níveis de múltiplos genes em uma única plataforma de detecção de expressão, propusemos um método denominado “amplificação amplificação digital multiplex dependente da ligação sonda juntamente com hidrogel talão-array” (MLPA- DABA) e aplicou-o para diagnosticar o câncer colorretal (CRC). CRC células e tecidos foram amostrados para extrair o ácido nucleico, executar MLPA com sondas marcadas de sequência, executar digital de reacção em cadeia da emulsão de polimerase (PCR), e produzir um hidrogel talão-matriz para imobilizar grânulos e formar uma camada de cordão único na matriz. Após hibridação com sondas fluorescentes, o número de grânulos coloridos, que reflete a abundância de genes expressos e da taxa de mutação, foi contado para diagnóstico. Apenas contas vermelhas ou verdes ocorreu nas fichas nas amostras mistas, indicando o sucesso de uma única molécula de PCR. Quando uma amostra de uma fonte foi analisado utilizando sondas MLPA mistos, grânulos de uma só cor ocorreu, o que sugere a alta especificidade do método em análise de mutação CRC e expressão do gene. Na análise da expressão de genes de um tecido de um paciente CRC CRC, a percentagem mutante foi de 3,1%, e os níveis de genes relacionados com a expressão CRC foram muito mais elevados do que os de tecido normal. O altamente sensível MLPA-DABA sucede na quantificação relativa de mutações e expressão dos genes de células esfoliadas em amostras de fezes de pacientes de CRC na mesma plataforma de chip. MLPA-DABA juntamente com hidrogel talão-array é um método promissor no diagnóstico não-invasivo de CRC
Citation:. Huang H, Li S, Sun L, Zhou G (2015) Detecção Digital de vários mutantes minoritários e os níveis de expressão de vários genes colorectal Cancer-relacionados Usando digital-PCR Juntamente com Bead-matriz. PLoS ONE 10 (4): e0123420. doi: 10.1371 /journal.pone.0123420
Editor do Academic: Ken Mills, University Belfast da rainha, REINO UNIDO
Recebido: 17 de dezembro de 2014; Aceito: 23 de fevereiro de 2015; Publicação: 16 de abril de 2015
Direitos de autor: © 2015 Huang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
financiamento:. o National Science Foundation da China (Grant No. 21305069 e 21275161) forneceu financiamento para a decisão de publicar e preparação do manuscrito. O projecto de formação de jovens talentos na província de Jiangsu Materna e Hospital Saúde da Criança (FRC201302) forneceu o financiamento para a recolha e análise de dados. Ciências Clínicas da província de Jiangsu Tecnologia Projeto Especial (SBL2012061) forneceu o financiamento para o projeto estudo
Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
O câncer colorretal (CRC) é o terceiro tipo de câncer mais comum em homens eo segundo tipo de câncer mais comum em mulheres em todo o mundo [1]. Na China, CRC é uma das neoplasias malignas mais comuns e tem uma alta taxa de mortalidade. Tradicionalmente, o diagnóstico CRC utiliza o sistema de classificação de Dukes, que categoriza o câncer em estágios A, B, C ou D. Os dados relacionados mostram que as taxas-de sobrevivência de 5 anos de pacientes com CCR pós-operatórios são 81-85% no estágio A, 64- 78% na fase B, 27-33% na fase C, e 5-14% em fase D; Portanto, o diagnóstico precoce do CRC e posterior tratamento pode efetivamente aumentar as taxas de sobrevivência. testes de diagnóstico precoce são a chave para o diagnóstico precoce da CRC e melhoria das taxas [2] de sobrevivência. testes de rastreio CRC incluem procedimentos como a colonoscopia, exame de sangue oculto nas fezes, e fibersigmoidoscopy [3]. Embora estes métodos têm bons resultados clínicos, que também tem inconvenientes. Por exemplo, as técnicas invasivas pode facilmente causar sangramento e perfuração, e a sensibilidade e especificidade de alguns métodos são insuficientes; Portanto, é necessário para o diagnóstico precoce de CRC o desenvolvimento de uma abordagem simples, não invasivo, com elevada sensibilidade e especificidade.
