Abstract

SIRT3-Expressando SIRT3 é uma chave NAD

+ – deacetilase proteína dependente nas mitocôndrias de células de mamíferos, em funcionamento para prevenir o envelhecimento celular e transformação através da regulação da homeostase metabólica mitocondrial. No entanto, SIRT3 também é encontrada para expressar em alguns tumores humanos; o seu papel nestas células de tumor que expressam SIRT3 precisa de ser elucidados. Este estudo demonstrou que a expressão de SIRT3 foi elevado num grupo de células de cancro gástrico em comparação com as células normais epiteliais gástricas. Embora os níveis de expressão SIRT3 foram aumentados nos tecidos de tumor gástrico em comparação com os tecidos não tumorais adjacentes, as células cancerosas positivas SIRT3 foram mais frequentemente detectadas nos cancros gástricos tipo intestinal do que os cancros gástricos tipo difuso, indicando que SIRT3 está ligada com subtipos de gástrica Câncer. A sobre-expressão de SIRT3 promoveu a proliferação de células e reforçada geração de ATP, a absorção de glucose, a formação de glicogénio, a actividade de MnSOD e produção de lactato, que foram inibidas por SIRT3 knockdown, indicando que SIRT3 desempenha um papel na reprogramação de bioenergética em células de tumor gástrico. Outras análises revelaram que interagiram com SIRT3 e desacetilado a lactato desidrogenase A (LDHA), uma proteína-chave na regulação da glicólise anaeróbica, que aumenta a actividade LDHA. Em consistência, um conjunto de genes associados a glicólise estava sobre-regulada nas células tumorais sobre-expressam SIRT3 gástricas. Assim, para além da homeostase mitocondrial mediada por SIRT3 bem documentado em células normais, podem melhorar SIRT3 glicólise e de proliferação celular em células cancerosas que expressam SIRT3

citação:. Cui Y, Qin G, Wu J, Qu X, Hou C, Sun W, et al. (2015) SIRT3 Melhora a glicólise e proliferação em células de câncer gástrico-Expressando SIRT3. PLoS ONE 10 (6): e0129834. doi: 10.1371 /journal.pone.0129834

editor: Xianglin Shi, da Universidade de Kentucky, United States |

Recebido: 16 de abril de 2015; Aceito: 13 de maio de 2015; Publicação: 29 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Cui et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi parcialmente financiado pela National Science Foundation Natural da China, Programa Key (30930105), Apoio Nacional 12-5 Projeto Plano do Ministério da Ciência e Tecnologia da China (2012BAH30F03), a National Science Foundation Natural da China (31.070.740), a 985 e 211 Projetos de Xi’an Jiaotong University (JKL) e National Cancer Institute RO1 concessão CA152313-01-A1 (JJL).

CONFLITO dE iNTERESSES:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Sirtuins, uma família de NAD

+ – histona desacetilases dependentes (HDACs) em mamíferos células, estão implicados numa vasta gama de processos físicos, incluindo a sobrevivência celular, apoptose, metabolismo, respostas a stress, envelhecimento e longevidade [1,2]. Entre os sete membros sirtuína (SIRT1-7), SIRT3 é o melhor caracterizado sirtuina mitocondrial, a funcionar para regular proteínas mitocondriais envolvidas na fosforilação oxidativa, de oxidação de ácido gordo, do ciclo da ureia, e a resposta do antioxidante [2-9]. Vários estudos têm destacado o papel da SIRT3 no metabolismo e na homeostase em células normais e revelou novas metas e substratos para desacetilação dependente de SIRT3 [10]. Kim et al relataram que SIRT3 é uma proteína chave mitocôndrias, e falta da expressão SIRT3 está associado ao aumento do dano do DNA mitocondrial e ao envelhecimento, bem como uma maior potencial para a transformação celular induzida pela Ras e activação MnSOD mediada por SIRT3 contribuir para a homeostase mitocondrial [11,12]. Em apoio, células 293 de rim embrionário humano células (HEK293) apresentam uma expressão aumentada SIRT3 sob o stress oxidativo, que conduz à activação de desacetilação e MnSOD [13]. SIRT3 se acredita funcionar como um gene supressor de tumor e desempenha um papel fundamental na melhoria da homeostasia celular contra o envelhecimento e carcinogénese.

