Sumário

Wnt7a é conhecido por ser um supressor tumoral que se perde em NSCLC, mas nenhum mecanismo de perda foi estabelecida. A metilação de regiões promotoras foi estabelecido como um mecanismo comum de perda de expressão supressor tumoral em NSCLC. Nós anteriormente demonstrado que a perda de Wnt7a em linhas celulares não transformadas epiteliais de pulmão levou a um crescimento celular aumentado, a alteração do crescimento da cultura de 3-D, e o aumento da migração. O

Wnt7a

promotor tem uma percentagem mais elevada de metilação em tecido de tumor de NSCLC comparação com o tecido normal do pulmão combinados e metilação da região promotora leva à diminuição da actividade. Foram tratados linhas de células H157 e H1299 NSCLC com 5-Aza-2′-desoxicitidina e detectada perda de

Wnt7a

metilação do promotor, a expressão aumentada Wnt7a, e o aumento da actividade da via de sinalização Wnt7a pulmão. Quando a expressão DNMT1 foi derrubado por shRNA, expressão de Wnt7a aumentou e metilação diminuída. Juntos esses dados sugerem que em NSCLC, Wnt7a é perdida por metilação em um subconjunto de tumores e que esta metilação é mantido pela DNMT1. Restauração de expressão Wnt7a através de desmetilação pode ser uma abordagem terapêutica importante no tratamento do NSCLC

Citation:. Tennis MA, VanScoyk MM, Wilson LA, Kelley N, Winn RA (2012) metilação do

Wnt7a

é modulada por DNMT1 e fumo do cigarro condensado em Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 7 (3): e32921. doi: 10.1371 /journal.pone.0032921

editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 12 Agosto, 2011; Aceito: 06 de fevereiro de 2012; Publicação: 05 de março de 2012

Direitos de autor: © 2012 Tennis et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado por uma concessão NIH R21 (CA153268-01). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de morte por câncer, com opções mínimas disponíveis para o tratamento de tumores geralmente diagnosticados em estágios tardios. Estamos interessados ​​no papel de sinalização Wnt não-canônico no cancro do pulmão de não-pequenas (NSCLC), especificamente as actividades supressoras de tumor de Wnt7a e seu receptor frizzled 9 (Fzd9). Wnt7a é altamente expresso no pulmão embrionário e serve para manter um fenótipo epitelial normal no adulto do pulmão [1], [2]. Estudos anteriores demonstraram que Wnt7a é frequentemente perdida em NSCLC e que a restauração da expressão Wnt7a leva à diminuição da transformada de crescimento em linhas de células NSCLC [2]. células NSCLC com reexpressão de Wnt7a diminuíram a proliferação, diminuição do crescimento independente de ancoragem, ea restauração de um fenótipo epitelial [2]. Wnt7a está localizado no cromossomo 3p25, que é um “hotspot” para exclusão, no entanto, nós suspeitamos que a expressão Wnt7a em NSCLC pode ser regulada por um mecanismo epigenético [3].

A metilação de promotores de gene supressor tumoral em NSCLC foi avaliado em mais de 40 genes, alguns com frequências tão altas como 100% [4]. A perda da expressão de genes, tais como p16 /INK4a por metilação no início do desenvolvimento de NSCLC tem sido proposto como um biomarcador para a detecção precoce [5]. A metilação de genes tais como FHIT têm sido correlacionados com o estadiamento do tumor e o prognóstico em [6] NSCLC. As diferenças na metilação associada com a histologia do tumor foram identificados os genes, tais como RASSF1A e p16 /INK4a [7], [8]. Associações entre a exposição à fumaça do cigarro e metilação aberrante foram observados para p16, RASSF1A e RARβ2 entre outros [9], [10], [11]. A ligação entre a exposição a agentes cancerígenos do tabaco e de metilação podem existir através Metiltransferases DNA (DNMT) que são ativadas por essas substâncias cancerígenas. Se alvos de DNMTs responsáveis ​​pela reparação do DNA tornar-se inadequada inativado por metilação, lesões decorrentes de substâncias cancerígenas podem persistir, levando à tumorigênese [12].

