Abstract

Fundo

A multirresistência (MDR) no câncer gástrico continua sendo um grande desafio para o tratamento clínico. Ativando fator de transcrição 4 (ATF4) é um gene resposta ao estresse envolvido na homeostase e proteção celular. No entanto, a expressão ea função dos ATF4 no câncer gástrico MDR permanece desconhecida. Neste estudo, investigamos se ATF4 desempenhar um papel na MDR câncer gástrico e os seus potenciais mecanismos.

Metodologia /Principais Achados

Nós demonstramos que ATF4 superexpressão conferiu o fenótipo MDR às células cancerosas gástricas, enquanto knockdown de ATF4 no MDR variantes induzida re-sensibilização. No presente estudo, também mostraram que o NAD

+ – SIRT1 histona desacetilase dependente foi necessária para o efeito induzido MDR-ATF4 em células de cancro gástrico. Nós demonstramos que ATF4 facilitado MDR em células cancerosas gástricas através de ligação directa ao promotor SIRT1, resultando em SIRT1-regulação. Significativamente, a inibição da

SIRT1

pela pequena interferência RNA (siRNA) ou um inibidor específico (EX-527) reintroduzido sensibilidade terapêutica. Além disso, um aumento da Bcl-2 /relação de Bax e nível de expressão MDR1 foram encontrados em células-superexpressão ATF4.

Conclusões /Significado

Nós mostramos que ATF4 teve um papel fundamental na regulação da MDR em células de câncer gástrico em resposta à quimioterapia e esses resultados sugerem que a segmentação ATF4 poderia aliviar a resistência terapêutica no cancro gástrico

Citation:. Zhu H, Xia L, Zhang Y, Wang H, Xu W, Hu H, et ai. (2012) Activar Fator de Transcrição 4 confere uma multirresistência Fenótipo a células de câncer gástrico através transactivação de SIRT1 Expression. PLoS ONE 7 (2): e31431. doi: 10.1371 /journal.pone.0031431

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de setembro de 2011; Aceito: 08 de janeiro de 2012; Publicação: 17 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Zhu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada por doações combinadas da National Science Foundation Natural da China (NO.81090270, NO.81090273 e NO.81000864), o chinês de Pós-Doutorado Science Foundation (NO.20100471776), o Key Nacional e Programa de Desenvolvimento de Pesquisa básica da China ( nO. 2010CB529302), eo Projeto de Ciência e Tecnologia Nacional Municipal (2009ZX09103-667 e 2009ZX09301-009-RC06). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a multirresistência é geralmente a principal causa para o fracasso da quimioterapia contra tumores malignos, incluindo câncer gástrico [1] .O prazo multirresistência é classicamente utilizado para definir um fenótipo de resistência onde as células se tornam resistentes simultaneamente para diferentes medicamentos sem semelhança estrutural óbvia e com diferentes alvos celulares [2]. MDR ocorre mais frequentemente com novos medicamentos que têm eficácia mais significativa após a sua primeira aplicação no tratamento do câncer. A utilidade clínica de múltiplas drogas é limitada pela resistência de células tumorais tanto natural e adquirido, que quase sempre é multifactorial na natureza [3]. Os fatores que podem afetar a sensibilidade de drogas incluem: aceleração de efluxo de drogas, a ativação de drogas e inactivação, alterações no alvo da droga, a metilação do DNA, o processamento de dano induzido por drogas, e evasão de apoptose [4]

O câncer gástrico. é relativamente insensível a agentes quimioterapêuticos. Os mecanismos de MDR em células de cancro gástrico têm sido amplamente investigados em nosso laboratório e outros lugares [1], [4], [5], ainda não tenham sido completamente elucidados, indicando que outras moléculas ou vias desconhecidos podem estar envolvidos no desenvolvimento de MDR.

em células de mamíferos, o factor de iniciação da tradução eucariótica 2 α subunidade (eIF2α) é fosforilado por cinases diferentes eIF2α em resposta a sinais de tensão diferentes, incluindo anóxia /hipóxia, estresse retículo endoplasmático, a privação de aminoácidos, e oxidativa estresse. Este evento de fosforilação conduz a uma rápida diminuição concomitante mundial biossíntese de proteínas com a indução da expressão de translação de genes, incluindo o

ATF4

que funcionam para aliviar danos celulares do stress [6], [7]. Embora ATF4 pode desempenhar um papel pró-apoptótica sob condições de estresse grave ou prolongada,

