Abstract

MITOSTATIN

, um gene supressor tumoral putativo romance induzida por decorim superexpressão, é expressa na maioria dos tecidos humanos normais, mas é marcadamente regulados negativamente em estágios avançados da mamárias e bexiga carcinomas . Mitostatin afecta negativamente o crescimento celular, induz a morte celular e regula a expressão e activação níveis de Hsp27. Neste estudo, foi demonstrado que a expressão ectópica de Mitostatin em PC3, DU145, LNCaP e células de cancro da próstata não só induziu uma redução significativa no crescimento celular, mas também inibiu a migração e invasão. Além disso, Mitostatin inibiram a formação de colónias em ágar mole de PC3 e LNCaP de células, bem como a tumorigenicidade de células de LNCaP em ratinhos nus. Por outro lado, visando Mitostatin endógeno, através de siRNA e estratégias anti-sentido em PC3 e células cancerosas da próstata DU145 aumentou o fenótipo maligno em ambas as linhas celulares. De acordo desses papéis anti-oncogênicos, descobrimos que Mitostatin estava ausente em ~ 35% (

n

= 124) de amostras de tumores de próstata e sua redução global foi associado com estágios de câncer avançado. Coletivamente, nossas descobertas indicam que

MITOSTATIN

pode funciona como um gene supressor de tumor no câncer de próstata e proporcionar um novo mecanismo celular e molecular ser mais explorados e decifrado em nossa compreensão da progressão do câncer de próstata.

Citação: Fassan M, D’Arca D, Letko J, Vecchione A, Gardiman MP, McCue P, et al. (2011) Mitostatin é regulada no cancro da próstata humana e Suprime a Invasiva Fenótipo de células cancerosas da próstata. PLoS ONE 6 (5): e19771. doi: 10.1371 /journal.pone.0019771

editor: Hava Karsenty Avraham, Beth Israel Deaconess Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de janeiro de 2011; Aceito: 04 de abril de 2011; Publicado em: 06 de maio de 2011

Direitos de autor: © 2011 Fassan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi em parte apoiado pela Fundação Sidney Kimmel para Pesquisa do Câncer, a Perkins Fundo do cancro de bexiga Benjamin eo Fundo Greitzer Martin (a RB), os Institutos Nacionais de Saúde concede RO1 CA39481, SR1 CA47282 e SR1 CA120975 (a RVI), SR1 DK068419 (para AM). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é a principal causa de morte relacionada ao câncer em homens nos países mais desenvolvidos, e a neoplasia maligna mais comum em homens americanos. Nos Estados Unidos, um em oito homens desenvolverá câncer de próstata durante sua vida e mais de 27.360 homens são esperados para morrer da doença este ano [1].

mutações genéticas moleculares identificaram estudos de câncer de próstata, deleções ou perda de tumor expressão dos genes supressores em subgrupos de pacientes com câncer de próstata [2]. No entanto, devido à heterogeneidade do cancro da próstata em si e a natureza focal das alterações do gene supressor do oncogene /tumor, a função destes genes no início do cancro da próstata e o valor de diagnóstico e /ou prognóstico de tais alterações genes permanece incerto [2].

a perda de heterozigosidade (LOH) aponta a presença de genes supressores de regiões cromossômicas específicas em tumores. Vários estudos allelotyping informou a porção telomérica do cromossomo 12 a ser eliminado em uma variedade de tumores sólidos [3] -. [11], incluindo o câncer de próstata [12]

MITOSTATIN

é um romance gene supressor de tumor putativa localizada em 12q24.1 [13] – [15], caracterizada recentemente no nosso laboratório [13]. Foi anteriormente demonstrado que esta proteína de 62 kDa induzida por decorina é expressa na maioria dos tecidos humanos; que afecta o crescimento de células de cancro da próstata e da morte celular através da regulação do nível de activação e de Hsp27 [13]. Temos também analisados ​​por imuno-histoquímica a expressão de Mitostatin de uma série de tumores da bexiga e da mama primário, e observou-se uma redução dos níveis de proteína Mitostatin em tumores de estádio avançado. Além disso, Kim e colegas identificaram recentemente uma mutação frameshift de

gene MITOSTATIN

num carcinoma gástrico com instabilidade microssatélite [14].

