Abstract

fator de necrose tumoral-α (TNF) ativa tanto de morte celular e sobrevivência celular. A activação da via de sobrevivência torna a maioria das células cancerosas resistentes a citotoxicidade induzida pelo TNF. Nós descobrimos que o tratamento prévio com digitoflavone, um flavonóide planta, morte celular por apoptose induzida por TNF muito sensibilizados em várias células de câncer pancreático humano. Na pesquisa da base molecular do efeito de sensibilização de digitoflavone, digitoflavone inibe a activação induzida por TNFa de factor de transcrição nuclear kappa B (NF-kB) que é o principal factor de sobrevivência na sinalização de TNFa. supressão de NF-kB ocorreu através da inibição da activação de cinase IκBα, fosforilação IκBα, degradação IκBα, e a translocação nuclear de NF-kB. Esta inibição correlacionado com a supressão de genes de NF-kB-dependentes envolvidas no antiapoptose (mcl-1, Bcl-2, Bcl-XL, c-IAP1, c-IAP2, aleta, e survivina), de proliferação (c-myc, ciclina D1 ), e angiogese (VEGF, COX-2, e MMP-9). Além disso, pode activar digitoflavone JNK através da inibição da sinalização de NF-kB, proporcionar um efeito de bloqueio contínuo do mecanismo inibitório de feed-back por activação do NF-kB induzida pela JNK. Este estudo encontrou uma nova função de digitoflavone e aumentou o valor de digitoflavone como um agente anticancerígeno

Citation:. Cai X, Lu W, Yang Y, Yang J, Ye J, Gu Z, et al. (2013) Digitoflavone Inibe IκBα Kinase e aumenta a apoptose induzida por TNF através de regulação negativa do Expression dos produtos do gene Factor Nuclear kB Regulamentados em células de cancro pancreático humano. PLoS ONE 8 (10): e77126. doi: 10.1371 /journal.pone.0077126

editor: Wenhui Hu, da Escola de Medicina da Universidade de Temple, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de agosto de 2012; Aceito: 08 de setembro de 2013; Publicação: 11 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Cai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (Nos. 30701098, 30873410 e 81073101), Natural Science Foundation da província de Zhejiang (No. Y2090676) e do Programa de Outstanding Líder da província de Jiangsu da Medicina tradicional chinesa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é a quarta principal causa de morte em pacientes com câncer em os EUA e é um problema global de tratamento de câncer [1]. modalidades tradicionais de tratamento para o câncer pancreático irressecável incluem radiação sozinho, apenas quimioterapia ou chemoradiation combinados. No entanto, de um ano e cinco anos as taxas de sobrevivência são apenas 15% e 5%, respectivamente, [2], [3]. A principal droga actualmente utilizado no tratamento de doentes que têm cancro do pâncreas é a gemcitabina, a qual tem uma taxa de resposta objectiva de apenas 5% [4]. Quimiorresistência de células de tumor é, aparentemente, a maior causa de falha da quimioterapia convencional para o tratamento de cancro pancreático. factor nuclear kB (NF-kB) é um dos factores que contribuem envolvidas na resistência à quimioterapia [5], [6]. Mais de 90% das células de cancro do pâncreas Harbor K-ras mutado [7], e de NF-kB é um efector a jusante de Ras oncogénica este [8], [9], [10]. O NF-kB é activado constitutivamente no adenocarcinoma do pâncreas primários e linhas celulares de cancro pancreático [8], e regulados negativamente NF-kB constitui o fundamento lógico biológica para a gestão eficaz dos doentes com carcinoma do pâncreas, utilizando um fitoquímicos não tóxico [11]. Além disso, a inflamação é sugerido para ser um componente crítico de cancro pancreático [12], e a activação de NF-kB é essencial para o processo inflamatório [13]. Assim, o desenvolvimento de compostos que alvo de NF-kB é proposto como uma abordagem para o tratamento de pacientes com cancro pancreático [6], [14], [15].