ATF4

é um gene de stress-responsivo potente pensado para desempenhar um papel protetor, regulando adaptação celular às circunstâncias adversas na resposta ao estresse integrado ( ISR) [8], [9], [10]. Recentemente, a sobre-expressão de ATF4 foi relatado para ser proeminente em uma ampla variedade de tumores e para proteger as células de tumor contra várias tensões, bem como uma variedade de agentes terapêuticos do cancro [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. Os potenciais mecanismos responsáveis ​​por essa proteção incluem a indução de autofagia, a promoção de reparação de danos ao DNA, e up-regulação da glutationa intracelular [12], [13], [14], [17]. No entanto, a expressão ea função dos ATF4 no câncer gástrico MDR permanece desconhecida.

Neste estudo, nós relatamos que ATF4 foi significativamente up-regulada na resposta MDR de células de câncer gástrico em comparação com células de controlo parental. Knockdown de

ATF4

por siRNA células com MDR sensibilizados de forma significativa para uma variedade de agentes quimioterapêuticos, enquanto up-regulação da ATF4 em SGC7901 e células AGS tornou-os resistentes a múltiplas drogas. Nós também mostrou que ATF4 promovido câncer gástrico MDR em parte através de up-regulação da expressão de SIRT1. E inibição SIRT1 pode, em parte reverter o câncer de MDR fenótipo gástrico mediada pela ATF4. Estes dados sugerem que a segmentação ATF4 pode proporcionar uma nova opção terapêutica para reverter câncer gástrico clínica MDR.

Resultados

ATF4 modula o fenótipo MDR de células cancerosas gástricas

Para determinar se ATF4 está envolvido no desenvolvimento da MDR em células de cancro gástrico, os níveis de ATF4 foram detectadas por Western blot e qPCR na linha de células e a sua SGC7901 variantes MDR, SGC7901 /VCR e SGC7901 /ADR. Ambos os níveis de proteína e ARNm de ATF4 eram muito mais elevados nas linhas de células resistentes do que nas células parentais (Fig. 1A).

(A) os níveis de ARNm de ATF4 e proteína em células de cancro gástrico MDR (SGC7901 /ADR e SGC7901 /VCR) e as células parentais SGC7901 foram examinados por transferência Western e qPCR. β-actina e GAPDH foram utilizados como controle interno, respectivamente. Os dados representam as médias ± S.D. de três experiências independentes. (B) A resposta do LV-Vector e LV-ATF4 estavelmente transfectadas SGC7901 e AGS à cisplatina foi testada pelo ensaio de formação de colónia. As linhas celulares foram tratados continuamente com 0 ou 0,25 ug /mL de cisplatina para 14 d; media foi trocado a cada 3 d. As células foram plaqueadas em triplicado, e a experiência foi repetida três vezes. poços representativos são mostrados. Gráficos fornecem quantificação média como uma percentagem das células não tratadas. (C) LV-SCR e LV-siATF4 estavelmente transfectadas células SGC7901 /ADR e SGC7901 /VCR foram tratados continuamente com 0 ou 0,5 ug /ml de cisplatina para 14 d; media foi trocado a cada 3 d. (D) e (E) e VE-Vector LV-ATF4 transfectadas estavelmente linhas celulares SGC7901 e LV-SCR e LV-siATF4 transfectadas estavelmente SGC7901 /ADR células foram tratadas com diferentes doses indicadas de drogas durante 72 h.

In vitro

sensibilidade droga foi testada pelo ensaio de MTT. Os dados representam as médias ± S.D. de três experiências independentes. (F) e (G) LV-vetor e LV-ATF4 transfectadas estavelmente linhas celulares SGC7901, LV-SCR e LV-siATF4 células SGC7901 estavelmente transfectadas /ADR e as respectivas contrapartes não tratadas (NC) foram cultivadas em meio fresco na presença de cisplatina nas concentrações indicadas (por SGC7901-NC, SGC7901 do vector, e SGC7901-ATF4, 5 ug /ml; para SGC7901 /ADR-NC, SGC7901 /ADR-SCR, e SGC7901 /ADR-siATF4, 10 ug /ml) durante 36 h. Depois, foram realizadas a Hoechst 33258 coloração nuclear e ensaio de fragmentação de DNA. (H) SGC7901 e estáveis ​​transfectadas linhas celulares SGC7901 /ADR como acima foram incubadas durante 6-24 horas adicionais em meio fresco com concentrações indicadas de cisplatina (por SGC7901 vector e SGC7901-ATF4, 10 ug /ml; para SGC7901 /ADR- SCR e SGC7901 /ADR-siATF4, 20 ug /ml). Na altura indicada, os extractos de proteína foram recolhidas e submetidas a análise de imunotransferência para a caspase-3 (formas não clivadas e clivados). β-actina foi utilizado como um controlo interno.