Os recentes avanços rápidos na biologia molecular tornam possível realizar o diagnóstico não invasivo precoce de CRC por análise de sensibilidade células esfoliadas nas amostras de fezes de pacientes com CCR. Porque a oncogénese de CRC, que envolve a interacção de múltiplos genes, é um processo em múltiplos passos [4], tais como a activação de proto-oncogenes e inactivação de genes supressores de tumores, o método de detecção de um único gene, muitas vezes erros de diagnóstico da doença; Portanto, a detecção combinada de múltiplos genes é útil para aumentar a taxa de diagnósticos positivos da doença. A ocorrência e o desenvolvimento de CRC muitas vezes acompanha a mutação de genes e alterações na expressão do gene [5]; Portanto, o diagnóstico CRC envolve a detecção destas actividades [6-11]. Embora a técnica de sequenciação de ADN é um método clássico de que são detectadas mutações de genes, pode não analisar as amostras em que o número de mutações for 20% [12]. Para a detecção de mutações do gene em níveis baixos nas fases iniciais de cancros, um método de /à base de ligase de mutação de varrimento EndoV foi desenvolvido com um limite de detecção de 1,0% [13]; No entanto, o método é incapaz de detectar mutantes (Muts) a um nível muito mais baixo, devido à sua análise quantitativa com base no sinal analógico. Embora o método de análise digital, chamado radiante [14,15], foi desenvolvido para detectar mutS a um nível ultra-baixo (0,1% de os Muts), o citómetro de fluxo usado no processo é caro e apenas um gene é detectada em um tentativas. Devido à sua elevada sensibilidade e uma elevada especificidade, quantitativa reacção em cadeia da polimerase (qPCR) é considerado como sendo o melhor método através do qual a expressão do gene pode ser analisado; No entanto, por causa do número limitado de marcadores fluorescentes, qPCR não é adequado para análise de múltiplos genes durante a mesma reacção. Apesar de microarranjo de DNA pode analisar simultaneamente múltiplos genes, o problema continua a ser de um limite de detecção baixa e pobre desempenho quantitativo para a análise de genes relacionados ao câncer expressos em níveis baixos no diagnóstico precoce da CRC. Além disso, embora a análise combinada de mutações e expressão de genes relacionados ao câncer pode aumentar a precisão e sensibilidade do diagnóstico CRC, quase todas as técnicas relatadas aplica a apenas um campo de detectar qualquer mutações ou a expressão do gene.
Aqui, propusemos um método denominado “sonda de amplificação amplificação digital dependente da ligação multiplex juntamente com hidrogel talão-array” (MLPA-DABA) pelos quais mutações e níveis de múltiplos genes de expressão em níveis baixos podem ser analisadas simultaneamente em uma plataforma de detecção. Com base em trabalho anterior [3,16,17], a plataforma técnica de MLPA-DABA foi desenvolvido através da melhoria das seguintes três aspectos: em primeiro lugar, MLPA, em vez de PCR ou PCR multiplex alvo enriquecido (TEM-PCR) convencional, foi utilizada para preparar modelos com fins comuns; Em segundo lugar, as mutações e expressões de múltiplos genes, em vez de apenas um ou o outro, foram medidos em simultâneo com a plataforma técnica mudando a concepção de sondas específicas MLPA; Em terceiro lugar, livre de corante e sondas MLPA específico para o gene, em vez da de alto custo e sondas fluorescentes específicos do gene, foram utilizados para marcar vários MutS e genes relacionados com o cancro. Os problemas de números incertos de desoxinucleótido-trifosfatos marcados com corante (dNTP) incorporadas em uma cadeia de DNA e da concorrência entre a reação de extensão e reação de hibridização referido em trabalhos anteriores foram resolvidos; Por conseguinte, a alta especificidade, baixo custo e elevada estabilidade do método foram alcançados. O método foi aplicado com sucesso para o diagnóstico CRC através da análise da expressão de cinco genes (
β-actina
,
C-myc,
H-ras
,
CD44v6
,
Cox-2
, e
N-ras
) e três loci mutação em genes APC (códons de 1406, 1338 e 1356) em tecidos CRC, as células CRC, e fezes amostras de pacientes de CRC. Os resultados mostram que o método pode ser uma poderosa ferramenta para o diagnóstico precoce do CRC.