factor de transcrição nuclear kappa B (NF -κB) é de importância crítica para a sobrevivência de células de tumor, crescimento, angiogénese e metástases. Sob condições normais, o NF-kB, que consiste de p50, p65, e IκBα, está localizada no citoplasma. No entanto, quando activados, este factor de transcrição se transloca para o núcleo. Em resposta a um sinal de activação, a subunidade inibidora IκBα sofre fosforilação, ubiquitinação e degradação, expondo, assim, sinais de localização nuclear sobre o heterodímero p50-p65. O p65 em seguida, é fosforilado, o que leva à sua translocação nuclear e se ligar a uma sequência específica de ADN, o que por sua vez resulta na transcrição do gene [16], [17]. NF-kB foi mostrado para regular a expressão de um número de genes, cujos produtos estão envolvidos em tumorigénese [17], [18], [19], [20], [21]. Estes incluem os genes anti-apoptóticos (por exemplo, CIAP, survivina, tráfego, cflip, BFL-1, Bcl-2 e Bcl-XL), genes inflamatórios que as moléculas de codificação de adesão (COX-2, MMP-9, e VEGF), e os genes , genes reguladores quimiocinas, e do ciclo celular (por exemplo, ciclina D1 e c-myc). Assim, os agentes que inibem a activação de NF-kB têm potencial terapêutico para o carcinoma pancreático [22], [23], [24], [25], [26], [27], [28].

Digitoflavone (Dig) é um flavonóide comum que está presente em muitos tipos de plantas, tais como frutos, legumes e ervas medicinais. Plantas ricas em digitoflavone têm sido utilizados na medicina tradicional Chinesa para o tratamento de várias doenças tais como hipertensão, doenças inflamatórias, e cancro. propriedades anti-cancro do Digitoflavone está associada com a indução de apoptose e inibição da proliferação celular, metástase e angiogénese [29]. Digitoflavone sensibilizados significativamente a apoptose induzida por TNFa, em uma série de linhas de células de cancro pancreático humano, um efeito que foi descoberto pela primeira vez pelo presente estudo. Tal sensibilização está intimamente associada com efeito inibitório do digitoflavone na ativação de NF-kB, que subregulado alguns genes anti-apoptóticos chave, tais como c-IAP1 e VEGF. Digitoflavone poderia activar JNK, um processo crucial na sensibilização de digitoflavone sobre a apoptose induzida por TNFa. Os dados deste estudo avançado nossa compreensão do mecanismo molecular envolvido na atividade anticâncer de digitoflavone.

Materiais e Métodos

2.1 Materiais

Digitoflavone foi adquirido a Nanjing TCM Instituto de Chinese Materia Medica, China. Este foi dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) como uma solução estoque G /20 mmol e armazenado a -20 ° C.

Escherichia coli

-derived factor de necrose tumoral-α humano (TNF-α), que é adequado para a cultura de células, foi obtido a partir de Sigma, Inc. tripsina e MTT foram obtidos da Sigma, EUA. O tampão de lise foi comprado de Beyotime, China. Os anticorpos (caspase-3, caspase-8, anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho de cabra-HRP e anti-IgG de coelho-HRP) foram obtidos de Santa Cruz, EUA. Anticorpos Ciclo D1, COX-2, MMP-9, VEGF, Mcl-1, Bcl-2, Bcl-X

L, c-IAP1, c-IAP2, FLIP, Survivin, PARP, IKKα /β, p IKKα, p-IKKβ, IκBα, P- IκBα, JNK, e p-JNK foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology, EUA. Monoclonal de ratinho anti-desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) foi obtido a partir de Kangchen, China. O vector de expressão de p65, pCMV-p65, foi um presente amável do Dr. fang Wang, Harvard Medical School, Boston.