Como a maioria Wnt e estudos de proteínas relacionadas com Wnt no cancro estão relacionados com a sinalização canônica , a identificação de metilação específico do Wnt não é comum. A metilação é conhecido por ser um mecanismo de perda para outros supressores de tumores em NSCLC, mas a maioria dos estudos de Wnt metilação nos antagonistas de Wnt-alvo do pulmão na via de sinalização Wnt canónica. Alguns estudos têm identificado hipermetilação de Wnt5a e Wnt9a em cancros epiteliais e hipermetilação de Wnt7a tem sido observada num subgrupo de cancro pancreático ductal [13], [14], [15], [16]. No presente estudo, demonstramos que a perda de Wnt7a é um evento significativo para as células epiteliais do pulmão e que esta perda é causada por metilação por meio da atividade DNMT1 em um subconjunto de NSCLC.

Resultados

a perda de expressão em células de pulmão Wnt7a conduz a um fenótipo transformado

Demonstrámos previamente que a expressão Wnt7a altera as características de células transformadas com NSCLC. células NSCLC com Wnt7a reintroduzido diminuíram a proliferação, diminuição do crescimento independente de ancoragem, ea restauração de um fenótipo epitelial. O inverso, perda de Wnt7a de uma célula não transformada epitelial, seria esperado para resultar em um aumento nas características de células transformadas. Neste estudo, foi utilizada uma abordagem shRNA para derrubar a expressão do mRNA de Wnt7a em duas linhas de células epiteliais do pulmão não transformadas, HBEC e Beas2B (B2B), e confirmou derrubar por qPCR e Western blot (Fig. 1A). Redução da expressão Wnt7a levou ao aumento da proliferação celular em células B2B, demonstrada por um ensaio de crescimento de células 6 dias (Fig. 1B). HBEC proliferação celular também foi aumentada com a perda de Wnt7a como medido pelo ensaio de MTS (dados não mostrados). Em células B2B, alterações no crescimento em cultura em Matrigel 3D foi observada aos 5 dias com a perda de expressão Wnt7a (Fig. 1C). O aumento da migração de células num ensaio de zero a 24 horas observou-se com a perda de expressão Wnt7a, onde as setas indicam os bordos da zero introduzido (Fig. 1C).

A) Expressão de Wnt7a foi medida por qPCR em HBEC e células B2B após a transfecção estável com Wnt7a shRNA ou um shRNA negativo. Os dados são apresentados como vezes de alteração da expressão Wnt7a normalizadas para GAPDH. As barras de erro são o SE de experiências em triplicado. Wnt7a derrubar também foi confirmada por Western blot com um controle de carregamento de β-actina. B) A proliferação celular foi medida em células que expressam B2B Wnt7a shRNA ou um shRNA negativo. As células foram analisadas num ensaio de crescimento de 6 dias. células C) B2B com Wnt7a shRNA foram analisados ​​num ensaio de cultura 3D utilizando Matrigel e observadas após 5 dias de crescimento para as alterações na morfologia em comparação com um controlo negativo de shRNA. B2B células com Wnt7a shRNA foram também analisados ​​num ensaio de migração e zero observada às 24 horas para o movimento para o zero introduzido em comparação com um controlo negativo de shRNA. As setas indicam os bordos da zero. Imagens representam experiências em triplicado.

Wnt7a é metilado em linhas de células humanas de NSCLC e tecidos

A questão de como expressão Wnt7a se perde poderiam ser abordadas de diversas formas.

Wnt7a

poderia ser suprimida, mutado ou metilado, entre outros mecanismos. Enquanto o cromossomo contendo

Wnt7a

(3p25) é frequentemente suprimida em NSCLC, este mecanismo de perda, juntamente com mutação do gene, atualmente oferece pouco em termos de intervenção terapêutica [17]. A presença do mecanismo de epigenética metilação iria oferecer a possibilidade de utilização de intervenções clínicas actuais para o tratamento de NSCLC. Nós tratada e HBEC células B2B com carcinógeno tabaco NNK, que é conhecido por levar a uma acumulação de DNMT1 e aumento da hipermetilação do supressor de tumores em NSCLC [18]. Nas células tratadas foi observada uma diminuição na expressão de ARNm Wnt7a por QPCR em comparação com células não tratadas (Fig. 2a). a análise de metilação demonstraram que o promotor Wnt7a em células B2B e HBEC aumentou metilação após exposição a 10 uM NNK (Figura 2A). Isto sugeriu que

Wnt7a

é metilado com a exposição ao tabaco e pode ser um mecanismo de perda em NSCLC associado com o tabaco. A fim de determinar se a metilação de