Para investigar se a sobre-expressão ATF4 é suficiente para induzir um fenótipo MDR em células de cancro gástrico,

ATF4

ADNc expressão foi transfectado estavelmente em SGC7901 e células AGS. Primeiro, a sensibilidade de CDDP foi testado utilizando um ensaio de formação de colónias. Como mostrado pela quantificação do ensaio de formação de colónia, ATF4 superexpressão resultou num aumento de quase 3 vezes no número de colónias em comparação com células que expressam o vector vazio (Fig. 1B). ensaios MTT também indicou que o IC

50 valores de SGC7901-ATF4 para ADR, VCR, CDDP, e 5-FU foram significativamente aumentados em comparação com células vetor transfectadas vazios (Fig. 1D).

Como níveis ATF4 são elevados em células de câncer gástrico MDR, queríamos ainda mais para determinar se a segmentação ATF4 poderia re-sensibilizar as linhas de células MDR. Knockdown de

ATF4

por siRNA no ADR ea SGC7901 /VCR células SGC7901 /levaram a uma de 2 a 3 vezes a redução no número de células quando usado em combinação com CDDP (Fig. 1C). Os dados na fig. 1E também sugerem que a sub-regulação de

ATF4

inverte significativamente a resistência das células SGC7901 /ADR em resposta à quimioterapia.

como a inibição da apoptose é um dos importantes mecanismos de MDR, também investigamos a capacidade de as células SGC7901 /ADR transfectadas com o específico

ATF4

siRNA para sofrer apoptose induzida por CDDP através de ensaios de coloração e fragmentação de ADN Hoechst. Tratamento de SGC7901-ATF4 células e /ADR-SCR SGC7901 com as concentrações indicadas de CDDP, durante 36 horas não induziu qualquer apoptose, tal como avaliado por coloração nuclear Hoechst (Fig. 1F) e ensaios de fragmentação de ADN (Fig. 1G). Em contraste, SGC7901 por vetores e SGC7901 /ADR-siATF4 células exibido apoptose significativa, com o aparecimento mais frequente de núcleos condensados ​​e fragmentados e formação de escada de DNA. Além disso, observou-se a clivagem mais óbvia de procaspase-3 após o tratamento com CDDP em SGC7901 vector e células SGC7901 /ADR-siATF4 em comparação com células SGC7901-ATF4 e SGC7901 /ADR-SCR, respectivamente (Fig. 1H).

Tomados em conjunto, estes resultados indicam que ATF4 confere um fenótipo MDR às células cancerosas gástricas e ATF4 que a segmentação proporciona um método de sensibilização de células resistentes a tratamentos químicos.

ATF4-regula a expressão de SIRT1, MDR1 , Bcl-2, Bax e em células de cancro gástrico

estudos anteriores relataram que as células que sobre-expressam SIRT1 exibida sensibilidade diminuída à quimioterapia por múltiplos mecanismos de [18], [19], [20], [21]. Nós estávamos curiosos para determinar se

SIRT1

, que é um gene relacionado ao estresse fundamental para o desenvolvimento MDR, poderia ser o alvo a jusante de ATF4 responsável por mediar MDR-induzida ATF4 em células cancerosas gástricas.

os níveis de SIRT1 em LV-Vector e LV-ATF4 células SGC7901 estavelmente transfectadas foram analisadas por qPCR e Western blot. A sobre-expressão de ATF4 foi associada com aumento da expressão SIRT1, tanto a transcrição (Fig. 2A, esquerdo) e os níveis de translação (Fig. 2B, esquerda). Em contraste, siRNA knockdown de

ATF4

em células SGC7901 /ADR resultou numa redução significativa de endógena

SIRT1

expressão (Fig. 2A e 2B, direita). Estes resultados sugerem que ATF4-se regula

expressão SIRT1

em células cancerosas gástricas.