2.2 Cultura Celular

linhas de células pancreáticas humanas PANC-1, Colo-357 e BxPC-3 foram adquiridos no celular Banco de Xangai Instituto de Bioquímica e Biologia celular. As células foram cultivadas em meio DMEM (por PANC-1, Colo-357 células) ou RPMI-1640 (para BxPC-3 células) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 U /mL de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina (todos disponíveis a partir de Invitrogen, Grand Island, NY, EUA). Todas as culturas foram mantidas num ambiente humidificado com 5% de CO

2 a 37 ° C.

2,3-anexina V /PI dupla marcação Ensaio

células de cancro pancreático foram tratados com digitoflavone ( 40 uM), TNFa (20 ng /mL) isoladamente ou em conjunto, a 37 ° C durante 24 h. As células foram então colhidas, lavadas e ressuspensas com PBS. As células apoptóticas foram determinados usando um Anexina V Apoptosis Detection Kit FITC (BD Biosciences, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram lavadas brevemente e subsequentemente incubadas durante 15 min em 100 uL de 1 x tampão de ligação, que contém 5 uL de anexina V-FITC e 5 mL de PI, no escuro, à temperatura ambiente. Depois disso, a apoptose foi analisada por laser de fluxo FACScan citómetro (FACSCalibur, Becton Dickinson, EUA). Os dados foram analisados ​​usando o software CELLQuest.

2.4 NF-kB luciferase Reporter Assay

células PANC-1 foram transfectadas transitoriamente com o vaga-lume dependente construção repórter luciferase NF-kB e constitutivamente expressando Renilla luciferase construir (40:1) usando o Lipofectamine 2000 de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen, EUA). a actividade da luciferase de pirilampo foi determinada e normalizada em relação ao nível de controlo de Renilla, utilizando a luciferase dupla Reporter Assay System (Promega EUA).

2.5 Activação do NF-kB

A actividade de ligação a ADN de NF- kB foi determinada por ensaio de desvio de mobilidade electroforética (EMSA) seguido instruções do kit LightShift EMSA quimioluminescente (Pierce, EUA). Os extractos nucleares foram preparados utilizando NE-PER nuclear e citoplasmática Extraction Kit (Pierce, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Os extractos nucleares foram incubadas com biotina marcado na extremidade, de cadeia dupla de oligonucleótido de NF-kB (5′-AGTTGAGGGGACTTTCCCAGG-3 ‘) ou Oct-1 oligonucleótido (5′-TGTCGAATGCAAATCACTAGA A-3’) (Beyotime, China) durante 20 min a temperatura do quarto. O complexo ADN-proteína formado foi separado em gel de poliacrilamida nativa a 5%. O DNA foi então rapidamente transferido para uma membrana de nylon positivo, UV reticulado, sondados com estreptavidina-HRP, incubadas com substrato e exposta a filme de raios-X.

2,6 IκBα Degradação e fosforilação

para determinar o efeito de digitoflavone no dependente de TNFa degradação IκBα e fosforilação, prepararam-se extractos citoplasmáticos tal como descrito anteriormente [30] a partir de células de cancro do pâncreas pré-tratados com digitoflavone durante 7 h e, em seguida, expostas a 20 ng /mL de TNFa durante 5, 10, e 20 min. Os extractos foram, em seguida, resolvido em 13% de gel de SDS-poliacrilamida. Após a electroforese, as proteínas foram electrotransferidas para membranas de PVDF (Millipore, EUA), sondados com anticorpos contra IκBα e IκBα fosforilada, e detectado utilizando quimioluminescência (substrato Luminata crescendo Ocidental HRP, Millipore, EUA).

2,7 Binding a potência do digitoflavone para o local de ligação do ATP de IKK

para determinar a potência de ligação de digitoflavone para o local de ligação do ATP de IKK, foi realizada por ensaio de ligação KINOMEscan (LeadHunter descoberta Serviços) quinase. Resumidamente, as estirpes do fago T7 marcado-quinase foram preparados em um

E. coli

acolhimento derivada da estirpe BL21.