Embora a função biológica da Mitostatin em cancros da próstata ainda não está caracterizada, a sua relação com decorim e Hsp27 sugere um papel para Mitostatin no desenvolvimento do câncer. Para estudar a função supressora de tumores de Mitostatin no cancro da próstata, que sobre-expressa e empobrecido Mitostatin proteína endógena por estratégias anti-sentido e siRNA em linhas celulares derivadas de cancro da próstata.

Neste estudo, que fornece a primeira evidência de um papel de Mitostatin na inibição da migração celular, invasão e a tumorigenicidade de células cancerosas da próstata. Além disso, nossos dados indicam que Mitostatin é regulada em estágio avançado de câncer de próstata humano. Assim, Mitostatin poderia agir como um gene supressor de tumor clássica e análise de sua expressão pode ser um marcador clínico útil para o diagnóstico e prognóstico neste câncer humano comum.

Resultados

Mitostatin sobre-expressão em células cancerosas da próstata inibe a formação Colony

Como uma abordagem inicial para estabelecer expressão Mitostatin na próstata utilizou extratos de células de catorze células derivadas de próstata diferentes, incluindo tanto as células prostáticas normais e malignas. Utilizando imunotransf erência com um anticorpo específico para o Mitostatin [13], descobrimos que todas as linhas celulares analisadas, mas um (

i.e.

:. 1542CP

3TX), expressa a proteína Mitostatin a vários níveis (Figura 1A). Notavelmente, células LNCaP apresentada a expressão mais elevada e 1532CP

2TX apresentaram níveis detectáveis ​​de mal-Mitostatin endógena (Figura 1A). De nota, 1542NPTX células, que expressam Mitostatin, são as contrapartes “normal” do

células 3TX Mitostatin-negativos malignas 1542CP

A:. Análise de Western blot: Mitostatin é diferencialmente expressos em células de câncer de próstata humana linhas. carga de proteína foi confirmada por reprobing a membrana com anticorpo de p-actina. B: Western blot mostrando a expressão de Mitostatin no PC3, linhas celulares DU145 e LNCaP utilizada neste estudo

Em seguida, nós nos concentramos em investigar a função biológica do Mitostatin em células de câncer de próstata por transfecção de forma estável PC3. e células LNCaP com uma construção de expressão de cDNA etiquetado Mitostatin-V5 e células PC3 e DU145 com uma construção de ADNc anti-sentido. Também colocou a sequência de codificação Mitostatin num vector retroviral auto-inactivação sob o controlo de um promotor induzível de Drosophila HPS70 para infectar células DU145. Obteve-se cinco clones estavelmente sobre-expressando Mitostatin (PC3 B2, DU145 Mitostatin, LNCaP B1A, LNCaP B3A e LNCaP A3A) e dois clones mostrou que a diminuição dos níveis de proteína endógena Mitostatin (PC3 e DU145 M2 M2) (Figura 1B). Em três ensaios de formação de colónias independentes, todas as linhas de células que sobre-expressam Mitostatin mostraram um decréscimo no número e tamanho das colónias após 15 dias (Figura 2 A-C), em comparação com quer o parental ou as células transfectadas-V5. Mitostatin DU145, que é também o clone com a expressão mais elevada de Mitostatin comparado com a expressão celular parental (4,2 vezes de aumento, cfr Figura 1B), apresentou a maior inibição de formação de colónias (Figura 2 B). De interesse, células que expressam uma construção anti-sentido mostraram Mitostatin quer um número semelhante (DU145 M2, A Figura 2 B) ou superior (PC3 M2, Figura 2A) de colónias em comparação com as células transfectadas parentais ou simulados.