Contudo, algumas células tumorais mostram a expressão de SIRT3 e o papel potencial de SIRT3 nestas células tumorais , especialmente a sua potencial relação ao fenótipo agressivo, tem sido controverso [14]. expressão SIRT3 é inferior ou indetectável em uma variedade de cancros humanos, incluindo o cancro da mama, glioblastoma, cancro do cólon, e osteosarcoma, próstata e cancro do ovário [11,15,16]. SIRT3 induz a paragem do crescimento e apoptose pelo silenciamento selectivo de Bcl-2 em células HCT116 através de modulação da via de sinalização de JNK2 [17]. Além disso, é relatado SIRT3 contribuir para aumentar a sensibilidade de células de leucemia humana à quimioterapia, possivelmente através de indução de apoptose mediada por mitocôndrias [18]. Por outro lado, a expressão SIRT3 é também descobriu ser aumentada de câncer bucal, câncer de mama linfonodo-positivo, câncer de esôfago, e carcinomas da tiróide; eo aumento da SIRT3 está associado a maior fenótipo maligno e regulação negativa da SIRT3 aumenta a sensibilidade do tumor ao tratamento anti-câncer [19-23]. Estes resultados alertar um papel diferente de SIRT3 em tumores específicos que precisam ser elucidados.

As células cancerosas são metabolicamente ativo e consumir mais combustível celular do que as células normais. No entanto as células cancerosas em retransmitir principalmente na síntese de ATP pela glicólise aeróbica, uma característica conhecida como efeito Warburg [24]. Tal glicólise aeróbica é acreditado para proteger células cancerosas formar estresse oxidativo desde respiração mitocondrial é a principal fonte de ROS intracelular [25]. A lactato desidrogenase A (LDHA) é uma enzima controlar interconversão entre piruvato e L-lactato reversivelmente no passo final da glicólise anaeróbia [26]. A inibição da LDHA diminui o potencial tumorigénico com o aumento do consumo de oxigênio mitocondrial e diminuição do potencial de membrana mitocondrial [26] e da produção de ATP celular total e glicólise [27].

Neste estudo, nós investigamos o papel potencial da SIRT3 na gástrica células cancerosas que expressam SIRT3. Expressão de SIRT3 foi ligado com o crescimento agressivo, que foi mediada através SIRT3-desacetilado e activado LDHA, aumentando a glicólise e a expressão de um grupo de genes associados a glicólise. metabolismo glicólise Assim SIRT3-LDHA mediada pode ser um potencial alvo terapêutico para o tratamento de células cancerosas que expressam SIRT3.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e cultura

câncer gástrico humano linhas de células MGC-803, HGC-27, SGC-7901 [28] e AGS [29] e imortalizadas linha celular epitelial gástrica humana GES-1 [30] foram mantidas em meio RPMI-1640 (Invitrogen) suplementado com 10% de fetal de bovino soro e 1% de penicilina /estreptomicina, e cultivadas a 37 ° C sob uma atmosfera de 5% de CO2.

imunoprecipitação e western blot

células

subconfluentes foram lisadas e os lisados ​​foram incubados com proteína a /G esferas de agarose, mais a quantidade recomendada de anticorpos contra ambos os SIRT3 (Cell Signaling Technology) ou LDHA (Santa Cruze) a 4 ° C durante a noite. As amostras foram centrifugadas e separadas por electroforese SDS em gel de poliacrilamida e electrotransferidas para membranas de nitrocelulose. Após o bloqueio com leite magro a 5% em TBST, as membranas foram incubadas com anticorpo primário a 4 ° C durante a noite, seguido por incubação com anticorpo secundário durante 1 hora à TA. As proteínas de interesse foram visualizadas por kit de detecção ECL (Thermo Fisher).

A imuno-histoquímica ensaio

lâminas patológicos de cancro gástrico com os tecidos normais adjacentes foram analisadas por ensaio de imuno-histoquímica foi realizada seguindo as instruções do fabricante. O kit de detecção de Polímero para a análise imuno-histoquímica foi comprado de Zhongshan Golden Bridge Biotecnologia. Resumidamente, secções de parafina foram desparafinados e re-hidratadas em etanol (100%, 90% e 75%). As secções foram incubadas com 3% H

2O

2 à temperatura ambiente durante 10 minutos e, em seguida, bloqueadas com soro de cabra não imune à TA durante 15 minutos. As secções foram então incubadas com o anticorpo primário a SIRT3 (Cell Signaling Technology) durante 2 horas à t.a., seguido por anti-coelho de incubação anticorpo secundário por 15 minutos à TA. As secções foram então incubadas com o reagente de detecção DAB durante 2 minutos cada, contrastadas com hematoxilina e dehydraded em etanol (90% e 100%). As secções foram montadas e a coloração foi analisada sob a microscopia.