E. coli

foram cultivadas até à fase log-e infectadas com o fago T7 e incubado com agitação a 32 ° C até a lise. Os lisados ​​foram centrifugados e filtrados para remover os detritos celulares. As cinases restantes foram produzidos em células HEK-293 e subsequentemente marcadas com ADN para a detecção de qPCR. contas magnéticas revestidas com estreptavidina foram tratados com pequenas moléculas ligandos biotinilados durante 30 minutos à temperatura ambiente para gerar resinas de afinidade para ensaios de cinase. Os grânulos liganded foram bloqueados com excesso de biotina e lavou-se com tampão de bloqueio (SeaBlock (Pierce), 1% de BSA, 0,05% de Tween 20, 1 mM de DTT) para remover o ligando não ligado e para reduzir a ligação não específica. As reacções de ligação foram montados através da combinação de quinases, contas de afinidade liganded, e compostos de teste em 1 × tampão de ligação (20% SeaBlock, 0,17 × PBS, 0,05% de Tween 20, DTT 6 mM). Todas as reacções foram realizadas em poliestireno placas de 96 poços num volume final de 0,135 ml. As placas de ensaio foram incubadas à temperatura ambiente com agitação durante 1 hora e as esferas de afinidade foram lavadas com tampão de lavagem (1 x PBS, 0,05% de Tween 20). As esferas foram, em seguida, re-suspensas em tampão de eluição (1 × PBS, 0,05% de Tween 20, 0,5 uM de ligando de afinidade não biotinilado) e incubadas à temperatura ambiente com agitação durante 30 minutos. A concentração em quinase dos eluatos foi medido por qPCR.

2,8 JNK Ensaio de Activação

Para determinar o efeito da activação de JNK em digitoflavone induzida por TNFa, por Western blot foi usado para realizar ensaio de JNK. Resumidamente, os extractos citoplasmáticos foram preparados a partir de células de cancro do pâncreas tratados com digitoflavone 40 uM durante 7 h e, em seguida, tratado com 20 ng /mL de TNFa durante 5, 10, e 20 min. Os extractos foram, em seguida, resolvido em 13% de gel de poliacrilamida-SDS e analisados ​​por transferência de Western utilizando um anticorpo contra a JNK e p-JNK.

2.9 Transfecção de p65

A transfecção foi realizada em 6- bem placas usando Lipofectamin reagente 2000 (Invitrogen, Paisley, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram cultivadas em placas de 6 cavidades e foram transfectadas com o vector apropriado (2? G) no dia seguinte. Após 4 h, a mistura de transfecção foi removido e substituído com meio completo. tratamentos de células foram, em seguida, levada a cabo 24 h pós-transfecção, tal como indicado.

2,10 NF-kB Targeted Gene Expression Análise

Para determinar o efeito de digitoflavone em induzida por TNFa de NF-kB do gene alvo expressão , Western blot foi usado para realizar a expressão da proteína de ensaio. Resumidamente, os extractos citoplasmáticos foram preparados a partir de células de cancro do pâncreas não tratadas ou pré-tratadas com 40? M digitoflavone durante 7 h e, em seguida, tratado com 20 ng /mL de TNFa durante 2, 4, 8, 12, e 24 h.

2.11 real-Time PCR quantitativa (qPCR)

o ARN total foram extraídos utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. 2 ug de ARN total foi usada para a síntese de ADNc com iniciadores aleatórios de hexâmero. qPCR foi realizado utilizando um Prism 7500 Sequence Detection System ABI (Applied Biosystems). As reacções foram realizadas por instruções de SYBR Green (Thermo Scientific, EUA) em triplicado, em três experiências independentes. As sequências dos iniciadores são fornecidos na Tabela 1. A ΔΔC

T método foi utilizado para a determinação qPCR. GAPDH foi usada como gene de manutenção para normalizar a variabilidade nos níveis de expressão.