Materiais e Métodos
Reagentes
éster de N-hidroxisuccinimida (NHS) -activated sepharose coluna de afinidade de HP e dNTPs foram adquiridos a Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).
Taq DNA polimerase foi da Promega (Madison, WI). DC 5225C Auxiliar de Formulação e DC 749 Fluid foram adquiridos da Dow Chemical Co. (Midland, MI). Ar20 óleo de silicone foi obtido a partir de Sigma (St. Louis, MO). SuperScript III transcriptase reversa foi adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA). Amplicase foi comprado de Epicenter (Madison, WI). Outros produtos químicos foram de grau comercialmente extra-pura. Todas as soluções foram preparadas com água deionizada e esterilizados.
Seqüências de primers e sondas
O iniciador modificado com amina (5′-NH
2-TTT TTT TTT TCC ATC TGT TGC GTG CGT GTC-3 ‘) foi sintetizado pela Takara Biotecnologia Co., Ltd. (Dalian, China). Todos os outros iniciadores foram sintetizados pela Invitrogen Inc. (Xangai, China). Um par de iniciadores comuns, comum-1 (5’-CCA GTT TCT GCG GTG TGC TC-3 ‘) e comum-2 (5′-CCT CAA TGG TCA GCG GAA TC-3′) foi utilizado para amplificar produtos MLPA. As sondas MLPA específicos do gene para mutantes de detecção foram listados na Tabela 1. As sondas MLPA específicos do gene para a expressão de genes analisando foram listados na Tabela 2. As sondas de fluorescência para talão-descodificação foram 5’-Cy3-TGC CTT GTC ATT CGG- 3 ‘e 5′-Cy5-GGA AAA GAG CCA A-3’. O primer reverso-transcrição foi oligo (dT) 15.
preparação Modelo
As amostras de células do tecido e CRC CRC foram obtidos a partir Hospital do Câncer Jiangsu (Nanjing, China) . A colheita de tecidos, células e fezes dos participantes foi aprovado pelo comitê de ética do Primeiro Hospital Afiliado da Universidade Médica de Nanjing e participantes forneceram consentimentos informados por escrito. Os ARNs totais foram extraídos a partir de tecidos de pacientes de CRC e células CRC utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. O RNA extraído foi determinado por electroforese em gel realizada sobre um gel de agarose a 2% e um espectrofotómetro de UV-vis (Naka Instruments, Japão). O ADNc da primeira cadeia foi sintetizado a partir de oligo (dT) 15 primers usando SuperScript III Transcriptase Reversa, de acordo com as instruções do fabricante.
O ADN genómico foi extraído de tecidos e células por extracção com fenol-clorofórmio. Antes da extracção, as células foram lavadas duas vezes com solução salina normal e tecidos foram cortados e homogeneizados em 1 ml de solução salina normal. O DNA extraído foi diluída em tampão de TE e determinada pelo espectrofotómetro de UV-vis.
de fezes de um paciente CRC no Hospital Câncer Jiangsu (Nanjing, China) foi homogeneizado em tampão de ASL e extraiu-se com um DNA QIAamp Fezes Mini kit (Qiagen, Alemanha).
Multiplex amplificação amplificação digital sonda dependente da ligadura
Depois de adicionar os pares de sondas (100 fmol de cada) e 1,0 U Ampligase, a mistura reaccional contendo o As amostras de ADN ou de ADNc foi incubada a 94 ° C durante 1,0 min, seguido por 60 ° C durante 4,0 min; este ciclo foi repetido 10 vezes.
emulsão Digital PCR (emPCR)
Os grânulos embalados (10 umol NHS sítios /ml) a partir de 1 ml de coluna de afinidade de Sepharose HP activada por NHS, foram removidos a partir de a coluna e dispersos em isopropanol. Depois lavou-se com HCl 1 mM para eliminar completamente o isopropanol, os grânulos foram activadas por HCl arrefecido em gelo 1 mM a 4 ° C durante 1 h. Em seguida, as esferas activadas e iniciadores modificados com amina (10 mM) foram incubados no tampão de ligação (0,5 M de NaCl, 0,2 M de NaHCO
3, pH 7,5) a 20 ° C durante 5 h. Os grânulos foram mantidos longe de sedimentação na incubação. Após incubação, as esferas imobilizada-iniciadores foram armazenadas a 4 ° C para utilização.