construção do plasmídeo e transfecção de células

cDNA de comprimento total foi SIRT3 sintetizados utilizando RT-PCR com ARN total extraído de células GES-1 como molde (iniciadores: 5 ‘CCGCGGTACCATGGCGTTGTGGGGTTG 3’ e 5 ‘CCGCTCTAGACTATTTGTCTGGTCCATCAAGC 3’). O ADNc foi então clonado em pcDNA3.1 + vector de expressão (Invitrogen). A /GFP /plasmídeo pGPH1 Neo-SIRT3-shRNA alvo SIRT3 humano (5 ‘CTTGCTGCATGTGGTTGAT 3’) e o controle plasmídeo shRNA foram obtidos a partir GenePharma. Para gerar os transfectantes estáveis, AGS e células SGC-7901 foram transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 de reagente (Invitrogen) e os transfectantes estáveis ​​foram seleccionados por 400ug /ml de G418 (Gibco).

proliferação celular e ensaio de clonogenicidade

Para o ensaio de proliferação, as células foram plaqueadas numa placa de 6 poços a 2 x 10

4 células /poço. A proliferação celular foi calculado nos dias 2, 4, 6, e 8 após o plaqueamento. Para o ensaio de clonogenicidade, as células foram plaqueadas numa placa de 6 poços com números celulares variadas e cultivadas durante 14 dias e as colónias foram então coradas com violeta de cristal, e o número de colónias ( 50 células /colónia) foi contado seguindo os métodos estabelecidos [31].

Medição de glicose, lactato e glicogénio

O vermelho de fenol forma livre foi usada para células de cultura em placa de 6 poços por 24 horas e os níveis de captação de glicose e lactato geração foram medidos utilizando o Kit de Ensaio de Glucose e láctico Kit ácido (Jiancheng Bioengenharia Institute). Os valores relativos foram normalizados para o número de células de cada poço. os níveis de glicogênio celulares foram detectadas utilizando o glicogênio Assay Kit (Biovision). Resumidamente, 1 x 10

6 células foram homogeneizadas em 200? L de água em gelo, e os homogenatos foram fervidas durante 5 minutos para inactivar enzimas e centrifugado a 13000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C para remover o material insolúvel. A produção de glicogênio foi medido com o valor OD a 570 nm.

medição da produção de ATP

níveis

Cellular ATP e ROS foram medidos como descrito anteriormente [32]. As células cultivadas numa placa de 6 poços, após vários tratamentos, foram lisadas e os níveis de ATP celular foram medidos com ATP bioluminescência Assay Kit (Sigma). Para medir a produção de ATP mediada por glicólise, as células foram tratadas com 2 uM rotenona durante 24 horas antes das medições.

Medição da geração de ROS

geração celular ROS foi ensaiada com 5- (e 6) carboxi-2 ‘, 7’-dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFDA) método usando espectrómetro de microplacas (Thermo Fisher) a 488 nm /530 nm de comprimento de onda.

actividade de MnSOD

células cultivadas em um de 6 poços placa foram lisadas e a actividade da MnSOD foi determinado por métodos de WST-8 utilizando o kit de ensaio de MnSOD (Beyotime) seguindo as instruções do fabricante.

ensaios de tumorigenicidade em ratinhos nus

SGC7901 células (7,5 x 10

6), com sobre-expressão SIRT3 ou knockdown foram suspensos em 0,1 ml de PBS e inoculou-se em ambos os flancos do macho de 5 semanas de idade BALB /c atímicos ratinhos nus, e no 28

° dia após a inoculação, quando o volume tumoral máxima (~ 1.500 milímetros

3) alcançado no grupo de controle, os experimentos foram encerrados e todos os tumores de cada grupo foram extirpados e pesados. O procedimento experimental envolvendo testes em animais foi conduzido de acordo com as diretrizes institucionais; Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal (IACUC) a Xian Jiao Tong University aprovado especificamente neste estudo (Protocolo # 120181).

lactato desidrogenase ensaio

O lactato foi determinada a atividade da desidrogenase seguindo o protocolo estabelecido através da medição da taxa de redução da absorvância a comprimento de onda de 340 nm, resultante da oxidação de NADH [27]. Resumidamente, as células foram cultivadas em placas de 10 cm e homogeneizados em PBS em gelo. Os homogenatos foram adicionados em tampão contendo NADH 6,6 mM, piruvato de sódio 30 mM e Tris-HCl a 0,2, pH 7,3 e misturou-se. Incubar a mistura durante 5 minutos para alcançar equilíbrio de temperatura e, em seguida, gravar a taxa de diminuição da absorvância a 340 nm.