Mitostatin sobre-expressão no câncer linhas celulares derivadas da próstata [PC3, a; DU145, B; e LNCaP, C] diminuiu a capacidade para formar colónias após 15 dias, enquanto que as células com depleção de proteína endógena Mitostatin mostrou um semelhante (DU145 M2) ou superior (PC3 M2) o número de colónias em comparação com as células parentais. Colunas, médio por prato de experiências em triplicado;

bares

, SEM. *

P Art 0,05; **

P

. 0,01

Mitostatin Over-expressão inibe a migração de células cancerosas da próstata

Está bem estabelecido que a decorina e Hsp27 estão envolvidos na célula migração. A primeira tem sido mostrado exercer um efeito anti-migratório em várias linhas de células de diferentes vias de sinalização envolvendo [16] – [19], enquanto que a última está envolvida na reorganização de actina quando as células formam lamelip�ios [20]. Uma vez que temos descoberto anteriormente Mitostatin em células que expressam decorim-over-e demonstrou que Mitostatin inibe a expressão e fosforilação de Hsp27 em linhas celulares de cancro da próstata [13], procurou-se determinar se Mitostatin pode regular a migração celular em células de câncer de próstata. Consequentemente, foi realizada

in vitro

ensaios de migração que utilizem os vários Mitostatin-superexpressão ou Mitostatin-empobrecido células cancerosas da próstata. Em toda a linha de células testada, a sobre-expressão Mitostatin inibido a capacidade das células para migrar (Figura 3A) o que indica que Mitostatin regula negativamente a migração de células de cancro da próstata. Em Mitostatin-sobre-expressar clones LNCaP o efeito inibitório do Mitostatin sobre a migração foi directamente correlacionada com a quantidade de proteína (

i

:. Clone A3A LNCaP com a mais alta expressão Mitostatin foi o mais lento no ensaio de migração). Por outro lado, células cancerosas da próstata em que endógena Mitostatin foi regulada por qualquer estratégia de antisense (PC3 M2 e DU145 M2) ou Mitostatin siRNA (células PC3) mostrou aumento da motilidade celular (Figura 3A).

A

e

B: Mitostatin sobre-expressar clones apresentaram redução propriedades migratórias em comparação com células parentais. Migração foi avaliada por meio da migração (A) e os ensaios de cura de feridas (B). As células com a regulação negativa da proteína endógena Mitostatin (PC3 M2, PC3 Mitostatin shRNA e DU145 M2) mostrou um comportamento maligno aumentou. Os dados são expressos como percentagem de migração

relação

células parentais.

Colunas

, imagens representativas de triplicados de três experiências independentes;

bares

, SEM. *

P Art 0,05; **

P

. 0,01

Em seguida, determinou-se a capacidade de Mitostatin para inibir a migração de células de câncer de próstata utilizando um

in vitro

“wound- cura “ensaio de motilidade [21]. Em contraste com as células progenitoras e células de controlo PC3 V5 (dados não apresentados), as células PC3 B2 que sobre-expressam Mitostatin mostraram uma diminuição substancial na migração para a área desnudo, tanto a 4 e 8 horas após o ferimento (Figura 3B). Foi realizado o mesmo experimento em células LNCaP e DU145 e observou que em todas as linhas celulares. Essencialmente, Mitostatin sobre-expressão induzida por uma diminuição da motilidade celular em comparação com as células progenitoras ou falsamente transfectadas (dados não mostrados).

Mitostatin A sobre-expressão e inibe a invasão de Adesão Celular

A aquisição pela células cancerosas de um fenótipo invasivo é um passo crítico para a progressão do tumor. filtros revestidos com Matrigel são amplamente utilizados para examinar a migração invasiva através de uma matriz extracelular tridimensional [21]. Consequentemente, foi realizada

in vitro

ensaios de invasão que avaliam a capacidade das células de câncer de próstata para invadir através de Matrigel em meio contendo soro a 5%. Mitostatin sobre-expressão inibida invasão celular em todas as linhas celulares testadas (Figura 4A). Em LNCaP que sobre-expressam os clones, o efeito inibidor da proteína sobre a migração estava directamente correlacionada com a quantidade de proteína (LNCaP A3A teve a menor capacidade para invadir). Além disso, observou-se um aumento na invasão celular em PC3 M2 e clones antisense DU145 M2, e as células PC3 Mitostatin siRNA

A:. Mitostatin inibe propriedades invasivas das células cancerosas da próstata. As células com a regulação negativa da proteína endógena Mitostatin (PC3 M2, PC3 Mitostatin shRNA e DU145 M2) mostrou um comportamento maligno aumentou. B: Mitostatin sobre-expressão afeta a capacidade das células para anexar a laminina. Os dados são expressos como percentagem de migração

relação

células parentais.