O sistema de mistura emPCR contém fase oleosa e fase aquosa. A fase aquosa é dividido em duas partes, Mock mistura de amplificação e mistura de reacção de PCR. Os produtos de ligação foram usados como moldes para PCR. Em primeiro lugar, para fazer emulsão mais estável, 225 ul de mistura de amplificação simulada (1 × Promega
Taq
buffer, MgCl2 mM
2, 0,1% de BSA e 0,01% de Tween-80) foi homogeneizada com 375 ul de óleo de emulsão (40% (w /w) DC 5225C Auxiliar de Formulação, 30% (w /w) DC 749 Fluid e 30% (w /w) AR20 óleo de silicone) por um microstir-barra magnética a 1200 rpm durante 5 min em um frasco de 5 mL. Em segundo lugar, a 200 ul da mistura de reacção da PCR (1 × Promega
Taq
buffer, MgCl2 mM
2, 0,5 mistura dNTP mM, 0,125 U /ml
Taq DNA polimerase
, 0,1 % de BSA, 0,01% de Tween-80, comum-2 iniciador de 0,06 mM e 0,6 mM de cada um dos comuns 1-iniciadores), os grânulos revestidos com primário e com os modelos foram adicionados ao frasco e em seguida o frasco foi agitado a 1500 rpm durante 3 min para misturar as emulsões bem. As emulsões foram aliquotadas com 100 ul de cada um em 8 tubos de PCR. Em terceiro lugar, ciclagem térmica foi levada a cabo em PTC-225 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, inc.) A uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 3 min, depois 40 ciclos (94 ° C, 58 ° C e 68 ° C durante 30 s , 60 s, 90 s cada) para a amplificação e 13 ciclos (94 ° C e 58 ° C durante 30 s, 360 de cada) para a hibridação e extensão.
digital talão contando com bead- hidrogel auto-produzido matriz
Após a amplificação, as emulsões foram discriminadas por adição de isopropanol. As emulsões com isopropanol foram filtrados através de uma membrana microporo 25 mm de diâmetro e as esferas foram presos na membrana. Depois de os grânulos na membrana foram desejou-se com isopropanol, 80% de etanol em solução (4,0 mM Tris, pH = 7,5), e 0,1% de Tween 20, foram recuperados 1,0 mM em ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). ADN (dsADN) grânulos imobilizadas foram tratadas com NaOH 0,1 mM durante 5,0 min para preparar DNA de cadeia simples (ADNcs) grânulos imobilizadas. Depois o sobrenadante foi removido, as esferas foram lavadas duas vezes com DDQ
2O e armazenados na solução.
lâminas Acryl-modificadas foram preparadas de acordo com Xiao et al [18]. As lâminas de microscópio (Xangai Jinglun industrial Glass Co., Ltd., Shanghai, China) foram limpos por imersão em ácido nítrico aquoso a 10% durante 2,0 h.
O grânulo-matriz hidrogel foi preparado por adição dos grânulos a uma solução de monómero de acrilamida e em lâminas modificadas com acrílico e imediatamente cobrindo com uma lamela (20 × 20 mm) para segurar a camada talão única. Após a copolimerização, a qual foi levada a cabo à temperatura ambiente durante 10 min, a lamela foi cuidadosamente removido a partir do hidrogel. As sondas de fluorescência (1,0 pmol /ul) foram hibridadas com ADNcs sobre os grânulos no gel de poliacrilamida a 40 ° C durante 1,0 h. Para remover as sondas livres e não correspondentes a partir do chip em gel, as lâminas hibridadas-sonda foram sujeitos a electroforese em 4,0 ° C, sob 50 V durante 5,0 min em 1 × tampão de Tris /borato /EDTA. Depois de se lavar com água, as imagens das lâminas foram feitas utilizando o LuxScanner (CapitalBio Corporação, Pequim, China). Finalmente, a imagem de digitalização do cordão-array foi introduzido em GenePix Pro 4.0 para contar as esferas de cor na matriz.