SIRT3

in vitro

deacetylation ensaio

enzima recombinante SIRT3 humano ( BPS) foi incubada com Desidrogenase L-láctico a partir de coração de bovino (Sigma) em tampão de reacção (50 mM de NaCl, MgCl 4 mM de

2, NAD 10 mM

+, 50 mM de DTT, 50 mM de Tris, pH 8,0) com /sem inibidor SIRT3 nicotinamida (NAM, 10 mM) a 37 ° C durante 1,5 horas, e, em seguida, as reacções foram utilizados para o ensaio de actividade LDHA descrito como acima.

-PCR em tempo real

O ARN total foi isolado utilizando TRIZOL Reagent (Invitrogen), seguido por tratamento com fenol /clorofórmio e precipitação com 2-propanol. Total de sedimento de ARN foi então lavado com 75% de etanol e ressuspenso em água. O ARN foi submetido a transcrição inversa com o kit de PrimeScript RT-PCR (Takara) e quantitativo em tempo real A análise de PCR dos genes de interesse foi realizada utilizando o kit de SYBR PremixExTaq II (Takara) seguindo as instruções do fabricante. Os dados foram normalizados para o nível de γ-tubulina.

Imunofluorescência

AGS células cultivadas sobre a lamela numa placa de 6 poços foram fixados em paraformaldeído a 4% durante 10 minutos e bloqueadas em 1% BSA durante 1 hora à TA. Incubar as células com anticorpos primários contra SIRT3 e LDHA a 4 ° C durante a noite, seguido por incubação com anticorpo secundário conjugado com fluorescência durante 1 hora à TA. A contracoloração foi realizada com DAPI utilizando o kit de imunofluorescência (Beyotime). As células foram montadas e fotografadas pela varredura a laser do microscópio confocal.

A análise estatística

Os dados são apresentados como média ± SE de pelo menos três experiências independentes. A análise estatística foi realizada com o teste t não pareado bicaudal de Student salvo indicação em contrário.

P Art 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

expressão SIRT3 em células cancerosas gástricas

SIRT3 está bem definida na regulação da homeostase mitocondrial em anti-envelhecimento e anti-transformação. Recentemente, diferentes resultados são relatados em relação à inibição mediada por células-SIRT3 e proliferação, levando à controvérsia dos seus papéis em cancros [19,20]. Para determinar o papel potencial de SIRT3 no cancro gástrico, expressão de SIRT3 4 foi detectada em linhas celulares de cancro gástrico AGS, a SGC-7901, MGC-803, HGC-27 e um grupo de tecidos tumorais do cancro gástrico. Descobrimos que os níveis de proteína SIRT3 foram elevados em todas as 4 linhas celulares de cancro gástrico em comparação com os GES-1 epiteliais gástricas imortalizadas células (AGS, 1,9 vezes; SGC-7901, 1,5 vezes; MGC-803, 2,0 vezes; e HGC -27, de 1,8 vezes, em comparação com células GES-1) (Fig 1A). Em conformidade, os níveis de mRNA de SIRT3 nestas linhas celulares foram igualmente aumentadas (AGS, 2,6 vezes; SGC-7901, 1,7 vezes; MGC-803, de 2,5 vezes; HGC-27, 2,2 vezes) em comparação com GES- 1 células (Fig 1B).

a, os níveis de proteína SIRT3 foram determinados pelo western blot em 4 linhas celulares de cancro gástrico e uma linha normal imortalizada células epitélio gástrico GES-1 (painel superior). a expressão da proteína SIRT3 testado em três manchas de Western separadas foi estimado através da medição da intensidade da banda usando o programa Image-Pro Plus Software e normalizado com β-actina (painel inferior). B, os níveis de ARNm SIRT3 foram detectados por qRT-PCR em 4 linhas de células de cancro gástrico. Os dados foram normalizados para células de epitélio gástrico normais imortalizadas. Em (A, B), os dados são apresentados como média ± E.P. (N = 3; *,

p Art 0,05; **,

p Art 0,01). C, SIRT3 expressão em tecidos de tumor gástrico humano (n = 29) e de tecidos não tumorais adjacentes (n = 14) foi detectado por coloração imuno-histoquímica. Os níveis de expressão SIRT3 foram estimados pela digitalização de densidade usando o Image-Pro Plus software e classificado como negativo, fracamente positivo e fortemente positivo. Barra de escala, 50 mm. D, SIRT3 expressão em tecidos tumorais e não tumorais adjacentes foi apresentada como percentagem de amostras de pacientes. E, na expressão SIRT3 intestinal (n = 18) e difusa (n = 11) os tipos de tecidos de tumor gástrico foi apresentada como percentagem de amostras de pacientes.