2,12 Detecção de VEGF por ELISA

concentração de VEGF no meio condicionado a partir de células de carcinoma pancreático humano foi medida utilizando um kit de ELISA comercialmente disponível (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA). As células (3 x 10

5 /poço) foram incubadas durante a noite em placas de 6 poços em um meio que contém 10% de FBS. Os meios foram então substituídos por 24 h com meio isento de soro que contêm digitoflavone, TNFa ou digitoflavone combinado com TNFa. VEGF foi expressa em picogramas de proteína VEGF por meio mililitro e por 10

5 células.

2,13 Statistical Analysis

Os dados numéricos são apresentados como média ± D.P.. a partir de pelo menos três conjuntos de experiências independentes. As diferenças entre os diferentes grupos foram examinados usando um one-way ANOVA com teste de Scheffe (SPSS 11) e

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

3.1. digitoflavone potenciada efeitos apoptóticos de TNFa

foram examinados os efeitos de digitoflavone sobre os efeitos apoptóticos de TNFa. TNFa por si só não induziu uma quantidade significativa de apoptose; No entanto, quando combinado com digitoflavone, os efeitos citotóxicos de TNFa foram melhorado (Fig. 1). Digitoflavone combinado com TNF aumentou a taxa de apoptose cerca de 180-240% do que sozinho TNFa.

apoptose celular foi determinada por Kit anexina V FITC Apoptosis. *

P

0,05 comparando com o controlo não-tratadas; e #

P

. 0,05 em comparação com o grupo com TNFa única

3.2 Digitoflavone suprimida NF-kB-dependente Reporter Gene expressão induzida por TNFa

examinaram o efeito inibitório do digitoflavone na actividade transcricional de NF-kB em células PANC-1, utilizando o ensaio de repórter de luciferase de NF-kB. Como mostrado na Figura 2, o tratamento com TNFa melhorada significativamente a actividade de transcrição NF-kB e de pré-tratamento digitoflavone marcadamente suprimida a transactivação de NF-kB induzida pelo TNFa. A actividade da luciferase reduzida por digitoflavone pode, devido à sua inibição directa da actividade da enzima luciferase. Para excluir essa possibilidade, foi realizado digitoflavone pós-tratamento. As células foram primeiro tratadas com TNFa (20 ng /mL) durante 2 h, seguido de tratamento (40 uM) digitoflavone durante mais 2 h. É bastante interessante para descobrir que digitoflavone pós-tratamento não conseguiu inibir a transactivação de NF-kB induzida por TNFa, sugerindo que digitoflavone não suprime NF-kB pós-transcricional de ativação e não representam a inibição direta a atividade da enzima luciferase.

células PANC-1 foram cotransfectadas com NF-kB pirilampo depende construção repórter luciferase e constitutivamente expressando construção luciferase Renilla. As células foram então tratadas com digitoflavone (40 uM) para diferentes tempos (1 h, 3 h, 5 h, 7 h). Outras células do grupo (o grupo de pré-tratamento) foram tratados com digitoflavone (40 uM) para diferentes tempos (1 h, 3 h, 5 h, 7 h), seguido de TNFa (20 ng /mL) durante 2 h. O grupo de pós-tratamento foram tratados com TNFa (20 ng /mL) durante 2 h, seguido por digitoflavone (40 uM) para diferentes tempos (1 h, 3 h, 5 h, 7 h). A actividade da luciferase foi expressa como vezes maior sobre o controle após normalizada com a atividade luciferase Renilla. Os dados são apresentados como médias ± D.P.. a partir de pelo menos três experiências independentes. *

P Art 0,05 em comparação com o controle TNF-não tratado (0 h);

#

P Art 0,05 em comparação com o grupo com TNFa apenas, e

△

P Art 0,05 em comparação com o grupo não tratado TNF-controlo tratado com Dig (7 h).