Colunas

, imagens representativas de triplicados de três experiências independentes;

bares

, SEM. *

P Art 0,05; **

P

. 0,01

A adesão a matriz extracelular é uma característica intrínseca de um fenótipo invasivo e metastático e as células migrantes formam anexos transitórios para a matriz extracelular. Notavelmente, laminina-1 é o principal componente de Matrigel. Por conseguinte, foram realizados ensaios de adesão e plaqueadas as várias células de cancro da próstata Mitostatin que sobre-expressam ou Mitostatin-esgotados em placas revestidas com laminina. As células foram deixadas aderir à laminina durante 2 horas e o número de células ligadas foi então calculada. O número de células que aderiram à laminina foi significativamente menor em células que sobre-expressam Mitostatin, em comparação com as células parentais em DU145 e linhas celulares PC3 (figura 4B), indicando que Mitostatin inibe a adesão celular à laminina. De acordo com esta conclusão, as células PC3 Mitostatin-empobrecido mostrou um aumento da capacidade de aderir à laminina (Figura 4B). Por outro lado, a falta de diferenças significativas na adesão celular à laminina observado nas células LNCaP pode ser parcialmente explicado pela sua capacidade documentado baixo adesiva

in vitro

[22], [23].

em conjunto, nossos resultados sugerem que Mitostatin não só inibe a capacidade migratória das células cancerosas da próstata, mas também a capacidade de invadir uma matriz tridimensional complexa, como Matrigel, e aderir aos substratos laminina.

Mitostatin sobre-expressão inibe o crescimento Anchorage independente e de tumorigenicidade

Para investigar a hipótese de que Mitostatin pode desempenhar um papel direto na carcinogênese da próstata, realizamos ensaios de crescimento independente de ancoragem e um

in vivo

tumorigenicidade ensaios em ratinhos nus. células PC3 B2 com expressão elevada Mitostatin não formaram colónias, enquanto que M2 PC3 com baixo nível Mitostatin mostraram um aumento do número de colónias (Figura 5A). Além disso, a maioria das colónias nas 3-PC M2 células eram maiores do que aqueles em células de controlo (dados não apresentados). Em células LNCaP (Figura 5A-B), a redução no número e dimensão das colónias directamente correlacionados com os níveis de expressão Mitostatin

A:. Dados a partir de culturas em triplicado de PC3 parentais e LNCaP e PC3 V5 clones, PC3 B2, PC3 M2, LNCaP V5, LNCaP B1A, LNCaP B3A, e LNCaP A3A plaqueadas em soft-agar gerando colónias maiores do que 0,2 mm de diâmetro. Os clones que sobre-expressam Mitostatin mostrou uma diminuição da capacidade para formar colónias, enquanto que o clone Mitostatin regulada para baixo, PC3 M2, mostrou um aumento do número de colónias em comparação com as células parentais. As colónias foram contadas após 21 dias. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01 B:. Colônias representativos de células parentais LNCaP (à esquerda), LNCaP B1A (meio) e LNCaP A3A (à direita) são mostradas após 21 dias (ampliação x 200)

in vivo

experimentos mostraram que xenotransplantes derivados de Mitostatin-sobre-expressando células LNCaP foram significativamente menores do que aqueles induzidos por células parentais LNCaP e células de controlo de LNCaP V5 (Figura 6A-B). Tumores derivados de LNCaP B1A e LNCaP B3A alcançado um volume médio de 50% e 25% menores do que os tumores derivados de células parentais. Análise imuno-histoquímica dos tumores embebidos em parafina e análises de imunotransferência de xenoenxertos de tumor congeladas (Figura 6C-D) apresentaram expressão elevada Mitostatin LNCaP em B1A e LNCaP B3a xenoenxertos, em comparação com o nivel basal de expressão Mitostatin mostrado nas células parentais. expressão Mitostatin em células transfectadas foi adicionalmente confirmada por imuno-histoquímica usando a tag anticorpo anti-V5 (Figura 6C)