análise imuno-histoquímica em tumoral e não tumoral adjacente normais tecidos a partir de um grupo de doentes com cancro gástrico demonstraram que as células SIRT3-positivas foram mais frequentemente detectável em tecidos tumorais do que em tecidos normais. Os resultados mostraram que 55,1% dos tecidos tumorais (7% dos tecidos normais) exibiu nível elevado (positivo forte), 41,4% de tecidos de tumor (28% de tecidos normais) exibiu nível médio elevado (fraco positivo), enquanto que 3,5% dos tumores tecidos e 64% de tecidos normais foi negativo na expressão SIRT3 (Fig 1C e 1D, Fig S1A). Curiosamente, SIRT3 expressão no tipo intestinal de tecidos tumorais (15 casos; 93,3% forte positivo e 6,6% fraco positivo) foi significativamente mais elevada do que no tipo difuso de tecidos tumorais (14 casos; 14,3% forte positivo, 78,6% fracamente positiva e 7.1 % negativo) (Fig 1C e 1E, S1B Fig). Estes resultados sugerem que a expressão SIRT3 é aumentada em alguns tumores em comparação com tecidos normais relacionados e SIRT3 expressão pode ser variam em tumores individuais, que precisam ser mais bem investigado.

níveis de SIRT3 estão relacionados com a proliferação de células

Então, nós estabelecemos a superexpressão SIRT3 e linhas de células knockdown usando AGS e células SGC-7901. A expressão de SIRT3 em transfectantes estáveis ​​foi confirmada por Western blot. A sobre-expressão de SIRT3 aumento do crescimento celular, enquanto SIRT3 knockdown crescimento celular inibido de ambas as linhas celulares de cancro gástrico (Fig 2A). Além disso, a sobre-expressão de SIRT3 desencadeadas mais a formação de colónias de células de controlo transfectadas que estava em contraste com apenas menos colónias formadas nas SIRT3 knockdown células (Fig 2B).

, o crescimento de células de AGS e SGC-7901 células com superexpressão SIRT3 ou knockdown foi calculado nos dias 2, 4, 6 e 8 após o plaqueamento celular. SIRT3 expressão em transfectantes estáveis ​​foi confirmada por Western blot. B, clonogenicidade da AGS e células SGC-7901 com superexpressão SIRT3 ou knockdown foi medido e apresentado como a fração de transfectantes de controle (NC ou SCR). C, a sobreexpressão de SIRT3 promovido a carga de tumor in vivo. células SGC-7901 com superexpressão SIRT3 (painel da esquerda) ou knockdown (painel direito) foram injectados por via subcutânea no flanco direito de ratinhos nus com células de controlo relativos (NC ou SCR) no flanco esquerdo. tumores de xenoenxerto foram extirpados e pesados ​​no 28

th dia após a inoculação de células. Imagens de painel direito mostrou tumores de xenoenxerto in vivo no final da experiência. Imagens de canto superior direito mostrou os tumores dissecados de cada grupo. As gamas e os meios de pesos dos tumores de cada grupo foram apresentados no painel da direita como média ± E.P. (N = 5; *,

p Art 0,05; **,

p Art 0,01). SIRT3, SIRT3 superexpressão; shSIRT3, SIRT3 knockdown; NC (controle negativo; pcDNA3.1 vazio) e SCR (corrida shRNA; pGPH1 /GFP /Neo-shRNA) servem como controles para pcDNA3.1-SIRT3 e pGPH1 /GFP /Neo-shSIRT3 respectivamente

para determinar o papel da SIRT3 na capacidade de formação de tumores, que injectado sobre-expressão e células SIRT3 SGC-7901 knockdown nos flancos de ratinhos nus e o crescimento do tumor foi deixada durante 28 dias após a inoculação de células (Fig S2). O peso médio dos tumores derivados de células que sobre-expressam SIRT3 0.7079g foi, significativamente maior do que o peso médio do tumor de controlo (NC),