3.3 Digitoflavone inibido induzível NF-kB Ativação por TNFa

TNFa é um activador de NF-kB, eo mecanismo de indução de NF-kB varia declaradamente entre célula diferente tipos. [31] Assim, nós examinamos se digitoflavone foi eficaz no bloqueio da activação do NF-kB em três linhas de células de cancro pancreático humano. De acordo com os resultados, digitoflavone completamente inibida induzida por TNFa activação do NF-kB em todas as três linhas de células (Fig. 3), indicando assim que digitoflavone foi eficaz na inibição de TNF-indutível NF-kB em linhas celulares do cancro do pâncreas de diferentes graus de diferenciação.

células de cancro pancreático foram pré-incubadas com digitoflavone (40 uM) durante 7 h e, em seguida, tratado com 20 ng /mL de TNFa durante 30 min a 37 ° C. Os extractos nucleares foram preparados e então testados para a activação de NF-kB pela EMSA. Bottom, EMSA utilizando uma sonda Oct-1 para um controle de carga.

3.4 Digitoflavone inibido TNF-dependente IκBα fosforilação e Degradação

fosforilação IκBα é necessário para a activação de NF-kB. Portanto, nosso objetivo foi determinar se digitoflavone afetados induzida por TNFa IκBα fosforilação que é outra condição para a NF-kB translocação. De acordo com a análise de Western blot que utilizou um anticorpo que detecta apenas a forma fosforilada de serina-IκBα, digitoflavone suprimiu completamente induzida por TNFa fosforilação IκBα (Fig. 4A). IκBα degradação é normalmente necessária para a translocação de NF-kB para o núcleo. Portanto, nosso objetivo foi determinar se a inibição da induzida por TNFa activação de NF-kB por digitoflavone foi devido à inibição da degradação IκBα. Descobrimos que o TNFa induzida degradação IκBα em células de controlo e digitoflavone retardada induzida por TNFa degradação IκBα em PANC-1 e células Colo-357 (Fig. 4a). Por outro lado, o pré-tratamento digitoflavone inibiu parcialmente a expressão dos IκBα (ponto de tempo 0 ‘).

A, digitoflavone inibiu a fosforilação induzida por TNFa de IKKα /β e IκBα. células de cancro pancreático foram incubados com 40 uM digitoflavone por 7 h antes da exposição ao TNFa para diferentes tempos, e então testados para fosforilada IKKα /β e IκBα em fracções citosólicas por análise de transferência de Western. B, digitoflavone teve uma boa potência de ligação para o site da ATP ligação de IKK, com Kd de 7,3 mM e 5,2 mM para IKKα e IKKβ respectivamente.

induzida por TNFa 3,5 Digitoflavone inibido IKK Activation

activação IKK é crítica para TNFa induzida por activação do NF-kB. Digitoflavone suprimiu completamente a activação induzida por TNFa de IKK. Nem TNFa nem digitoflavone exerceu qualquer efeito directo sobre a expressão de proteínas de IKK (Fig. 4A). Os resultados do ensaio KINOMEscan revelou que digitoflavone teve uma boa potência de ligação para o site da ATP ligação de IKK, com Kd de 7,3 mM e 5,2 mM para IKKα e IKKβ respectivamente (Fig. 4B). Estes resultados demonstraram que digitoflavone muito provável subregulado a expressão de produtos de genes NF-kB regulamentados através da inibição da IKK.

