Abstract

vírus persistentes são mantidos em cheque por linfócitos específicos. O repertório de receptor de células T clonal (TCR) contra o vírus de Epstein-Barr (EBV), uma vez estabelecida a seguir a infecção primária, apresenta uma estabilidade robusta ao longo do tempo. No entanto, os determinantes que contribuem para esta persistência a longo prazo ainda não estão bem caracterizadas. Aproveitando-se de um

in vivo

ambiente clínico onde homeostase do linfócito foi transitoriamente perturbado, estudamos células T CD8 específicas para o antigénio EBV antes e após a quimioterapia de empobrecimento do linfo não-mieloablativo de pacientes com melanoma. Apesar de a diferenciação de células T mais avançada, os doentes células T mostraram composição clonal comparável a indivíduos saudáveis, compartilhando uma preferência por

TRBV20

e

TRBV29

uso de segmentos de gene e vários clonotypes TCR públicas co-dominantes. Além disso, nossos dados revelaram a presença de um número relativamente pequeno clonotypes de células T específicas de antigénio EBV dominante, que em sua maioria persistiu seguinte transitória linfo-exaustão (TLD) e recuperação de linfócitos, provavelmente relacionado à ausência de reativação e

de novo

iniciação das células T nesses pacientes. Curiosamente, clonotypes persistem frequentemente memória /genes co-expressa associado-homing (

CD27

,

IL7R

,

EOMES, CD62L /SELL

e

CCR5

) apoiar a noção de que eles são particularmente importantes para as respostas das células de longa duração T CD8. No entanto, a composição clonal de células T CD8 específicas do EBV foi conservada ao longo do tempo, com a presença dos mesmos clonotypes dominante após a quimioterapia não mieloablativo. A persistência clonotipo observada demonstra elevada robustez da homeostase células T CD8 e reconstituição

Citation:. Iancu EM, Gannon PO, Laurent J, Gupta B, Romero P, Michielin O, et al. (2013) A persistência de EBV Antígeno-Específicos Clonotypes células T CD8 durante Homeostáticos Imune reconstituição em pacientes com câncer. PLoS ONE 8 (10): e78686. doi: 10.1371 /journal.pone.0078686

editor: Derya Unutmaz, Universidade de Nova Iorque, Estados Unidos da América

Recebido: 01 de agosto de 2013; Aceito: 15 de setembro de 2013; Publicação: 25 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Iancu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi patrocinado e apoiado pelo Centro Nacional suíço de Competência em Pesquisa (NCCR) Oncologia Molecular eo Swiss National Science Foundation concede 32003B0-118123 e 310.030-129.670. P. O. Gannon é também o destinatário de uma bolsa da Canadian Institutes of Health Research (CIHR-IRSC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

primária vírus de Epstein-Barr (EBV) é associado com a replicação virai maciça. Apesar de a geração de uma resposta imunitária específica de células T robusta, EBV estabelece uma infecção latente em células B [1]. No entanto, indivíduos infectados com EBV assintomáticos saudáveis ​​permanecer durante toda a sua vida, devido à contenção viral pela memória específica para o antigénio linfócitos T CD8 [1-3]. Como cada vez mais atenção é dedicada a optimizar estratégias de vacinação terapêutica contra o cancro, no controle imunológico de infecção por EBV crónicas representa um sistema modelo interessante para estudar os mecanismos envolvidos na geração e manutenção de respostas imunitárias protectoras de longa vida

.

A pool de células sensibilizadas com antigénio T CD8 é altamente heterogénea e compreende subpopulações de células T em diferentes graus de diferenciação celular com base na sua fenótipo, função e localização anatómica, tornando assim a distinção entre “efectora” e células T citolíticas “memória” desafiando [4- 6]. Geralmente, as células T de memória semelhantes a exibir a sobrevivência a longo prazo e capacidade de auto-renovação, elevado potencial proliferativo e capacidade para produzir rapidamente e eficientemente células efectoras em resposta ao antigénio reencontro [7-9]. Em contraste, as células T efectoras têm a capacidade de migrar para o local da inflamação, para matar células alvo antigene e segregam várias citocinas (por exemplo IFN-y, TNFa) [10].