P

= 0,015, (figura 2C, painel esquerdo). Em contraste, o peso médio de tumores derivados de células knockdown SIRT3 0.0588g foi, significativamente menor do que a partir de células de controlo de encriptação shRNA (SCR) (0.2033g;

P

= 0,009) (Figura 2C, painel da direita) . O volume médio dos tumores derivados de células que sobre-expressam SIRT3 foi aumentada do que a partir de células de controlo (NC) (Fig 2C, painel esquerdo acima do canto direito). Pelo contrário, o volume médio de tumores de crescimento a partir de células knockdown SIRT3 era dramaticamente pequena comparada com a das células de controlo (SCR) (Fig 2C, painel direito canto superior direito).

glicólise reforçada em SIRT3 expressar câncer gástrico células

foram então perguntando como bioenergética celular poderia ser alterada em células cancerosas gástricas-superexpressão SIRT3. SIRT3 superexpressão aumentou drasticamente a absorção de glicose (1,4 vezes em AGS e 1,9 vezes na SGC-7901), enquanto SIRT3 knockdown diminuiu a absorção de glucose (cerca de 40% em ambos os AGS e SGC-7901) (Figura 3A e 3B). Consistente com o padrão de utilização de glucose, as células que sobre-expressam SIRT3 tinham aumentado os níveis de secreção de lactato (1,2 vezes em AGS e 1,3 vezes na SGC-7901), enquanto que as células de knockdown SIRT3 havia diminuição dos níveis de secreção de lactato (55% em AGS e 45 % em SGC-7901) (Figura 3C e 3D). Nós também descobrimos que a formação de glicogênio foi significativamente aumentada por SIRT3 superexpressão (1,5 vezes na AGS e 1,3 vezes na SGC-7901), uma característica de rápido crescimento de células tumorais [33], enquanto reduzida em SIRT3 knockdown (40% em AGS e 70% em SGC-7901) (figura 3E e 3F).

absorção de glucose, a formação de produção de glicogénio e de lactato foram medidas em AGS (a, C, e) e SGC-7901 (B, D, F ) células com superexpressão SIRT3 ou knockdown. Todos os dados são apresentados como média ± E.P. (N = 3; *,

p Art 0,05; **,

p Art 0,01).

SIRT3 tem sido comprovada envolvido na desacetilação de enzimas do metabolismo global e manutenção dos níveis de ATP em células basais, tanto em condições normais e em doenças [1,2]. geração de ATP e ATP glicólise celular total foram detectados em AGS e células SGC-7901, quer com superexpressão SIRT3 ou knockdown SIRT3. Os níveis totais de ATP celular foi aumentada em células que sobre-expressam SIRT3 (cerca de 1,3 vezes em ambas as linhas celulares), mas diminuiu nas células SIRT3 knockdown (cerca de 75% em ambas as linhas celulares), em comparação com células de controlo NC ou SCR (Fig 4A e 4B) . Em seguida, as células tratadas com rotenona para inibir a fosforilação oxidativa, e testado geração de ATP a partir de glicólise. Como é mostrado na Figura 4C e 4D, SIRT3 superexpressão conduziu a um aumento na produção de glicólise ATP (1,4 vezes em AGS e 1,6 vezes na SGC-7901), enquanto SIRT3 knockdown levou a uma diminuição significativa na produção de glicólise ATP (20% em AGS e 40% no SGC-7901) em comparação com NC ou SCR controle.

a e B, o total de níveis de ATP celular foram testados em AGS (a) e SGC-7901), as células (B com superexpressão SIRT3 ou derrubar. C e D, a AGS (C) e SGC-7901 células (D) com a sobre-expressão ou SIRT3 knockdown foram tratados com rotenona (2 ^ M, 24 horas) para inibir a fosforilação oxidativa e, em seguida, os níveis de ATP citoplasma foram medidos. Os dados foram normalizados pelo controle de células (NC ou SCR) e apresentados como média ± S.E. (N = 3; *,

p Art 0,05; **,

p Art 0,01)