(A) os níveis de mRNA de SIRT1 em LV-Vector e LV-ATF4 transfectadas estavelmente linhas celulares SGC7901 (à esquerda) e as células ADR (direita) LV-SCR e LV-siATF4 SGC7901 estavelmente transfectadas /foram submetidos a qPCR. GAPDH foram utilizados como um controlo interno. Os dados representam as médias ± S.D. de três experiências independentes. lisados ​​(B) a partir das células na secção A e as respectivas contrapartes não tratadas (NC) foram apagados com os anticorpos indicados. β-actina foi utilizado como um controlo interno.

MDR1, MRP, Bcl-2, Bax e os níveis de expressão Para investigar adicionalmente os mecanismos moleculares envolvidos na MDR-relacionada ATF4 de cancro gástrico, também examinámos nas células gástricas cancerosas utilizadas acima. Como mostrado na Fig. 2B, as células ATF4-proficiente expressa mais MDR1, em comparação com as células de controlo. Entretanto, nenhuma diferença óbvia na expressão de MRP foi encontrada em qualquer uma destas linhas celulares. Curiosamente, ambos os níveis de expressão de Bcl-2 e Bax foram regulados positivamente em células ATF4-proficiente, em comparação com as linhas celulares de controlo, enquanto que a expressão do Bax mostrou apenas ligeiras alterações, o que indica que um aumento da regulação da proteína Bcl-2 a Bax rácio pode suprimir a apoptose induzida por drogas em células cancerosas gástricas-superexpressão ATF4.

Estes resultados indicam que ATF4 promove MDR capacidade das células cancerosas gástricas através de vários mecanismos.

ATF4 transactiva atividade do promotor SIRT1 e liga-se directamente ao promotor SIRT1

para determinar se ATF4 medeia

SIRT1

a transcrição de genes, culas 293T foram co-transfectadas com os 1,2 kb

SIRT1

plasmídeo repórter promotor e o

ATF4

plasmídeo de expressão. O ensaio de repórter de luciferase mostrou que o

SIRT1

actividade do promotor foi marcadamente activado por ATF4 de um modo dependente da dose (Fig. 3A).

(A) As células 293T foram co-transfectadas com o 1.2 kb

SIRT1

plasmídeo repórter promotor e o

ATF4

plasmídeo de expressão. Após 48 horas, o ensaio de repórter de luciferase foi usado para detectar o

SIRT1

actividade do promotor. Os dados representam as médias ± S.D. de três experiências independentes. (B) Uma representação esquemática do promotor do gene humano SIRT1 mostrando as posições dos iniciadores de RT-PCR “para análise de chip. (C) Ensaio ChIP foi utilizado para detectar a ligação directa do ATF4 para o

promotor SIRT1

. células SGC7901-ATF4 foram processadas para ChIP utilizando anticorpos anti-ATF4. A1 representa o sítio de ligação putativo distai e A2 representa o sítio de ligação putativo proximal. Os iniciadores do promotor ASNS foram usadas como controlo positivo, e os iniciadores GAPDH foram utilizados como um controlo negativo.

Numa tentativa para obter uma visão específica sobre os mecanismos de

SIRT1

indução, examinamos as possíveis vias de indução de ATF4. Ao analisar a sequência flanqueante 5 ‘do

gene SIRT1

com softwares de bioinformática (serviço Tfsitescan, TESS, e Genomatix), dois sítios de ligação ATF4 putativos foram identificados na região de -950 para -600 pb do

SIRT1

promotor (Fig. 3B).

Para determinar se

SIRT1

é um alvo direto de ATF4, chip com o anticorpo ATF4 usando células SGC7901-ATF4 mostrou o enriquecimento de ambos sites dentro do

região promotora SIRT1

vinculativo, indicando que o RNA e nível de proteína subsequente aumento de

SIRT1

em linhas de células que expressam ATF4 são provavelmente devido a uma interação direta de ATF4 com o

promotor SIRT1

gene (Fig. 3C).

para investigar o papel dos dois locais de ligação na regulação ATF4 SIRT1 transactivação, mutagénese dirigida ao local foi usado para transformar estes locais. ensaio de repórter de luciferase mostraram que tanto a mutação do local de ligação ou um local de ligação 2 reduziu a actividade do promotor induzida por SIRT1 ATF4. Além disso, a mutação de ambos os sítios de ligação aboliu a actividade do promotor SIRT1. Estes resultados sugerem que os sítios de ligação tanto ATF4 estão envolvidos na transactivação do promotor SIRT1 (Fig. S1).

Tomados em conjunto, estes resultados indicam que SIRT1 é um alvo da transcrição directa de ATF4.