A:. xenoenxertos estabelecidos por sub injecção cutânea de LNCaP, LNCaP V5, LNCaP B1A e células LNCaP b3a em atímicos (BALB /c

nu /nu

) foram cultivadas por 65 dias. B: O volume do tumor em animais injectados com células que sobre-expressam Mitostatin foi marcadamente diminuída em comparação com tumores em animais injectados com células de controlo. O gráfico ilustra a distribuição de tamanhos dos tumores formados em BALB /c

nu /nu

ratos através de 65 dias. *:

P Art 0,05. C, D: imuno-histoquímica e immunoblot análise da expressão Mitostatin em LNCaP e xenoenxertos de tumores derivados. A imuno-histoquímica foi realizada utilizando ambos os anticorpos anti-V5 (painéis superiores) e anti-Mitostatin (painéis inferiores) anticorpos. Barra de escala:. 50 mm

Em conjunto, estes resultados indicam que Mitostatin está diretamente envolvido em uma forma dependente da dose no controle de um dos mais poderosos

in vitro

propriedades das células malignas , tal como o crescimento independente de ancoragem, bem como

in vivo

tumorigenicidade. Assim, Mitostatin é um regulador negativo chave do fenótipo transformado no cancro da próstata.

Mitostatin expressão é diminuída em carcinomas da próstata avançado

Demonstrámos recentemente que Mitostatin é expressa ubiquamente em tecidos humanos normais, mas os seus níveis são marcadamente atenuada em estágios avançados de câncer de mama e bexiga [13]. Para investigar a expressão Mitostatin em cancros da próstata, foram avaliados por qRT-PCR análise de 10 amostras de câncer normais pareados e por imuno-histoquímica (IHQ) três microarrays tecido composto de 293 espécimes, incluindo 124 cancros da próstata e 43 contrapartes normais. níveis de mRNA Mitostatin foram significativamente regulada para baixo na homólogo cancerosos (Figura 7A;

P

= 0,029). Estes dados foram ainda confirmados por IHQ. Mitostatin foi expresso principalmente no citoplasma das células da camada basal do epitélio prostático normal (Figura 7B) e uma positividade forte foi observada no chamado atrofia da glândula da próstata (Figura 7C). Todas as lesões pré-neoplásicas (

ie

: PIN) mostraram uma ligeira a moderada Mitostatin imunocoloração (figura 7D), ao passo que a maior parte do adenocarcinoma mostraram qualquer coloração focal (Figura 7E, F) ou ausência total de coloração ( A Figura 7G). Como esperado, as células musculares e vasos sanguíneos do endotélio ‘mostrou uma positividade moderada Mitostatin. De interesse, cinco casos neoplásicas teve positividade exclusivamente nuclear. No total, 44 das amostras de tumores 124 foram totalmente negativa (~ 35%), 65 mostraram uma ligeira a positividade médio (52,4%) e apenas 15 amostras apresentaram forte positividade Mitostatin (12,1%). Na análise univariada, a diminuição Mitostatin pontuação imunohistoquímica associada a estádios de tumor (

P

= 0,046), aumento pT (

P

= 0,040), e volume tumoral (

P =

0,045). Não há parâmetros clínico-patológicos resultou independentemente estatisticamente significativa associada à Mitostatin expressão na análise multivariada. . Esses achados corroboram ainda mais a noção de que a perda de Mitostatin através de mutações ou degradação de proteínas pode contribuir para a progressão do câncer de próstata na medida em que os espécimes de cancro da próstata avaliadas acima derivam de pacientes com câncer avançado de próstata

A: dobra relativa dos níveis de mRNA Mitostatin em amostras de tecido da próstata normais (N, preto) e Gleason amostras de câncer de próstata 7 (K, cinza claro). Mitostatin mostraram uma regulação consistente em tecidos de câncer (