SIRT3 regula a homeostase de ROS na gástrico. células cancerosas

um corpo de evidências suporta que o aumento do nível de ROS é uma característica fundamental em células cancerosas, o que torna as células cancerígenas mais sensíveis ao estresse ROS adicional [34]. Aqui verificou-se que a sobre-expressão de SIRT3 diminuiu os níveis de ROS para 70% e 80% em células AGS e SGC-7901, enquanto que a inibição da expressão SIRT3 aumentou os níveis de ROS (1,4 vezes em células AGS e 1,6 vezes em células SGC-7901), respectivamente, (Figura 5A e 5B). De acordo com a literatura mostrando deacetylates SIRT3 e ativa MnSOD (11, 12), em células de câncer gástrico, atividade MnSOD foi reforçada por SIRT3 superexpressão (1,4 vezes em células AGS e 1,2 vezes em células SGC-7901), mas reduzido em knockdown SIRT3 (50% em células AGS e 65% em células SGC-7901) (Fig 5C e 5D), sugerindo que SIRT3 pode proteger as células dos danos induzidos por estresse oxidativo através de um reequilíbrio intracelular ROS através do reforço da actividade MnSOD em células cancerosas gástricas.

A e B, os níveis celulares de ROS em AGS (A) e células SGC-7901 (B) ancorando SIRT3 superexpressão e knockdown foram detectados usando o método de coloração DCFH2 e representada como nível relativo normalizada por controle (NC ou SCR). C e D, a actividade de MnSOD foi medida em células mencionadas em (A e B) e representada como actividade relativa normalizada por controle (NC ou SCR). Todos os dados são apresentados como média ± E.P. (N = 3; *,

p Art 0,05; **,

p Art 0,01).

deacetylates SIRT3 e ativa LDHA

LDHA desempenha um papel-chave na iniciação do tumor, progressão e manutenção. A inibição da tumorigenicidade e de actividade blocos progressão tumoral LDHA [26,27] e actividade LDHA pode ser regulada por modificação acetilação /desacetilação [35]. Estávamos querendo saber se SIRT3 está envolvido na regulação da atividade LDHA. Descobrimos que, em células de cancro gástrico, actividade LDHA foi significativamente aumentada em células que sobre-expressam SIRT3, enquanto que diminuiu em células SIRT3 knockdown comparação com NC ou controlo Scr células separadamente sem alteração detectável no nível de proteína LDHA nos transfectantes estáveis ​​(Figura 6A). os resultados mostraram que a imunocoloração LDHA SIRT3 e foram co-localizados no citoplasma (Fig 6B), e análise de co-IP com qualquer LDHA ou anticorpo SIRT3 revelou que SIRT3 é capaz de interagir com LDHA (Figura 6C). Além disso, o nível de acetilação LDHA foi reduzida nas células que sobre-expressam SIRT3, mas aumentou em células SIRT3 knockdown (Fig 6d). Além disso,

In vitro

LDHA ensaio de actividade conduzido utilizando SIRT3 humano recombinante comercial e coração bovino L-láctico desidrogenase indicou que a actividade LDHA foi aumentada com a presença de SIRT3 na reacção, que foi invertida pela adição de inibidor SIRT3 , nicotinamida (Fig 6E). Para identificar site de SIRT3 deacetylation potencial (s) em LDHA, buscamos banco de dados e descobriu que K5, K14, K57, K81, K118, K126, K222 e K318 são potenciais locais de acetilação de LDHA e estudo anterior relatou que K5 acetilação /desacetilação foi implicado na regulação da atividade LDHA [35]. Então nós fizemos ensaio da atividade LDHA usando lisina 5 e lisina 318 mímico acetilação (K5Q /K318Q) ou desacetilação mímica (K5R /K318R) LDHA mutante, e descobriu que nem K5, nem K318 foi necessária para ativação LDHA mediada por SIRT3 (S3 Fig). Além disso identificação dos mediada por SIRT3 LDHA desacetilação está em necessidade.