SIRT1

inibição por siRNA em parte inverte o fenótipo MDR de células cancerosas gástricas-superexpressão ATF4

a identificação dos mediada por ATF4

nível de expressão SIRT1

aumentos em células cancerosas gástricas, solicitado -nos analisar o papel desta via em MDR câncer gástrico. Para resolver isso, nós comparamos a

in vitro

sensibilidade droga em ATF4 estavelmente transfectadas células cancerosas gástricas após transfecção de

SIRT1

siRNA ou mexidos siRNA por formação de colónia e ensaios MTT. Knockdown de

SIRT1

por siRNA em células SGC7901-ATF4 levaram a a 40% de redução no número de colónias quando usado em combinação com CDDP (Fig. 4A, superior). Este efeito também foi observado em células AGS-ATF4 (Fig. 4A, inferior). Além disso, os dados do ensaio MTT também indicaram que knockdown de

SIRT1

poderia re-sensibilizar as células SGC7901-ATF4 a drogas químicas, mas isto não aconteceu em células mexidos siARN transfectadas (Fig. 4B).

(A) SGC7901-ATF4 e células AGS-ATF4 foram transfectadas com siRNA mexidos (SCR) ou SIRT1 siRNA (siSIRT1). Setenta e duas horas mais tarde, as linhas celulares foram tratados continuamente com 0 ou 0,25 ug /mL de cisplatina para 14 d; media foi trocado a cada 3 d. As células foram plaqueadas em triplicado, e a experiência foi repetida três vezes. poços representativos são mostrados. Gráficos fornecem quantificação média como uma percentagem das células não tratadas. Inset, a expressão da proteína SIRT1 relativa por Western Blot. (B) células SGC7901-ATF4 foram transfectadas com siRNA mexidos (SCR) ou SIRT1 siRNA (siSIRT1). Setenta e duas horas mais tarde, ambas as linhas celulares foram tratadas com as doses indicadas de drogas diferentes para adicional de 72 h.

In vitro

sensibilidade droga foi testada pelo ensaio de MTT. Os dados representam as médias ± S.D. de três experiências independentes.

Para determinar se SIRT1 protege as células de apoptose induzida pela CDDP, células SGC7901-ATF4 transfectada com

SIRT1

siRNA ou mexidos siRNA foram tratados com CDDP e rotuladas com anexina V e PI. As células apoptóticas foram identificadas por etiquetagem Anexina V. A percentagem de apoptose das células transfectadas SIRT1 siARN SGC7901-ATF4 foi significativamente maior do que a das células de controlo (Fig. 5A, 72,8% vs 25,9%). A aparência de núcleos condensados ​​e fragmentados também foi aumentada nas células transfectadas SIRT1 siRNA em comparação com as células de controlo (Fig. 5b). Além disso, a clivagem de pro-caspase-3 foi observado tão cedo quanto 12 h após o tratamento com 10 ug /ml de CDDP em SIRT1 siARN transfectadas células SGC7901-ATF4, mas não em células tratadas com siRNA mexidos, mesmo após 24 h de tratamento com CDDP (Fig. 5C ). Estes resultados sugerem que a sobre-expressão SIRT1 suprime a apoptose induzida pela CDDP.

células SGC7901-ATF4 (A) foram transfectadas com ARNsi mexidos (SCR) ou SIRT1 siRNA (siSIRT1). Setenta e duas horas mais tarde, as células foram incubadas durante mais 36 h em meio fresco, na ausência ou na presença de cisplatina a 5 ug /ml. Após o tratamento de droga, as células foram marcadas com Anexina V e PI. O padrão de distribuição de células vivas e apoptóticos foi determinada por análise FACS. (B) As células-SGC7901 ATF4 foram transfectadas com o mesmo modo na secção A e em seguida tratou-se com 5 ug /mL de cisplatina durante 36 h. Em seguida, a Hoechst 33258 coloração nuclear foi realizada para detectar células apoptóticas. células (C) SGC7901-ATF4 foram transfectadas com o mesmo modo na secção A e foram incubadas durante 6-24 horas adicionais em meio fresco com 10 ug /ml de cisplatina. Na altura indicada, os extractos de proteína foram recolhidas e submetidas a análise de imunotransferência para a caspase-3 (formas não clivadas e clivados). β-actina foi utilizado como um controlo interno. (D) As células-SGC7901 ATF4 foram transfectadas por da mesma forma em secção A. Setenta e duas horas mais tarde, lisados ​​de células foram testados com os anticorpos indicados. β-actina foi utilizada como um controlo interno.