se as respostas de memória de células são mantidas por períodos prolongados ou periodicamente “renovado” continua a ser uma questão de debate. É uma questão particularmente difícil de tratar em humanos, uma vez que requer uma análise em profundidade das respostas imunes durante longos períodos de tempo. A este respeito, o receptor de células T (TCR) é um excelente marcador que permite que as respostas específicas de antigénio para ser seguido ao longo de diferenciação das células T e com o tempo [11]. As análises exaustivas de ambas as respostas de células T CD8 + específicas de antigénio virais e tumorais revelaram que o repertório de células T específicas de antigénio é geralmente composto por altamente frequente (também definido como dominante), bem como menos frequente (definida como não-dominante) células T clonotypes [12,13]. Através de um processo conhecido como selecção clonotipo TCR, certos clonotypes pode tornar-se mais dominante ao longo de diferenciação das células T [14-16] ou ao longo do curso tempo da infecção [17]. Persistência de clonotypes células T específicas de vírus humanos ao longo de vários anos tem sido demonstrada nos seres humanos com várias infecções virais: Influenza [18], vírus do herpes simplex [19,20], EBV [21], o citomegalovírus (CMV) [14] e humana vírus da imunodeficiência (HIV) [22]. Recentemente, Klarenbeek e colegas [23] abordaram a questão de saber se o repertório clonal que é estabelecida durante a fase precoce de infecções por CMV e EBV contra é mantida ao longo de períodos de tempo prolongados. Eles descobriram que as respostas imunes foram muito estáveis, e uma vez estabelecida não evoluíram durante o ano 5 acompanhamento [23]. Enquanto as respostas das células T específicas para o vírus do herpes revelou uma estabilidade sem precedentes do repertório clonotipo TCR ao longo do tempo após a infecção primária, pouco se sabe sobre sua persistência em condições de estresse imunológico em portadores assintomáticos.

No presente estudo, examinou a robustez das respostas específicas de antigénio EBV em um

in vivo

ambiente onde o equilíbrio entre o vírus ea resposta imune pode ser temporariamente comprometida seguinte transitória linfo-exaustão (TLD). Especificamente, avaliou-se a composição de antigénio específico de EBV-T CD8 clonotipo celular e persistência em doentes de melanoma que foram tratadas com regimes de quimioterapia não mieloablativo, seguido por transferência adoptiva de células (ACT) de células mononucleares autólogas do sangue periférico (PBMC) [24,25 ]. Para avaliar quantitativamente as respostas das células T específicas do vírus, directa

ex vivo

clonotípico análises combinadas a perfis de células T específicas de antigénio individuais expressão do gene foram realizadas [13]. As respostas anti-virais de células T em pacientes eram mais diferenciado em comparação com indivíduos saudáveis, compreendendo tanto células T CD8 efetoras de memória e. Dominantes TCR clonotypes de cadeia beta, incluindo várias sequências de TCR públicas, foram encontrados a persistir com o tempo em indivíduos saudáveis ​​e seguindo TLD e ACT entre os pacientes. Em seguida, estudou clonotypes células T com frequências flutuantes seguintes TLD e reconstituição imune, e observou que clonotypes com maior frequência realizada uma memória polifuncional /homing perfil de expressão gênica (

CD27

,

IL7R

,

EOMES, CD62L /SELL

e

CCR5

). Ao todo, nossos dados sugerem que o repertório de células T específicos do EBV persiste não apenas sob condições de estado estacionário, mas também durante perturbações imunológicas transitórios.