A, atividade LDHA foi medida em AGS e células SGC-7901 com superexpressão SIRT3 ou knockdown e representado como atividade relativa normalizada pelo controle (NC ou SCR). LDHA expressão em SIRT3 sobre-expressão e células AGS knockdown foi analisada por imunotransf erência. B, a co-localização de SIRT3 e LDHA foi detectado por imunocoloração em células AGS com anticorpos anti-ldhA (vermelho) anti-SIRT3 (verde) e. Os núcleos foram conterstained com DAPI (azul). barra de escala, 5 mm. C, LDHA foi imunoprecipitado (IP), seguido de western blot (WB) de LDHA ou SIRT3, ou reverter, em células de câncer gástrico AGS. IP com IgG de cabra não imune serve como um controlo negativo, e imunotransf erência de lisados ​​celulares totais (entrada) serve como controlo de carga igual IP. D, desacetilação-SIRT3 aumentada de LDHA em células AGS foi detectado por anti-IP com LDHA seguido por Western blot com anticorpos anti-LDHA e anticorpos anti-acetil-lisina. Western blot de lisados ​​de células totais com anticorpos SIRT3 para mostrar a expressão de proteína transf ectadas. actividade enzimática E, LDHA foi medida utilizando coração bovino L-láctico comercial desidrogenase e a enzima humana recombinante SIRT3 com /sem inibidor SIRT3 nicotinamida. F, a actividade enzimática LDHA foi medido utilizando a enzima SIRT3 humano recombinante comercial e imunoprecipitadas LDHA a partir de células AGS transfectadas com K5Q /R ou K318Q R mutante /LDHA com /sem nicotinamida inibidor SIRT3 e apresentado como atividade da enzima em relação normalizada pelo tipo selvagem LDHA sem inibidor SIRT3 . Em A, E e F, os dados são apresentados como média ± E.P. (N = 5; *,

p Art 0,05; **,

p Art 0,01).

SIRT3 regula positivamente genes envolvidos no metabolismo celular

Para caracterizar a assinatura molecular de SIRT3-ldhA bioenergética mediadas em células de cancro gástrico, medimos a expressão de genes associados com o transporte de glucose e a glicólise. Os dados na Figura 7A e 7B mostram que a sobreexpressão de SIRT3 em AGS ou SGC-7901 induziu a expressão de HK2 (1,47 vezes em células AGS, 1,3 vezes em células SGC-7901), MCT4 (2,3 vezes em células AGS, 1,34 fold em células SGC-7901) e GLUT1 (1,55 vezes em células AGS, 1,38 vezes em células SGC-7901) no nível de ARNm testadas por PCR em tempo real. Pelo contrário, SIRT3 knockdown diminuiu a expressão de HK2 gene a 76%, MCT4 a 73% e GLUT1 para 62% em células AGS, enquanto HK2 a 80%, MCT4 a 62% e GLUT1 para 74% em células SGC-7901. Além disso, quando SIRT3 foi sobre-expresso, o nível de ARNm MCT1 foi aumentada em células AGS 1,6 vezes mas não em células SGC-7901, e quando SIRT3 foi knockdown, MCT1 foi diminuída para 59% em AGS e 65% em células SGC-7901 , respectivamente.

níveis de mRNA relativos de GLUT1, HK2, MCT1 e MCT4 foram medidos por qRT-PCR em AGS (a) e as células SGC-7901 (B) com superexpressão SIRT3 ou knockdown. Os dados são apresentados como média ± E.P. (N = 3; *,

p Art 0,05; **,

p Art 0,01). (C) Representação esquemática do mecanismo potencial pelo qual SIRT3 desencadeia o crescimento celular. deacetylates SIRT3 e ativa LDHA causando atividade LDHA reforçada e bioenergética celular, que juntamente com a ativação MnSOD mediada por SIRT3 aumenta a proliferação celular.

Discussão

Este estudo fornece a evidência indicando que SIRT3 expressa em algumas células cancerígenas, tais como células de cancro gástrico, podem ser ligadas com a agressividade reforçada por bioenergética mediada por via SIRT3 desacetilação e activação de LADH. Embora acumulando evidências indica que SIRT3 desempenha um papel fundamental na protecção de células normais contra o envelhecimento e a transformação maligna, a sua função em células já transformadas, tais como células tumorais que expressam SIRT3 necessita de ser investigada [19]. A falta de SIRT3 em MEFs conduz a instabilidade genómica e uma elevada frequência de transformação celular mediada por Ras com um aumento da taxa de formação de tumores e o envelhecimento, o que sugere que é necessário SIRT3 na prevenção do envelhecimento celular e carcinogénese [11,15]. Além disso, a falta de, ou baixa expressão do SIRT3 é detectado em vários cancros humanos e SIRT3 nível está associado com a sensibilidade das células cancerosas à quimioterapia e à radioterapia [11,15,16]. No entanto, SIRT3 é mostrado também ser sobre-expresso em cancros humanos e associado com resistência a terapia [19,21,36]. Estes resultados sugerem que SIRT3 pode ter como alvo diferentes proteínas entre células normais e cancerosas, e que a expressão SIRT3 pode ser variada de diferentes tipos de cancro, tais como os resultados actuais indicam que o tipo intestinal de cancro gástrico expressa um nível mais elevado de SIRT3 do que a difuso