Wnt7a

estava presente no tecido de tumor de pulmão humano, medimos a metilação de uma ilha CpG no promotor em 82 pares de tecido de tumor de pulmão humano e tecido pulmonar normal combinado. por cento metilação dos locais de CpG 13 medidos foi significativamente superior no tecido do tumor em comparação com o tecido normal quando analisados ​​por um teste t emparelhado (Fig. 2B). Tabela S1 mostra a percentagem de metilação de CpG em cada local analisadas e comparadas entre tecidos tumorais e normais. Nenhum complexo CpG único analisado podem ser identificadas como críticas para a inactivação da a

Wnt7a

promotor, no entanto, parece haver uma tendência para o aumento da metilação em tumores em locais de CpG mais perto do local de início da transcrição. Duas linhas celulares de células NSCLC, H157 e H1299, foram identificados como hospedeiros de

Wnt7a

metilação do promotor por pyrosequencing e foram utilizados para posteriores experiências in vitro (Fig. 2B). Estes dados sugerem que a perda de expressão Wnt7a por metilação ocorre num subconjunto de NSCLC.

) células B2B e HBEC A foram tratados com 10 uM de NNK durante 2 horas e a expressão Wnt7a foi medida por qPCR em comparação com um controlo não tratado . As barras de erro são o SEM de ensaios em triplicado. Percentagem de metilação em células B2B e HBEC foi analisada utilizando o sistema de perfis de metilo após 2 h 10 uM NNK tratamento em comparação com células não tratadas. B) percentual média metilação do promotor Wnt7a foi medida por pyrosequencing no tecido NSCLC e em comparação com o tecido adjacente normal do pulmão combinados pelo teste t emparelhado. Percentual média de metilação B2B, linhas de células H157, H1299 e foi medida por pirossequenciao. C) Um promotor de luciferase Wnt7a foi modificado por enzimas de metilação SSSI, Hpall, e HhaI e transientemente transfectados para linhas celulares B2B e HBEC. Dobra-mudança na actividade de luciferase foi medida em comparação com a actividade de luciferase do promotor Wnt7a não modificado. As barras de erro são o SE de experiências em triplicado.

O promotor Wnt7a desativado por metilação é restaurada com 5-aza-2 tratamento desoxicitidina ‘

Como metilação do

Wnt7a

não tinham sido estudados anteriormente, nós quisemos verificar que a metilação da região promotora levaria à inactivação do promotor. A

Wnt7a

luciferase promotor foi tratado com SSSI, HpaII e metilases HhaI para determinar o efeito da metilação no

região promotora Wnt7a

. SSSI afecta todos os locais de CpG, Hpall apenas o CpG dentro de 5 “CCGG, e HhaI apenas o CpG dentro 5’GCGC. Transfecção do

Wnt7a

luciferase promotor em B2B e linhas celulares HBEC demonstraram diminuição da atividade luciferase após o tratamento com os três metilases em comparação com um não tratada

Wnt7a

luciferase promotor, indicando que mesmo metilação limitada inactiva o

Wnt7a

promotor (Fig. 2C). Nós tínhamos identificado dois linhas celulares de NSCLC com metilação do

Wnt7a

região promotora, H157 e H1299, e queria para determinar o efeito do tratamento com um agente de desmetilação, desoxicitidina 5-aza-2 ‘(5 Aza). As células foram tratadas com 6 uM de 5 Aza durante 1-4 horas e a expressão de Wnt7a foi medida por qPCR e Western blot. Exposição a 5 Aza levou a um aumento da expressão de ARNm e proteína Wnt7a (Fig. 3A e B). Como esperado, 5 Aza também levou à diminuição da metilação do

Wnt7a e região promotora (Fig. 3D). Wnt7a é conhecido para sinalizar através do seu receptor de Fzd9 para PPARy alvo a jusante, de modo que células tratadas com H157 e H1299 com 5 Aza, juntamente com a transfecção transiente de Fzd9, e analisada a actividade da via de sinalização Wnt7a [19]. O elemento de resposta PPAR luciferase (PPRE), que é activado por PAPRγ, demonstrou actividade aumentada após as células com metilado

Wnt7a

foram expostos a 5 Aza e expressão de Fzd9 (Fig. 3C). Estes dados indicam que o tratamento farmacêutico de células NSCLC pode reverter o estado desnaturado da

promotor Wnt7a

.