Materiais e Métodos

declaração Ética

os estudos clínicos foram concebidos e realizados de acordo com as normas regulamentares aplicáveis, e aprovado pela (i) a comissão de ética da Universidade de Lausanne, (ii) Comité de revisão de LICR Protocolo, e (iii) a autoridade reguladora nacional suíça (Swissmedic ). Que tenham sido registadas nos ensaios clínicos do NCI sob o número NCT00324623 e EU20607 (www.clinicaltrials.gov). Todas as amostras de sangue de pacientes foram recolhidos no momento do consentimento informado por escrito. Amostras de sangue periférico de BCl3 doadores saudáveis ​​quatro EBV-positivo, BCL4, BCL7 e BCL8, com idades entre 25 e 45 anos, foram coletadas em dois pontos no tempo, nos anos de 2002 e 2006, e todos os doadores deram consentimento informado por escrito.

pacientes e tratamento de melanoma

amostras de sangue de cinco doentes com melanoma EBV positivos, com idades entre 39 e 75 anos, matriculados em fase I de ensaios clínicos no Departamento de Oncologia do Hospital Universitário de Lausanne (Suíça) , foram colhidas em diversos pontos de tempo antes e depois do tratamento. Após a recolha de PBMCs por leucaferese (Leuka), os pacientes receberam quimioterapia regime não mieloablativo consistindo de busulfano a 2 mg /kg (pacientes LAU 618 e Lau 672) ou ciclofosfamida (CTX) a 30 mg /kg (LAU 1144 e primeira ronda para LAU 1013) ou 60 mg /kg (LAU 936 e segunda rodada de LAU 1013) por dois dias e fludarabina a 30 mg /m

2 para 3 dias [24,25]. Três dias após a última injecção de fludarabina, PBMC autólogos foram infundidas e vacinação com o péptido Melan-A péptido análogo emulsionado em adjuvante de Freund incompleto ‘foi dada por via subcutânea como descrito anteriormente [24]. Paciente 1144 LAU também recebeu uma proteína LAG-3 solúvel como adjuvante.

Os níveis de anticorpos contra o EBV em doentes com melanoma

As amostras de plasma foram obtidas de todos os pacientes em vários pontos de tempo antes e depois do tratamento de empobrecimento do linfo e analisado para alterações nos níveis de anticorpos que se sabe estarem associados com um estado de reativação. Especificamente, foram comparados os níveis de anticorpos no plasma contra três EBV proteínas expressas: EBNA-IgG (Epstein-Barr Nuclear Antigen), EA-IgG (início Antigen), VCA-IgG e IgM (Viral Capsid Antigen). anticorpos específicos de EBV foi analisada utilizando o sistema de teste de EBV Athena Multi-Lyte (Zeus científica, Sommerville, NJ, EUA) num leitor de Luminex 200 de acordo com as instruções do fabricante. Os resultados foram expressos como unidades arbitrárias.

preparação celular e citometria de fluxo

PBMC foram obtidas por centrifugação de densidade usando Ficoll-Hypaque (Pharmacia, Uppsala, Suécia). linfócitos T CD8 foram positivamente enriquecido a partir de PBMCs criopreservadas usando anti-CD8-revestidas microesferas magnéticas (Miltenyi Biotec, Bergish Gladbach, Alemanha). Foram preparados multímeros * 0201 /péptido marcado com PE-HLA-A, tal como descrito anteriormente [26] com o HLA-A2 restrita epitopo GLCTLVAML (designado como A2 /GLC) derivado da proteína lítico BMFL1 EBV. As células foram primeiramente coradas com multímeros marcado com PE durante 1 hora à temperatura ambiente (TA) em PBS, BSA a 0,2%, EDTA 50 uM, e, em seguida, com anticorpos apropriados (20 min a 4 ° C). As células foram analisadas quer directamente (LSR-II de citometria de fluxo; BD Biosciences, San Diego, CA) ou classificados em populações definidas usando uma máquina FACSVantage SE (BD Biosciences). Os seguintes Abs monoclonais foram adquiridos a BD Biosciences ou BD PharMingen; anti-CD28-FITC, anti-CD8-aloficocianina /Cy7, anti-CCR7 IgG de rato mAb de cabra anti-IgG de rato-aloficocianina, e CD3-AmCyan-A. Anti-CD45RA-PE-Texas mAb Red foi adquirida da Beckman Coulter (Marselha, França).