P

= 0,029). Colunas, imagens representativas de triplicados; Barras, DP. B-G: detecção imuno-histoquímica de Mitostatin na próstata humana. Mitostatin proteína está localizada no citoplasma do normal (B) e atrófica (C) glândulas prostáticas. Níveis mais elevados de proteína Mitostatin foram observadas lesões em PIN (D) e em alguns tumores (E). F: Além de uma coloração fraca, Mitostatin também foi detectado nos núcleos em alguns casos de adenocarcinoma. G: expressão Mitostatin está presente em uma glândula atrófica (seta preta), em contraste com as glândulas neoplásicas negativos circundantes. Barra de escala: 50 mm

Discussão

Embora o câncer de próstata é um dos tumores malignos mais comuns, muito pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares que determinam a transformação maligna do epitélio prostático.. Durante a progressão do câncer de próstata, as células tumorais se tornam mais móveis e adquirir capacidade invasiva. A maioria das mortes por cancro da próstata não são, devido ao tumor primário, mas sim a metástases secundárias para órgãos distantes. Por este motivo, é de importância fundamental para estudar os mecanismos que conduzem a invasão e metástases do cancro da próstata. O 12q região cromossómica foi demonstrada a ser eliminado em uma grande variedade de tumores sólidos avançados [3] – [12], por conseguinte, sugerindo a presença, nessa região, de um ou mais genes supressores de tumores envolvidos no processo de progressão do cancro.

Temos anteriormente identificado o gene Mitostatin, localizada em 12q24.1, no processo de rastreio para genes preso de crescimento induzido pelo decorina proteoglicanos ricos em leucina [13]. Decorim é um membro da pequena família de genes de proteoglicanos ricos em leucina, que recentemente se tornou um foco em diversas áreas de investigação sobre o cancro [20]. Esta proteína solúvel está envolvido num certo número de processos celulares, incluindo a montagem de matriz, a fibrilogénese, e o controlo da proliferação de células [18], [24] – [33]. A decorina foi mostrado para inibir a migração de [16] – [19], [34], invasão [18], e a tumorigenicidade [19], [29], [33], [35], [36] de uma vasta variedade de células transformadas. Além disso, decorina induz a apoptose através da activação de caspase-3 [36], [37]. Por isso, é plausível, que as proteínas induzidas por decorina pode ser efectores da acção supressora de tumor do presente proteoglicano.

Nós mostramos anteriormente que Mitostatin é expressa ubiquamente em tecidos humanos normais. No entanto, os seus níveis de proteína são marcadamente atenuada em estágios avançados de mamária primária e neoplasias uroteliais [13]. Demonstramos ainda que a sobre-expressão Mitostatin afecta negativamente o crescimento celular e induz a morte celular em linhas celulares de cancro da bexiga [13], o que sugere que poderia Mitostatin comportar como um gene supressor de tumor clássica em outras formas de malignidade. No presente estudo, utilizámos três linhas de células de carcinoma da próstata amplamente utilizados, ou seja, células PC3 e DU145 resistente à castração, e células LNCaP dependente de androgénios, e transgénica utilizada e imunológica estratégia para identificar a função de Mitostatin nestas células. Os nossos resultados confirmaram a nossa previsão de Mitostatin pertencente à família do gene supressor de tumor, na medida em que a sobre-expressão de Mitostatin inibiu a formação de colónias, enquanto a supressão de Mitostatin endógena fez com que os efeitos opostos.

A migração celular e invasão são componentes fundamentais de metástases de células tumorais . Como o aumento da migração celular e invasão são características do fenótipo metastático, e assim uma medida da agressividade, o estudo fornece resultados que implicam Mitostatin como uma proteína importante para a determinação de um fenótipo celular agressiva. Na verdade, Mitostatin sobre-expressar clones mostraram uma diminuição significativa na motilidade, e

vice-versa

por down-regulação endógena Mitostatin tanto com estratégias de siRNA anti-sentido ou que desencadeou o resultado oposto. Um papel direto de Mitostatin na promoção da migração celular também é evidente a partir de nossos estudos de cicatrização de feridas, confirmados em todas as linhas celulares analisadas.