A) 157 e 1299 células foram tratadas com 5 Aza por 2 horas e Wnt7a foi medida por QPCR em comparação com os controles não tratados. As barras de erro são o SEM de ensaios em triplicado. B) 157 1299 e as células foram tratadas com 5 Aza para 1, 2, e 4 horas e em comparação com células não tratadas. a expressão da proteína Wnt7a foi medida por imunotransferência com β-actina como um controlo de carga. C) 157 e 1299 células foram transfectadas transientemente com Fzd9 e PPRE luciferase e 48 horas depois foram tratadas com 5 Aza durante 2 horas. A actividade de luciferase foi medida e as células tratadas foram comparadas com um controlo vazio. As barras de erro são o SE de experiências em triplicado. 1299 D) as células foram tratadas com 5 Aza durante 2 horas e a percentagem de metilação do promotor Wnt7a foi medida pelo sistema Metil-Profiler. As células tratadas foram comparadas com um controlo não tratado. barra de erro é a SE de experiências em triplicado.

Wnt7a promotor metilação é modulada por DNMT1

metiltransferases de DNA (DNMT) modulam a metilação do DNA e sua sobre-expressão tem sido associado com câncer de pulmão [4 ]. DNMT1 é conhecida a acumular-se no núcleo de células NSCLC em resposta à exposição ao agente cancerígeno NNK tabaco; verificou-se que a exposição a NNK diminuição da expressão de ARNm Wnt7a medido por qPCR (Fig. 2A) [18]. Quando derrubado expressão de DNMT1 em linhas celulares metilado Wnt7a H157 e H1299 usando shRNA, expressão de DNMT1 diminuiu e expressão de Wnt7a aumentou correspondentemente por qPCR (Fig. 4A). Diminuição da expressão de proteína DNMT1 e aumento da expressão Wnt7a foi também observada em células H1299 (Fig. 4a). Como esperado, a metilação de Wnt7a na DNMT1 derrubar H1299 células diminuiu quando medido por pirossequenciao (Fig. 4B). Semelhante a um estudo realizado por Kassis et al. que a diminuição da proliferação encontrada com depleção de RNAi de DNMT1, observou-se uma diminuição na clonogenicidade em células H1299 com knock down de DNMT1 comparação com transfections vazias e negativos shRNA (Fig. 4C). Observou-se também um retorno ao clonogenicidade da transfecção vazia com a adição de Wnt7a shRNA para as células tratadas DNMT1 shRNA. Este clonogenicidade diminuição observada com DNMT1 shRNA imita tratamento diminui em proliferação observada com restauração da expressão Wnt7a em estudos anteriores [2]. Isto, combinado com o aumento clonogenicidade observado com a adição de Wnt7a shRNA, sugere que a perda de expressão Wnt7a poderia ser, em parte, responsável pelos efeitos negativos associados com a sobre-expressão DNMT1 em NSCLC [20]. Derrube de DNMT3a ou 3b nas células H1299 não resultam em aumento da expressão Wnt7a, sugerindo que DNMT1 é responsável pela

de novo

e metilação de manutenção do

Wnt7a

promotor (Figura S1).

a) de 1299 células foram transfectadas transientemente com DNMT1 shRNA e em comparação com as células transf ectadas com o controlo negativo e vazios shRNA. DNMT1 e a expressão de ARNm Wnt7a foi medida por qPCR e apresentados como vezes de alteração em comparação com o controlo vazio. As barras de erro são o SE de experiências em triplicado. DNMT1 shRNA e um controle shRNA negativo foram estavelmente transfectado em 1299 células e DNMT1 e proteína Wnt7a foram medidos por immnoblot com um controle de carregamento de β-actina. B) transfectadas transientemente células 1299 foram analisados ​​para Wnt7a metilação do promotor utilizando pyrosequencing. DNMT1 shRNA e a células de controlo transfectadas shRNA foram negativos em relação a células vazias. As barras de erro são o SE de experiências em triplicado. C) 1299 células com transiente DNMT1 shRNA e /ou expressão Wnt7a shRNA foram comparados com um controlo vazio e shRNA controlo negativo num ensaio de clonogenicidade. As células foram coradas após 4 dias de crescimento, fotografadas e contadas para a clonagem de eficiência. As barras de erro são o SE de experiências duplicadas.

exposição ao cigarro fumo condensado leva a Wnt7a promotor metilação

A metilação foi mostrado para ser aumentada com a exposição a agentes cancerígenos do tabaco, por isso estávamos interessados no efeito do condensado de fumo de cigarro (CSC) na metilação do