Resultados e Discussão
Princípio
Com o objetivo de, simultaneamente, analisar mutações múltiplas e a expressão de múltiplos genes, um MLPA alvo enriquecido foi combinado com emPCR baseadas em esferas para amplificação multiplex de uma única molécula. Os protocolos de ensaio são mostrados na Figura 1 e compreende as seguintes etapas:. A preparação do modelo, emulsificação, amplificação único peso molecular, desemulsifica�o, preparação de hidrogel talão-matriz, a hibridação de sondas, e contando grânulo
O ensaio compreende as seguintes três etapas: (1) MLPA para a preparação de modelos marcados com sequências universais; (2) emulsão (EM) de PCR para a preparação de pérolas revestidas com produtos de amplificação gerados a partir de uma única molécula de produtos MLPA; e (3) de descodificação do grânulo por hibridação de sondas universais marcado com Cy5 e Cy3 sondas universais marcadas. Se um talão exibido como verde, os amplicons revestidos na esfera deve ser ampliado a partir de modelos MUT ou alvos de genes relacionados com o CRC, enquanto um cordão vermelho significa modelos ou alvos de genes de limpeza do tipo selvagem.
primeiro, o ADN e o ADNc foram utilizados como alvos em MLPA para preparar os moldes para emPCR qualificadas, que é uma técnica de PCR digitais extremamente preciso em que há uma reacção de amplificação de uma molécula de realizar amplificação de uma única molécula. Na detecção de mutações, a ligação precisa de três sondas para um loci, ou seja, a “sonda esquerda”, “direita sonda 1” e “sonda direita 2”. Existem duas partes na sonda esquerda e três partes em cada uma das duas sondas adequadas. As duas partes da sonda esquerda são uma cauda comum na extremidade 5 ‘para o fornecimento de um sítio de iniciação comum necessária na amplificação por PCR subsequente e uma sequência específica para o gene na extremidade 3’ para o recozimento do alvo. As sondas adequadas contêm uma sequência específica do gene com um local de mutação de interesse na primeira base da extremidade 5 ‘, uma sequência específica da fonte para hibridizar sondas fluorescentes no meio, e um sítio de iniciação comum na extremidade 3’. sondas direita 1 e 2 correspondem à MUT e tipos selvagens (WTS), respectivamente. Na análise do gene de expressão, duas sondas, a sonda para a esquerda e direita da sonda, foram utilizados na reacção de ligação. A sonda à esquerda contém um sítio de iniciação comum e uma sequência específica do gene. A sonda direita contém uma sequência específica do gene na extremidade 5 ‘, uma sequência específica da origem, no meio, e um sítio de iniciação comum na extremidade 3’. Subsequentemente, a amplificação de uma única molécula foi realizada em emulsão de água-em-óleo. Uma vez que ambos os modelos de esferas e de MPLA, são diluídos de modo a que não mais do que uma molécula alvo e um talão está presente em cada um dos compartimentos, a partir de produtos de amplificação gerados frisado emPCR originam exatamente uma molécula alvo. Após demulsification, grânulos são recolhidos e fixados como uma camada de talão única (40 mm de espessura) em um talão-matriz de hidrogel. Os grânulos amplificado a partir do gene de manutenção (ou amplicões WT) foram descodificados por hibridação de sondas de 3′-marcado com Cy5, enquanto os grânulos amplificado a partir de genes relacionados com a CRC (ou Muts) foram descodificados por hibridação de sondas de 3′-Cy3-marcadas; portanto, o número de corante Cy5 (vermelho) grânulos e o número de verde (corante Cy3) grânulos reflectiu os níveis de expressão do gene de manutenção (ou amplicões WT) e os genes relacionados com o CRC (ou Muts), respectivamente. O custo do ensaio é drasticamente diminuído por utilização de sondas fluorescentes comuns para descodificar os grânulos revestidos com os amplicões de mutS, amplicões wt, o gene de manutenção, e CRC relacionados com genes.