Para estudar o efeito da diminuição da regulação da SIRT1 por siRNA em moléculas MDR associada, examinamos MDR1, MRP, Bcl-2 e Bax níveis de expressão em células SGC7901-ATF4 após transfecção com SIRT1 siRNA ou mexidos siARN. A sub-regulação de MDR1 foi observada nas células tratadas com siRNA SIRT1 (Fig. 5D) em comparação com as células de controlo. Em contraste, não foram encontradas diferença óbvia de MRP, Bcl-2, e os níveis de expressão Bax entre as amostras.

Estas observações indicam que SIRT1 medeia o efeito MDR-induzida ATF4 em células cancerosas gástricas.

a inibição da actividade SIRT1 re-sensibiliza células transfectadas ATF4 a agentes que danificam o DNA

para fornecer evidências de que a atividade catalítica SIRT1 também é responsável para as células induzidas por ATF4 MDR, SGC7901-ATF4 foram pré-tratados com EX-527 , um novo e potente inibidor e de pequena molécula específica de SIRT1, e seguida de tratamento com diferentes drogas químicas. Em primeiro lugar, determinou-se a citotoxicidade basal de EX-527 em LV-Vector e LV-ATF4 células SGC7901 transfectadas de forma estável. O ensaio de MTT revelou que EX-527 em concentrações até 10 uM não inibiu, mas sim ligeiramente aumentado, a viabilidade de ambas as linhas celulares (Fig. 6A). Em seguida, examinámos a SIRT1, ATF4, MDR1, MRP, a Bcl-2, Bax e os níveis de expressão após 24 horas de incubação com ou sem as doses indicadas de EX-527 em células de cancro gástrico utilizados acima. Apenas a expressão de MDR1 foram regulados negativamente por EX-527 de um modo dependente da concentração (Fig. 6B). Em seguida, pré-incubadas células SGC7901-ATF4 com veículo ou EX-527 (0,5, 1, 2, 4, e 10 uM) durante 24 h, e, em seguida CDDP- e morte celular 5-FU-mediada foi monitorizada. Como mostrado na Fig. 6C, EX-527 aumentou significativamente a citotoxicidade de ambos os fármacos de uma maneira dependente da dose. Determinou-se também o efeito sinérgico possível de EX-527 em diferentes doses de inibição CDDP- e 5-FU-mediada de proliferação celular em células SGC7901-ATF4. Como esperado, 10 uM EX-527 é suficiente para potenciar a citotoxicidade de ambos os fármacos (Fig. 6D).

(A) e Vector LV-LV-ATF4 SGC7901 transfectadas estavelmente linhas celulares foram incubadas com ou sem o doses indicadas de EX-527. Noventa e seis horas mais tarde, as viabilidades celulares foram determinadas por ensaio MTT. (B) As linhas celulares transfectadas de forma estável SGC7901 na secção A, foram incubadas com ou sem EX-527 (1-10 uM), durante 24 h, e os lisados ​​celulares totais foram sujeitos a imunotransf erência com os anticorpos indicados. β-actina foi utilizado como um controlo interno. células (C) SGC7901-ATF4 foram pré-incubadas com as doses indicadas de EX-527 durante 24 h. Em seguida, as células SGC7901-Vector e SGC7901-ATF4 foram expostas a cisplatina (1 ug /mL) ou 5-fluorouracilo (1,25 ug /ml) durante 72 h adicionais. As viabilidades celulares foram determinadas por ensaio MTT. (D) As células-SGC7901 ATF4 foram pré-incubadas com ou sem EX-527 (10 uM) durante 24 h. Em seguida, as células foram expostas às doses indicadas de cisplatina ou 5-fluorouracilo para mais 72 h. As viabilidades celulares foram determinadas por ensaio MTT. Todos os dados representam as médias ± S.D. de três experiências independentes. Gráficos fornecem quantificação média como uma percentagem das células não tratadas.

Estes resultados sugerem que a atividade SIRT1 também desempenha um papel crítico no MDR câncer gástrico induzida por ATF4 e esse papel pode ser mediada, em parte, através da expressão MDR1 .