Wnt7a

promotor [20]. Nós cresceram as linhas de células não transformadas e B2b HBEC em 1% de meio CSC durante 12 semanas e, em seguida, extraiu-se o ARN, ADN, e proteínas. análise QPCR encontrado decréscimo da expressão de Wnt7a em ambas as linhas celulares após 12 semanas de exposição a CSC (Fig. 5A). O aumento da expressão da proteína DNMT1 foi confirmada em células B2B com exposição CSC (Fig. 5B). Como esperado, o aumento da metilação do

Wnt7a

região do promotor foi também identificado em ambas as linhas celulares (Fig. 5C). A exposição do epitélio pulmonar às substâncias cancerígenas na fumaça do cigarro está associado com o aumento da metilação e subsequente diminuição da expressão de Wnt7a.

) células HBEC e B2B A foram tratados com 1% CSC em meio de crescimento de células durante 12 semanas e Wnt7a expressão foi medida por qPCR. As barras de erro são o SE de experiências em triplicado. B) Expressão de DNMT1 foi medida por western blot em células B2B tratados com 1% a CSC durante 12 semanas. Carregando controle é β-actina. B2B células C) e HBEC tratadas com 1% a CSC durante 12 semanas foram analisados ​​por metilação do promotor Wnt7a em comparação com controlos não tratados utilizando o sistema Metil-Profiler. As barras de erro são o SE de experiências em triplicado.

Discussão

Os dados deste estudo apoiam o papel de Wnt7a como um supressor de tumor em células epiteliais pulmonares e enfatizar o papel do Wnt7a em a manutenção de um fenótipo epitelial em tecidos do pulmão de adulto. Wnt7a parece ser única na literatura até à data, como nenhum outro Wnt foi identificada em NSCLC como um supressor de tumor ou como relevantes para a manutenção de um fenótipo epitelial pulmonar. Wnt5a é conhecido para antagonizar a sinalização β-catenina em cancro do esófago, mas em NSCLC de expressão Wnt5a parece aumentar a proliferação de [13], [21], [22]. O efeito significativamente adverso da perda de Wnt7a em células epiteliais de pulmão motivado a determinação de um mecanismo de perda. Também importante é o potencial para abordar estratégias terapêuticas que empregam reexpressão de Wnt7a.

perda frequente de Wnt7a em NSCLC foi descrito anteriormente e no presente estudo, foram apresentados dados de apoio a importância da expressão de Wnt7a para o pulmão epitélio [2]. Quando a expressão Wnt7a é perdido a partir de linhas celulares não transformadas epiteliais do pulmão, as células adquirem características de células transformadas e começar a se assemelhar mais linhas de células NSCLC na taxa de proliferação, o crescimento da cultura 3D, e migração. Se esta perda de Wnt7a viesse a ocorrer num paciente humano, em combinação com um aumento da actividade de oncogenes, os efeitos podem conduzir ao desenvolvimento de um tumor pulmonar que tenha sido submetido EMT, que está associada a um pior prognóstico [23].

DNMT1 se pensa ser responsável por manter padrões de metilação e a sua expressão elevada foi identificada como um factor de prognóstico da progressão NSCLC [24]. Descobrimos que quando a expressão DNMT1 é reduzida, Wnt7a metilação é reduzida e expressão aumenta. Também mostrámos que Wnt7a é responsável por uma parte do crescimento celular observado com diminuição da perda DNMT1. Tipicamente, um DNMT adicional está envolvida em casos específicos de novo gene de metilação do promotor, enquanto mantém DNMT1 esta metilação. No entanto, estudos recentes têm relatado que DNMT1 também tem

de

atividade novo metiltransferase em regiões CpG [12]. A nossa descoberta de que a perda de expressão ou DNMT3a 3b não resulta no aumento da expressão em células H1299 Wnt7a sugere que DNMT1 pode ser o único DNMT responsável pela metilação do promotor de Wnt7a. Se assim for, isto pode tornar a desmetilação terapêutico de

Wnt7a

através da redução da actividade DNMT menos complicado uma vez que apenas uma DNMT teria de ser alvo e monitorizada.