Especificidade de talão-matriz
a especificidade da plataforma de chip de hidrogel para analisar os alvos a partir de diferentes fontes foi investigada. O ADNc de
β-actina
foi ligado com as sondas MLPA específicos do gene que contém a marca de sequência de codificação para sondas Cy5-rotulados para produzir produtos de MLPA
β-actina
. Os produtos foram, em seguida, MLPA amplificado utilizando dois iniciadores comuns e a extremidade 5 ‘de um iniciador foi modificado com biotina. Depois de os produtos de PCR modificados com biotina foram imobilizadas em esferas de estreptavidina-modificado, o talão-matriz foi preparada e coberta com sondas Cy5- e Cy3 labled para análise. Como mostrado na Fig 2A, existem apenas esferas vermelhas nas imagens. Da mesma forma, quando o cDNA de genes relacionados com a CRC foi ligado com as sondas MLPA específicos do gene que contém a sequência de codificação para marcação de sondas Cy3 labled apenas grânulos verdes podem ser digitalizados (Fig 2B). Os resultados indicaram que a electroforese remove eficazmente as sondas não correspondentes na superfície dos grânulos ou as sondas restantes dentro do hidrogel. A hibridação entre sondas e alvos fluorescentes no interior do hidrogel é específico. A plataforma do grânulo-matriz pode ser aplicado para distinguir alvos com precisão a partir de diferentes fontes em MLPA-DABA.
Tanto o marcado com Cy5 e Cy3-sondas marcadas foram adicionados ao grânulo-matriz para a hibridação e electroforese foi executada para remover as sondas não correspondentes e livres. Finalmente, as três fotografias do painel de A ou B do painel são tomadas por meio de três tipos de canais de fluorescência, ambos os canais Cy3 e Cy5, único canal Cy3 e único canal Cy5, respectivamente.
Especificidade do MLPA -DABA para analisar mutantes e expressões gênicas
para analisar a expressão do gene, a fração de grânulos CRC falsamente marcados em 100% cDNA de
β-actina
ea fração de contas domésticas falsamente marcados em 100 foram determinadas% de cDNA de genes de CRC. Após a hibridação e eletroforese, as imagens foram tomadas em consideração as contas revestidas com 100% de fragmentos de
β-actina
e 100% fragmentos de genes relacionados com o CRC; os resultados são mostrados na Figura 3A e 3B. Havia cerca de grânulos não falsamente marcou encontrados em qualquer teste; portanto, MLPA-DABA uso é altamente específico para a análise de expressão de genes relacionados com o CRC em CRC
As amostras foram 100 alvos% de
β-actina
(A).; 100 alvos% de genes relacionados com o CRC (B); 100% de ADN WT 1338 codão no tecido normal (C); e 100% de ADN MUT codão de 1338 em células SW480 (D). Sete pares de sondas de genes relacionados com a CRC e
β-actina
foi adicionado à mistura de reacção MLPA (A e B), e todas as sondas de codões de 1406, 1338 e 1356 foram utilizados para as reacções C (MLPA e D). Depois de emulsão de PCR, ambas as sondas marcada com Cy5 e Cy3 marcados foram adicionados ao grânulo-matriz para a hibridação.
SW480 células humanas (células de CRC) com uma mutação homozigótica no códon 1338 (4012 C T) foram selecionados como alvo MUT. tecido normal usado como o destino WT, simultaneamente, foi analisado. Foi detectada a fração de grânulos falsamente marcados em um DNA MUT 100% ou em um 100% de ADN WT. Os resultados mostrados na Figura 3C e 3D indicam que a percentagem de grânulos erroneamente marcados (incluindo impurezas) em ambos é quase 0, o que sugere que o método também é específico para a detecção de mutações no CRC.