Discussão

MDR coloca desafios clínicos significativos para a quimioterapia eficaz de muitas doenças malignas humanas. Os mecanismos pelos quais as células adquirem resistência são múltiplas e complexas, de modo mais abrangente compreensão das mesmas, bem como a identificação de novos mecanismos para chemoresistance, será particularmente útil para fornecer melhores opções terapêuticas. Este estudo é o primeiro relatório que altos níveis de ATF4, comumente visto em células tumorais em circunstâncias estressantes, confere células cancerosas gástricas com um fenótipo MDR, e identifica que este efeito é mediado em parte pela transativação de expressão SIRT1.

ATF4

e

SIRT1 quais são evolutivamente genes de resposta ao estresse conservados envolvidos em um amplo espectro de processos biológicos, muitos dos quais são salutares para a homeostase e proteção celular [22], [23], [ ,,,0],24]. Ambos os genes são induzidos em resposta a uma variedade de tensões, incluindo privação de oxigénio (hipoxia /anoxia), o stress oxidativo, danos no ADN, privação nutricional, e stress quimiotóxicas. Levenson VV

et ai.

Primeiro relataram que as alterações na expressão de ATF4 poderia desempenhar um papel na resistência pleiotrópica a diferentes classes de drogas de direccionamento de ADN [16]. Nos últimos anos, vários estudos descobriram que ATF4 estava envolvido direta ou indiretamente no desenvolvimento de resistência aos medicamentos através de autofagia, o sistema dependentes da glutationa redox, e reparação de danos ao DNA [11], [12], [13], [14] [15], [16], [17], [25], [26]. Aqui mostra-se que a capacidade de protecção de ATF4 fato medeia um fenótipo MDR em linhas celulares de cancro que sobre-expressam ATF4 gástricas em resposta à quimioterapia. Nossos resultados mostram claramente que a superexpressão de ATF4 em células cancerosas gástricas foi associada com mais resistência, enquanto o knockdown de ATF4 induzida re-sensibilização. Estes dados sugerem que ATF4 é provavelmente um importante mediador a jusante da resistência causada por múltiplos mecanismos e é, portanto, um alvo terapêutico valioso. No entanto, como um dos mais importantes mediadores da transcrição do ISR que activa uma variedade de genes alvo que promovem a restauração da homeostase, ATF4 pode também mediar a resistência por outros mecanismos. No nosso estudo, SIRT1 foi encontrado para ser regulados positivamente em células que sobre-expressam ATF4, em comparação com células transfectadas vector. Em contraste, o knockdown de

ATF4

com ATF4 siRNA específico levou a uma diminuição da regulação da SIRT1 em células de câncer gástrico MDR. Nossos resultados sugerem que SIRT1 pode ser um mediador a jusante do câncer gástrico induzida por ATF4 MDR.

Como um membro da subfamília ATF do fecho de leucina-região básica (bZIP) fatores de transcrição [22], ATF4 tem a potencial de actuar tanto como um activador transcricional ou um repressor de transcrição ou por meio de ATF elemento responsivo a AMPc (CRE) sítios de ligação de [22]. O local de ligação de consenso para ATF foi definida como TGACGT (C /A) (G /A) [27], que é uma sequência idêntica ao consenso elemento CRE (TGACGTCA) [28]. Além disso, o motivo do núcleo altamente conservada – ACGT – na maioria dos CRE [29] pode ligar-se a diferentes factores bZIP, consoante as bases que flanqueiam o motivo de núcleo [22], [30], [31]. Em nosso estudo dois sítios de ligação putativos ATF-CRE foram encontrados em 1,2 kb

SIRT1 e região promotor e ATF4 diretamente ativados

SIRT1

transcrição via ligação a ambos os elementos de ligação. No entanto, como os dois sítios de ligação desempenhar as suas funções em condições de estresse detalhadas permanece desconhecido e requer uma investigação mais aprofundada.

Mammalian

SIRT1

é o homólogo mais próximo da levedura

Sir2 Comprar e o membro da família mais estudada SIRT. É fortemente implicada na regulação de processos celulares que determinam a longevidade, incluindo o anti-apoptose, protecção neuronal, e senescência celular ou envelhecimento [32]. Recentemente, um número cada vez maior de estudos têm implicado o aumento da expressão de SIRT1 com resistência à quimioterapia e à radiação [18], [19], [20], [33], [34], [35], [36] ionizante. Por exemplo, a sobre-expressão SIRT1 foi encontrado no neuroblastoma resistente a drogas, osteossarcoma, da mama, do ovário, da próstata, do cólon, e linhas celulares de cancro do pulmão, em comparação com os seus homólogos sensíveis a fármacos. Todos estes efeitos resistentes a drogas de SIRT1 poderia ser devido ao seu efeito anti-apoptótico [37], [38] e o silenciamento de genes supressores de tumor [39]. Finalmente, podemos prever que, se SIRT1 está envolvido na MDR induzida por ATF4, a inibição da SIRT1 deve afectar a sensibilidade de células que sobre-expressam ATF4 em resposta à quimioterapia. Como esperado, ambos siRNA e a inibição farmacológica de SIRT1 poderia re-sensibilizar as células que sobre-expressam ATF4 a drogas químicas. Além disso, o nosso estudo indica que SIRT1 protege as células de morte, em parte, através de um efeito anti-apoptótico.