A exposição a carcinogénios do tabaco in vitro e in vivo foi associada a alterações na actividade DNMT e alterações epigenética [11], [18], [25], [26]. No nosso estudo, o tratamento de células epiteliais não transformadas pulmonares com CSC levou a um aumento da metilação de Wnt7a e uma diminuição correspondente na expressão. Um estudo anterior por Liu et al. encontrada diminuição da expressão Wnt7a pela matriz após exposição CSC [11]. Vários estudos têm demonstrado um aumento da expressão da proteína ou acumulação DNMT1 e aumentou a metilação de genes específicos após a exposição a carcinogénios do tabaco [18], [25], [26]. A perda da expressão Wnt7a foi identificado como um evento frequente em NSCLC, mas este estudo é o primeiro a sugerir um mecanismo de perda e para mostrar que carcinógenos do tabaco pode influenciar esta perda [2].

Wnt7a desempenha um significativo papel na manutenção de um fenótipo epitelial normal no tecido pulmonar. Como tal, a perda de Wnt7a podem ter um grande impacto sobre o desenvolvimento do cancro do pulmão, especialmente quando combinado com a regulação positiva de um oncogene influente. Este estudo investiga a importante questão de como Wnt7a expressão é perdida e como sua expressão pode ser restaurada em um esforço para tratar o câncer de pulmão. Restauração de expressão Wnt7a também pode ter potencial de aplicação em outros cancros epiteliais ou doenças pulmonares. restauração terapêutica de Wnt7a sinalização em NSCLC poderia ser conseguida com agentes que já estão em utilização clínica, incluindo agentes de desmetilação e o análogo de prostaciclina Iloprost, que recentemente identificado como um activador da via Wnt7a [27] sinalização. Os trabalhos irão ser feito para estabelecer o momento da perda Wnt7a eo potencial efeitos in vivo de tratamento para

Wnt7a

metilação. Os dados deste estudo apresentar um passo significativo e previamente não descritas para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para Wnt7a NSCLC.

Métodos

cultura de células, tecidos humanos, e reagentes

NSCLC e linhas de células Beas2B foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com soro fetal bovino a 10%, a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 incubadora. A linha celular HBEC (células epiteliais brônquicas humanas) foi cultivada em meios basais epiteliais brônquicas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 incubadora. As linhas celulares foram obtidas de ATCC (www.atcc.org), excepto a linha de células HBEC, que foi obtida em 2009, a partir de Dr. Robert Doebele na Universidade do Colorado, Denver, [28]. Morfologia de todas as linhas de células foi monitorizado duas vezes por semana e os estoques de linhas de células foram subcultivadas não mais do que dez vezes para serem utilizados em experiências. ARN e ADN de 82 pares de tecido de pulmão humano e o tecido de pulmão normal adjacente foram obtidos a partir da Universidade do Colorado Cancer Center esporo em Câncer pulmonar Patologia do núcleo. NNK (Sigma) foi aplicada a 10 uM durante 2 horas em meio de crescimento celular. As células foram tratadas com 5-aza-2′-desoxicitidina (5 AZA) (Sigma) a 6 uM em meio de crescimento de células durante 1-4 horas dependendo do ensaio. A fumaça do cigarro condensado (CSC) (Murty Pharmaceuticals) foi aplicado a uma concentração constante de 1% no meio de crescimento celular para as 12 semanas.

estudos Knockdown, a proliferação, a cultura 3D e ensaio de zero

expressão Wnt7a foi derrubado de forma estável em HBEC e linhas celulares B2B utilizando um sistema shRNA lentiviral de Open Biosystems com a seleção puromicina. Dnmt expressão foi derrubado usando Sure-silenciamento shRNA de SABiosciences com a seleção higromicina para a expressão estável. batida de transientes de baixo Wnt7a foi alcançado com um sistema de shRNA retroviral de Open Biosystems. Proliferação análise foi realizada em células B2B usando uma contagem de células 6 dias, onde números iguais de células foram semeadas em poços de seis e um poço é contado cada dia. Em células HBEC, o ensaio celular Titer aquoso (Promega) foi utilizado e as células foram analisados ​​a cada 24 horas durante 72 horas. Em 1299 células, foi utilizado um ensaio de clonogenicidade, onde 1000 células foram plaqueadas em meio de crescimento normal e coradas com violeta de cristal para o crescimento do clone no dia 4. As colónias foram fotografadas e contadas para a clonagem de eficiência. Eficiência de clonagem é o número de colónias, dividido pelo número de células plaqueadas. Tridimensionais culturas de membrana basal foram estabelecidas como previamente descrito [29]. Resumidamente, 5000 células /poço foram cultivadas em matrigel% 2 (BD Bioscience) com EGF sobre uma camada de base de matrigel 50%. Para o ensaio de zero, as células foram cultivadas em meio de crescimento completo, até 90-100% confluentes. Um espaço de 3 milímetros foi introduzido em todo o diâmetro de cada placa. Ao tempo zero, as células foram tratadas com 1 ug /ml de mitomicina para inibir a proliferação celular. A migração celular foi registada a 24 horas. As imagens foram capturadas usando uma lente de 40 × em um microscópio de luz e uma câmera digital.