Nossos resultados demonstram que Mitostatin regula a motilidade celular e a capacidade das células de câncer de próstata para invadir através de uma matriz em 3D através de um mecanismo ainda não foi elucidado. Mitostatin alteradas as propriedades de adesão celular à laminina, que é o primeiro passo necessário para invadir a membrana de Matrigel. Este resultado é consistente com o papel que desempenha decorina como um regulador negativo da adesão celular à laminina [19]. Outros genes supressores de tumor foram mostrados para afetar várias características células cancerosas (migração, invasão, crescimento, predisposição a estímulos apoptóticos) que actuam em complexos de proteínas celulares importantes [38] – [40]. Assim, os nossos esforços futuros será focada na identificação de parceiros de proteína Mitostatin e em estudar os possíveis sinais cascata implicados em Mitostatin biologia.

Para investigar um possível papel direto para Mitostatin na transformação de células da próstata realizamos ensaios de crescimento independente de ancoragem e um

in vivo

tumorigenicidade em ratinhos nus. Ambos os estudos confirmam o papel da Mitostatin como um regulador negativo da transformação. Em ambos os experimentos expressão Mitostatin correlacionados bem com a agressividade das células cancerosas.

Neste estudo observou-se uma redução na expressão Mitostatin em duas linhas celulares derivadas de cancro da próstata (1542CP

3TX e 1532CP

2TX ; 16,7% das linhas celulares de cancro derivadas de) e em ~ 35% de uma série de 124 cancros da próstata. De interesse, em amostras normais, a camada epitelial prostática superior foi consistentemente negativas para epitopos Mitostatin, enquanto que a camada mais baixa mostrou uma positividade forte, o que sugere a presença de um compromisso celular diferente na expressão Mitostatin. A positividade forte foi sempre observado no chamado atrofia da glândula prostática (um processo comum tipicamente, mas não exclusivamente encontrada em pacientes mais velhos), enquanto uma positividade moderada foi observada em todas as lesões pré-neoplásicas, com uma diminuição do cancro da próstata mais avançada estágios. Em tumores de próstata primário, Mitostatin infra-regulação foi estatisticamente associada com estágios avançados tumorais e aumento do tamanho (ou medida direta) do tumor primário no exame patológico (

ou seja

: pT), confirmando nossa observação anterior no peito e cancro da bexiga [13]. Estes resultados sugerem que a regulação negativa da Mitostatin durante os últimos estágios de tumorigênese de próstata pode promover a progressão do câncer. Nós não encontrou qualquer correlação entre a expressão Mitostatin e outros parâmetros clínicos usados ​​para avaliar o câncer de próstata mau prognóstico, como o grau de Gleason, embora este ponto continua a ser investigado em uma série maior de casos.

Em conclusão, a presente estudo fornece a primeira evidência de que Mitostatin pode desempenhar um papel significativo como supressor de tumor no desenvolvimento do tumor de próstata e progressão através dos seus efeitos inibitórios sobre a migração celular, invasão, crescimento independente de ancoragem, e

in vivo

tumorigênese. Além disso, o nível Mitostatin é diminuída em estágios avançados de câncer de próstata primários. Tomados em conjunto, estes dados confirmam ainda mais a hipótese de que Mitostatin atua como um

bona fide

supressor de tumor e sugerem que novas investigações de Mitostatin como um marcador clínico útil para o diagnóstico e prognóstico em tumores de próstata são garantidos.

Materiais e Métodos

Cultura de células e Geração de clones estáveis ​​

câncer linhas celulares derivadas da próstata 2220, 2221, 11609, 11610, 11611, TSUP, 1532CP

2TX, 1535CP

1TX, 1542CP

3Tx, LNCaP, DU145, PC3 e da próstata e linhas de células imortalizadas derivadas normais 1535NPTX, e 1542NPTX foram obtidos a partir de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e mantidas como recomendado. As células foram transfectadas tal como descrito anteriormente [13], [41] (dados S1), e seleccionadas em meio suplementado ou com G418 (400 ug /ml) ou puromicina (0,75 ug /ml) durante 3 semanas.