Quantificação de dois genes usando MLPA-DABA
para verificar a viabilidade do uso MLPA-DABA para analisar diferentes genes, dois genes de limpeza foram utilizados como um exemplo. Em um tubo, os alvos da
beta-actina
foram ligados com as sondas MLPA que poderiam hibridizam as sondas Cy5-rotulados, enquanto os alvos de
GAPDH
foram ligados com as sondas MLPA que poderiam hibridizam as sondas Cy3 rotulados. Após amplificação digital dos produtos de ligação e de hibridação da sonda de os grânulos, as pérolas vermelhas e verdes foram contadas. Os resultados são mostrados na Fig 4. O número de pérolas vermelhas e verdes grânulos reflectem os níveis de
β-actina
e
GAPDH, expressão, respectivamente. Ao contar os grânulos coloridos sobre o chip, verificou-se que a proporção de expressão de
β-actina
para que de
GAPDH estava próxima de 1: 1, sugerindo que os dois genes de manutenção eram detectada com sucesso. Não houve grânulos amarelo, indicando que a amplificação único peso molecular foi conseguida mantendo nenhuma molécula mais do que um alvo em cada compartimento, e que é possível que MLPA-DABA pode analisar genes de diferentes fontes.
Um vermelho talão originado de uma molécula de
β-actina
e um cordão verde originado de uma molécula de
GAPDH
.
Aplicação
Para demonstrar a aplicação de MLPA-DABA na detecção de amostras clínicas, os níveis de expressão relativos de cinco genes relacionados com a CRC e MutS em ambos os tecidos de tumor e tecidos normais adjacentes a partir de pacientes com CCR foram detectados. As imagens digitalizadas típicos de um paciente são apresentados na Figura 5. Os níveis de expressão relativa do total de cinco genes relacionados com a CRC para
β-actina
em tecido tumoral são muito mais elevados do que aqueles no tecido normal adjacente (Fig 5A e 5B). Todos os grânulos foram vermelho na análise de ADN de tecido normal adjacente (Figura 5C), indicando que eles estavam MUT negativo, enquanto que os grânulos verdes (Figura 5D) indicar que eles foram MUT positiva no tecido do tumor. A taxa de MUT foi de 3,1%, calculado pela proporção de grânulos verdes a esferas vermelhas. diferenças significativas na expressão de mutação e de genes entre o tecido tumoral eo tecido normal adjacente demonstrou que MLPA-DABA pode ser aplicado para o diagnóstico precoce da CRC com mutações de baixo nível e uma baixa abundância de expressão gênica.
( A) análise da expressão de genes relacionados com a CRC no tecido normal adjacente; (B) a análise dos genes relacionados com o CRC no tecido tumoral de expressão; (C) a detecção de mutações de tecido normal adjacente; (D) de detecção de mutação de tecido tumoral. contas vermelhas originado a partir da cDNAs de
β-actina Comprar e DNA de tipo selvagem; grânulos verdes provenientes de cDNAs de genes relacionados com o CRC (
C-myc
,
H-ras
,
N-ras
,
CD44v6
e
Cox-2
) e DNA mutante.
Para avaliar a viabilidade de MLPA-DABA na detecção não invasiva de amostras clínicas, foram utilizados bancos de seis pacientes com CCR. Tal como mostrado na Tabela S1, apenas 50% dos seis pacientes de CRC (06/03) foram positivas MUT e 83% dos seis pacientes de CRC (5/6) foram testados com uma elevada expressão de genes relacionados com o CRC em análises não invasivas de amostras de fezes. A taxa de detecção total de MLPA-DABA é de 83%. Com base nos resultados da detecção e o Dukes de pacientes, conclui-se que o nosso método é promissora no diagnóstico precoce de cancro colorrectal, porque a taxa de detecção de pacientes nas fases iniciais (Dukes as fases A e B) é tão alta quanto 75% (04/03). Nós acreditamos que a taxa de detecção pode ser adicionalmente aumentada, aumentando o tamanho do painel de loci e genes relacionados mutação-CRC. Os resultados típicos de MLPA-DABA utilizando uma das fezes dos pacientes de CRC e que a partir de um voluntário saudável são mostrados na FIG 6. O banco foi detectada a partir do paciente a ser CRC MUT positiva com uma elevada expressão de genes relacionados com a CRC, embora as fezes do voluntário saudável foi detectada a ser MUT negativa com uma baixa expressão de genes relacionados com o CRC
(a) a detecção da mutação da amostra de fezes do paciente CRC.; (B) Análise da expressão de genes relacionados com o CRC da amostra de fezes do paciente CRC; (C) Detecção de mutações da amostra de fezes do voluntário saudável; análise (D) da expressão de genes relacionados com o CRC da amostra de fezes do voluntário saudável.