3.6 Digitoflavone Poderia Ativo JNK e este efeito foi bloqueado por sobre-expressão de p65

examinaram o efeito do pré-tratamento digitoflavone na activação de JNK induzida por TNFa. TNFa sozinho causou activação rápida e transiente de JNK em células de cancro do pâncreas, tal como demonstrado por um aumento da fosforilação de JNK. Digitoflavone poderia activar JNK, bem como o TNFa, e o efeito de activação não foi enfraquecido quando utilizados em conjunto (Fig. 5). Para determinar os efeitos da sobre-expressão de p65 na activação de JNK, que transientemente transfectadas células PANC-1 com p65 ou um vector vazio e avaliada lisados ​​de células inteiras a partir de células tratadas com digitoflavone por análise de transferência de Western utilizando um anticorpo que reconhece especificamente a forma fosforilada de JNK . Como mostrado na Figura 6, o tratamento digitoflavone resultou na fosforilação sustentada de ambas as P46 e P54 isoformas de JNK. A sobre-expressão de p65 bloqueado digitoflavone activação de JNK induzida.

células de cancro pancreático foram incubados com 40 uM digitoflavone durante 7 h a 37 ° C, e, em seguida, testados para JNK fosforilada em fracções citosólicas por análise de transferência de Western.

PANC-1 As células foram transf ectadas com pCMV-p65 ou vector vazio e tratou-se com digitoflavone (40? M) durante 3 horas ou 7 horas. A actividade de JNK foi determinada por transferência de Western em lisados ​​de célula inteira.

3,7 Digitoflavone inibido NF-kB-regulada Produtos do Gene Expression

COX-2, MMP-9, e endotelial vascular factor de crescimento (VEGF) são conhecidas por serem reguladas por NF-kB. Ciclina D1 e c-Myc regular a proliferação celular e são regulados por NF-kB. NF-kB regula positivamente a expressão de um número de genes implicados no sentido de facilitar a sobrevivência das células de tumor, tais como Mcl-1, Bcl-2, Bcl-X

G, C-IAP1, c-IAP2, FLIP e survivina. Assim, o efeito de digitoflavone na expressão destes genes de NF-kB-regulados e produtos de genes foram também examinados. Tratamento TNFa induzida a expressão de MMP-9, ciclina D1, Mcl-1, Bcl-2, c-IAP1, c-IAP2, inverter e sobreviventes produtos do gene, e digitoflavone aboliu a expressão induzida por TNFa de estes produtos de genes (Fig. 7A -C). Os nossos resultados também indicam que digitoflavone abolida nível de ARNm induzida por TNFa de COX-2, MMP-9, VEGF, ciclina D1, c-Myc, Mcl-1, Bcl-2 e Bcl-X

G (Fig. 7D) .

células de cancro pancreático foram deixados sem tratamento ou incubadas com 40 uM digitoflavone durante 7 h e, em seguida, expostos a TNFa para diferentes tempos. Os extractos celulares totais foram preparados e analisados ​​por Western blot (Fig. 7A-C) ou qPCR (Fig. 7D).

3,8 Digitoflavone suprimida VEGF secreção a partir células de carcinoma de pâncreas

VEGF que é activamente secretado a partir de células tumorais hipóxicas poderia desencadear angiogénese tumoral. A redução de VEGF enfraquece a sua capacidade de estimular a angiogénese tumoral. Portanto, examinámos o efeito de digitoflavone na secreção de VEGF a partir de células de carcinoma pancreático utilizando análise de ELISA. Os resultados indicaram que digitoflavone tratamento durante 24 h a diminuição da secreção de VEGF em comparação com o grupo de controlo com veículo (

P

0,05). A estimulação com TNFa aumento da secreção de VEGF em comparação com o grupo de controlo com veículo (

P

0,05). No entanto, pré-tratamento com digitoflavone bloqueou o efeito de estimulação de TNFa (Fig. 8).