A transfecção

O plasmídeo repórter Elemento de Resposta PPAR luciferase (PPRE) (3 g), o plasmídeo Fzd9 e Wnt7a -luciferase foram transfectados para células utilizando Lipofectamina Reagent (Invitrogen; Carlsbad, CA, EUA). As células foram recolhidas, lavadas com PBS e ressuspensas em Tampão de Lise Repórter da luciferase (Promega). Os dados são apresentados como vezes de mudança em unidades de luz /miliunidades relativas de β-galactosidase e representam a média de três experiências independentes. Modificação da luciferase foi realizado com Wnt7a SSSI, Hpall, e HhaI de acordo com o protocolo do fabricante (New England Biolabs). transfecção transiente ou estável de DNMT e Wnt7a shRNA foi realizado utilizando Sure-silenciamento shRNA de SABiosciences ou shRNA retroviral De Open Biosystems e Attractene Transfection Reagent (Qiagen).

Quantitative PCR

RNA foi extraído de células com o AllPrep ADN /ARN Mini Kit (Qiagen) e 5? g de ARN foi convertido em cDNA. PCR foi realizado utilizando SABioscience RT

2 primers e master mix. GAPDH foi utilizada para normalizar todas as amostras. Os dados QPCR é apresentado como vezes de mudanças nos níveis de mRNA normalizados no controle vs amostras experimentais e são a média dos experimentos, pelo menos em triplicado com erro padrão apresentados como barras de erro.

análise Immunoblot

Células foram colhidas e os extractos de proteína foram preparados utilizando um tampão de quinase mAP. As proteínas foram detectadas por quimiluminescência e o sistema ChemiDoc (BioRad). Os anticorpos seguintes foram usadas para imunoblotting: Wnt7a (R D Systsems), DNMT1 (Abcam) e β-actina (Abcam). β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

metilação do DNA análise

O ADN foi isolado a partir de linhas celulares de tumor e amostras utilizando o kit AllPrep ADN /ARN Mini (Qiagen) e modificados utilizando o EZ kit DNA metilação-Gold (Zymo Research). 1 ug de DNA foi usado para pyrosequencing para

Wnt7a

em um ensaio concebido e realizado por Epigendx. Dados de pyrosequencing é apresentado como percentagem média de metilação, que é a média da percentagem de metilação de CpG em 13 locais no interior da ilha CpG no promotor Wnt7a. O sistema Metil-Profiler SABiosciences foi usada para medir Wnt7a metilação em 5-aza e CSC células tratadas. Os dados são apresentados como percentagem de DNA metilado dentro do promotor Wnt7a.

Informações de Apoio

Figura S1.

Expressão da Wnt7a não é aumentada com DNMT3A ou knockdown 3B. QPCR foi usado para medir os níveis de ARNm de DNMT3A ou 3B e Wnt7a em células H1299 com knockdown de DNMT3A ou 3B. dados shRNA é comparado a um controle negativo e apresentado como fold-change normalizados para GAPDH

doi:. 10.1371 /journal.pone.0032921.s001

(TIF)

Tabela S1.

Metilação de tecido de tumor de pulmão humano foi analisada utilizando pyrosequencing. Cada tumor foi analisado em 13 locais CpG no

Wnt7a

promotor. A percentagem de tumores metilados em maior que 0% do DNA está indicado na parte inferior da mesa para cada local. A metilação do tecido pulmonar normal combinado para os tecidos tumorais da Tabela S1 foi analisada por pirossequenciao. Cada amostra foi analisada em 13 locais CpG no promotor Wnt7a. A percentagem de amostras com metilação maior que 0% é indicado na parte inferior da mesa para cada local

doi:. 10.1371 /journal.pone.0032921.s002

(PDF)