Conclusão
Neste estudo, um ensaio sensível e específico para detecção digitalmente MutS e expressão níveis de múltiplos genes sobre um talão-matriz hidrogel foi desenvolvido. Ao combinar MLPA e talão baseado em emPCR, foi alcançada a amplificação única molécula com iniciadores comuns utilizados para todos os alvos. MLPA foi aplicado na preparação de moldes com extremidades universais a partir de ADN e amostras de cDNA a partir de diferentes fontes, o que favorece a amplificação multiplex. Ao contrário de amplificação analógico em reacções de PCR convencionais, 10
6 reacções de amplificação individuais pode ser levada a cabo simultaneamente em um tubo com emPCR baseadas em esferas
grânulos são imobilizados como uma única camada de um chip de hidrogel para. completar a detecção de elevado débito. Em comparação com os métodos comuns de utilização da acrilamida na electroforese para separar as proteínas e ácidos nucleicos, MLPA-DABA utiliza gel de poliacrilamida para incorporar os grânulos. O pré-polímero do monómero de acrilamida com os grânulos é pontilhado sobre vidro modificado com acrilo e a polimerização é executada para incorporar os grânulos sobre a superfície do chip de vidro com persulfato de amónio e tetrametiletilenodiamina. Devido à elevada permeabilidade de gel com uma estrutura porosa 3-dimensional, as sondas incompatíveis e outras impurezas incorporadas na estrutura porosa pode passar livremente através da estrutura; Assim, as sondas e as impurezas podem ser eficazmente eliminado por electroforese. O elevado desempenho de hidrogel supera os problemas experimentados com outros métodos, tais como a elevada interferência de fundo de lavagem inadequada das sondas restantes. Em MLPA-DABA, o fundo foi significativamente reduzida; posteriormente, a sensibilidade e especificidade do MLPA-DABA foram muito melhorada. Além disso, porque tem características em gel de poliacrilamida e anfifílicos não carregadas, a biocompatibilidade é propício para a hibridação de sondas e alvos num ambiente solução semelhante.
pois o diagnóstico de doenças é feita com base na informação geral de múltiplos genes, não é necessário medir um MUT genética ou a expressão de um gene relacionada com o cancro específico. Um painel de múltiplos genes como um único biomarcador de diagnóstico demonstra uma diferença mais acentuada do que genes individuais. Em MLPA-DABA, um tipo de sinal fluorescente com uma cor foi aplicado de modo a reflectir vários MutS e expressões de vários genes relacionados com a CRC. Ambos informação geral sobre o total de expressão de genes relacionados com o cancro e uma taxa de MUT geral são alcançados através do cálculo da razão entre o número total de grânulos verdes a partir de várias fontes para o número de esferas vermelhas. É digno de nota que as principais etapas do processo de detecção de MUT e do processo de análise de expressão gênica são idênticos; Portanto, MLPA-DABA é capaz de analisar os dois simultaneamente na mesma plataforma de chip, o que é altamente desejável no diagnóstico do cancro. O uso de MLPA-DABA, que tem as vantagens de ser específico de tumores; exigindo fácil amostragem, tem grande precisão; é não-invasivo para o corpo; e não requer nenhuma preparação dieta antes do teste em comparação com outros métodos não-invasivos, como a colonoscopia e exame de sangue oculto nas fezes, é promissor para a análise de células esfoliadas em amostras de fezes de pacientes com CCR e irá tornar-se uma ferramenta poderosa para não-invasivo e precoce diagnóstico de CRC.
Informações de Apoio
Tabela S1. Detalhes e detecção resultados de 6 pacientes usando fezes como material de partida
doi: 10.1371. /Journal.pone.0123420.s001
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