Os dados representativos foram mostradas a partir de três experiências independentes com resultados idênticos. VEGF foi expressa em picogramas de proteína VEGF por meio mililitro e por 10

5 células. *

P

0,05 comparando com o controlo não-tratadas; e #

P

. 0,05 em comparação com o grupo com TNFa única

Discussão

adenocarcinoma de pâncreas é uma neoplasia agressiva e altamente letal. Atualmente, a gemcitabina é comumente usado em pacientes com câncer de pâncreas. No entanto, a expectativa de vida de pacientes com câncer pancreático continua pobre. Tsutom relatou que a injecção intratumoral de TNFa casos inoperáveis ​​recombinantes humanos de cancro do pâncreas trazido sobre a regressão do tumor ou a uma diminuição nos marcadores de tumores [32]. No entanto, uma resposta completa não tinha sido conseguida em qualquer um destes casos, e o resultado global não foi suficiente, possivelmente porque factores citoprotetoras tais como enTNF e MnSOD são abundantes em células de cancro pancreático [33], ou porque os receptores de TNF foram dificilmente expressa. Este refractariedade para TNFa podem ser superados por combinação com um composto citotóxico baixa, o que pode sensibilizar o efeito do TNFa.

Digitoflavone é um flavonóide planta comum que possui propriedades anti-cancro que foram demonstrados por estudos anteriores [29]. Digitoflavone pode ser encontrado em uma grande quantidade de plantas e alimentos, incluindo beterraba, repolho, couve-flor, aipo, pimentão verde, folha perilla, azeite, chá e [34]. Em estudos celulares, digitoflavone foi encontrada para possuir propriedades anti-oxidante, de acção /anti-alérgica, anti-tumorigénica, e radicais anti-inflamatório [35], [36], [37]. Digitoflavone foi relatado para inibir o desenvolvimento de uma série de tumores sólidos, [38], [39], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46], [ ,,,0],47]. Neste estudo, forneceu provas de que digitoflavone sensibiliza a apoptose induzida por TNFa em células de cancro pancreático humano. Tal sensibilização é conseguido através do seu efeito inibitório sobre a activação de NF-kB, que por sua vez resulta em expressão reduzida de genes anti-apoptóticos alvo de NF-kB. Os dados deste estudo revelaram uma nova função de digitoflavone e aumentar o valor de digitoflavone como um útil agente anti-cancro.

activação de NF-kB leva à expressão de genes que estão envolvidos na proliferação e metástase do cancro. Neste relatório, nós mostramos que digitoflavone inibe a expressão da ciclina D1, que é regulado pelo NF-kB. Além disso, os nossos resultados indicam que digitoflavone regula negativamente a expressão de COX-2, MMP-9, e VEGF, que são todos regulados pelo NF-kB. Estes resultados ainda mais implícito que digitoflavone exerceu as suas propriedades anticancerígenas através da inibição de NF-kB. NF-kB regulada a expressão de Mcl-1, Bcl-2, Bcl-X

G, C-IAP1, c-IAP2, inverter, e de survivina, e a sua sobre-expressão em muitos tumores tem sido associada à sobrevivência de células de tumor, quimiorresistência, e radiorresistência. Os nossos resultados indicam que o tratamento digitoflavone regula negativamente a todos estes produtos de genes. Digitoflavone foi mostrado para inibir o crescimento de uma ampla variedade de células tumorais tais como as células de leucemia e células de carcinoma do pulmão de não-pequenas células [30]. Esta inibição de crescimento pode ser mediado através de vários genes de regulação negativa. Regulação negativa de vários produtos de genes anti-apoptóticos por digitoflavone também as células sensibilizadas aos efeitos apoptóticos de TNFa. Outros estudos têm mostrado que digitoflavone tinha uma boa potência de ligação ao local de ligação de ATP de IKK, que demonstrou que digitoflavone muito provavelmente inibida via de NF-kB, através da inibição de IKK. Digitoflavone poderia JNK activo e a sobre-expressão de p65 impediu a activação de JNK induzida por digitoflavone. Dig pode ser um novo fármaco para proporcionar um efeito de bloqueio contínuo do mecanismo inibitório de feed-back por activação do NF-kB induzida pela JNK. Este pode ser o mecanismo por digitoflavone pode sensibilizar TNFa. Claro, verificação mais experimental incluindo

era necessário estudo in vivo

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