Mitostatin Gene Silencing

Gene silenciamento de Mitostatin humana foi obtida por meio de estratégias de siRNA usando validados SureSilencing Mitostatin siRNA de controlo e os plasmídeos (SuperArray Bioscience Corp., Frederick, MD). células PC3 foram transfectadas com veículo (água tratada com DEPC), ARNsi de controlo (codificado), ou ARNsi dirigido contra Mitostatin (100 pmol /L), utilizando o reagente Oligofectamine ™ (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo os protocolos do fabricante. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células PC3 foram deixados em jejum em meio isento de soro (SFM) por 12 horas e, em seguida, foram processadas e analisadas para a migração e invasão como descrito abaixo. A expressão da proteína Mitostatin foi detectada por análise de imunotransferência (Figura S1).

Formação de Colónias e ensaios de migração

As células foram plaqueadas a uma densidade de 400 células /prato de 100 milímetros. No dia 15, as células foram fixadas em formalina a 10% [100% de formaldeído é de 37%, 3,7%, portanto, é de 10% de formalina,

ie

: PBS-formaldeído] e coradas com violeta cristal para contagem de colónias [21] . As células foram privadas de soro durante 24 horas. Cells (2,5 × 10

4 em 200 ul) foram então semeadas em câmaras de Boyden (câmara alta) (BD Biocoat, Bedford, MA). câmaras inferiores continha 500 ul de quer SFM ou 1% ou 5% de soro. Após 10 horas, as células migraram foram contadas ao microscópio após a fixação e coloração de azul de Coomassie como descrito [42], [43].

A migração, invasão e Adesão Ensaios

As células foram semeadas em placas de 35 mm em meio contendo soro até sub-confluência e, em seguida, transferidas para SFM. Após 24 horas, as placas foram riscados com uma ponta descartável fina para gerar uma ferida na monocamada de células [42]. As células foram incubadas durante mais 72 horas em 1% ou 5% de meio contendo soro e analisadas e fotografados com um Zeiss Axiovert 200 M microscópio de células vivas (Carl Zeiss Inc., Thornwood, NY) usando o software de aquisição e análise de imagem Metamorph (Universal imaging, Downingtown, PA) no Centro Kimmel Cancer Center microscopia confocal core. invasão celular através de uma matriz extracelular tridimensional foi avaliada por um ensaio de invasão de Matrigel utilizando BD Matrigel Invasão secções (BD Biocoat) com membranas de filtro de 8,0 mícrons, como descrito anteriormente [42], [43]. Para os ensaios de adesão, placas de 96 poços, revestidas com laminina de ratinho (BD Biocoat), foram incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora com albumina a 1% de soro de bovino (BSA) (Sigma, St. Louis, MO), para bloquear a ligação inespecífica. 100.000 células /poço foram semeadas em triplicados e deixadas a aderir durante 2 horas a 37 ° C e as células não aderentes foram, em seguida, removido com duas lavagens. As células aderentes foram coradas com CyQUANT NF celular Ensaio de Proliferação de kit (Invitrogen) e a absorvância foi lida a 490 nm. os níveis de base de adesão celular em poços revestidos com BSA sozinha foram subtraídos dos valores obtidos para a laminina.

Anchorage-independente Crescimento e de tumorigenicidade Ensaios

Para o ensaio de agar suave, as células foram suspensas em 0,2% de agarose em meio DMEM FBS a 10%, plaqueadas a uma densidade de 10

3 células num prato de 60 mm revestidas previamente com 0,4% de agarose, e mantida a 37C °. No 21 ° dia, as colónias de 0,2 mm de diâmetro foram contados e analisados ​​[21]. Ensaios de tumorigenicidade foram realizadas essencialmente como descrito [44], no âmbito de protocolos aprovados pelo Comitê Animal Care e Use a Thomas Jefferson. Imunodeficientes, nu atímicos (BALB /c

nu /nu)

ratinhos foram injectados subcutaneamente em posterior flanqueia com 2 × 10

6 células em 200 ul de matriz Matrigel da membrana basal (BD Biosciences). O crescimento do tumor foi monitorizado diariamente por 65 dias.

declarações éticas

Todos os pacientes envolvidos no estudo qRT-PCR deram o seu consentimento informado por escrito.