tem sido relatado que MDR1 foi regulados positivamente em células com a expressão aumentada SIRT1 [18], [36]. Neste estudo, também foi demonstrado que MDR1 é sobre-regulada em células que sobre-expressam ATF4, e knockdown de SIRT1 com SIRT1 siRNA específico ou inibir a sua actividade com EX-527 poderia levar a sub-regulação de MDR1, o que é consistente com uma droga papel resistente à por SIRT1. No entanto, a proporção de Bcl-2 /Bax, a qual foi regulada em células que sobre-expressam ATF4, era independente de SIRT1, sugerindo que os mecanismos independentes de SIRT1 também desempenhar um papel na MDR induzida por ATF4 em células de cancro gástrico.

Em resumo, demonstrámos que ATF4 confere um fenótipo MDR às células cancerosas gástricas, e este efeito é mediado, em parte, por sobre-expressão de transactivação de SIRT1. Além disso, ATF4 é um alvo válido em tumores gástricos resistentes a drogas, e desenvolver novos inibidores eficazes de ATF4 deve ser tomado em consideração no futuro. Estes resultados fornecem novos insights sobre o papel da ATF4 no controle da expressão SIRT1 e em suas características de tensão-resistência em tumorigênese e quimioterapia. Isto é especialmente importante para a consideração clínica, como ATF4 pode ser regulada para cima pela privação de oxigênio, estresse oxidativo, privação nutricional e quase todos os estressores adversos em um microambiente do tumor, o que poderia ser sequestrados pelas células cancerosas para escapar inibição da proliferação e morte celular em resposta à quimioterapia. Portanto, as intervenções baseiam em interromper expressão ATF4 induzida por estresse em células de câncer pode ser eficaz em contornar ou reverter a resistência a drogas em câncer gástrico.

Materiais e Métodos

Para métodos detalhados, consulte Texto S1 .

cultura de células e reagentes

as linhas de células adenocarcinoma gástrico humanos SGC7901 (obtido a partir da Academia de Ciências Médicas militares, Beijing, China) eo MDR variantes, SGC7901 /ADR e SGC7901 /VCR (estabelecido e mantido no nosso laboratório), e AGS (obtidos a partir do banco de células da Academia chinesa de Ciências, Xangai, China) foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Hyclone) e penicilina /estreptomicina. As células 293T (também obtidos a partir do banco de células da Academia Chinesa de Ciências) foram cultivadas em DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10%. Para manter o fenótipo MDR, adriamicina (com uma concentração final de 0,5 ug /ml) e vincristina (com uma concentração final de 1 ug /ml) foram adicionados ao meio de cultura para SGC7901 /ADR e células SGC7901 /VCR, respectivamente. EX-527 (Sigma) foi dissolvido em DMSO nas concentrações indicadas. A adriamicina (ADR), vincristina (VCR), cisplatina (CDDP), e 5-fluorouracilo (5-FU) foram dissolvidos em solução salina normal a concentrações indicadas.

transfecção de células e linhas celulares estáveis ​​

O humano

ATF4

plasmídeo de expressão (pCMV5-ATF4) foi gentilmente cedido pelo Professor Amy S. Lee [25]. Lentiviral vector que codifica siRNA específico para

ATF4

e ARNsi de controlo foram gerados com a utilização de PLKO.1-TRC (Addgene) e foram designados como LV-siATF4 e controlo LV-SCR, respectivamente. ATF4 gene humano lentiviral vector que codifica foram construídos em FUW-teto (Addgene), designado como LV-ATF4. O vector vazio foi utilizado como controlo negativo, designado como LV-vector. As linhas celulares estáveis ​​foram gerados por transfecção de construções lentivirais indicados seguido de selecção em puromicina ou zeocina (Invitrogen), respectivamente.