Geração de T clones celulares e cultura

HLA-A2 /multimero

+ CD8

+ subpopulações de células T foram definidos como efetoras memória (eM) CCR7

-CD45RA

-CD28

+ (EM28

pos), CCR7

-CD45RA

-CD28

– (EM28

neg) e CCR7 efetoras

-CD45RA

+ CD28

– (EMRA), e foram classificadas por citometria de fluxo diretamente

ex vivo

(Figura S1) . As células seleccionadas foram clonados por diluição limitante e expandida em meio RPMI 1640 suplementado com 8% de soro humano (SH), 150 U /ml de recombinante humano IL-2 (rhIL-2; um presente da GlaxoSmithKline), 1 micrograma /ml de fito-hemaglutinina (PHA ; Sodiag, Losone, Suíça) e 1×10

6 /ml irradiado PBMC alogénicos (3’000 rad) como células alimentadoras. A2 /multimero

clones de células T foram expandidas + por periódicos (cada 15 dias) a re-estimulação em placas de 24 cavidades com PHA, células de alimentação irradiadas e hrIL-2.

Direto ex vivo separação de células, a amplificação de cDNA e gene-específico de célula única PCR

alíquotas individuais ou cinco celulares foram classificados diretamente

ex vivo

de subpopulações de células T de interesse e preparação de ADNc e a amplificação de ADNc globais realizados como previamente descrito [27,28]. assinatura gene de célula T indivíduo foi identificado por PCR específicos do gene, como descrito [28] e os produtos de PCR visualizadas após electroforese num gel de agarose a 2,5%. Foram utilizados os seguintes iniciadores:

GAPDH

: 5′-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 ‘; Rev-5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3 ‘,

microglobulina beta2

: 5′-CCAGCAGAGAATGGAAA GTC-3′; Rev-5′-GATGCTGCTTACATGTCTCG-3 ‘,

CCR7

: 5′-CCAGGCCTTATCTCC AAGACC-3′; Rev-5′-GCATGTCATCCCCACTCTG-3 ‘,

CD27

: 5′-ACGTGACAGAGTGCC TTTTCG-3′; Rev-5′-TTTGCCCGTCTTGTAGCATG-3 ‘,

IL7R

(IL-7RA /CD127): 5′-ATC TTGGCCTGTGTGTTATGG-3′; Rev-5′-ATTCTTCTAGTTGCTGAGGAAACG-3 ‘;

EOMES

(eomesodermin): 5′-AGCAGGCTGTGAACATTGG-3 ‘; Rev-5’-TTGACTCCTGGG CCTAGTATC-3 ‘,

CCR5

: 5-TCAGCAGGAAGCAACGAAGG-3′; Rev-5′-TCTTTGACTTG GCCCAGAGG-3 ‘,

KLRD1

(CD94): 5′-CAC GTGGGAGAATGGCTCTG-3′; Rev-5′-TGAGCTGTTGCTTACAGATATAACGA-3 ‘,

IFNG

(IFN-y): 5′-GCCAAC CTAAGCAAGATCCCA-3′; Rev-5′-GGAAGCACCAGGCATGAAATC-3 ‘,

PRF1

(perforina): 5′-TTCACTGCCACGGATGCCTAT-3′; Rev-5′-GCGGAATTTTAGGTGGCCA-3 ‘,

GZMB

(granzima B): 5′-GCAGGAAGATCGAAAGTGCGA-3′; Rev-5′-GCATGCCAT TGTTTCGTCCAT-3 ‘,

VENDA

(CD62L): 5′-CCGTCTGTGAATTGGACCAT-3′; Rev-5′-AAC AGCAAAACCCCCAAACT-3 ‘.

TCR spectratyping, sequenciamento e TCR clonotyping

TCR spectratyping [14] foi usado para identificar todos os clonotypes TCR, que foram classificados de acordo com as imunogenética (IMGT) nomenclatura proposta pelo Lefranc e colegas (http : //imgt.org/) [29]. Para identificar rapidamente o uso de segmentos TRBV, piscinas de cDNA de EBV antígeno-específicas células T CD8 foram inicialmente submetidos a PCR indivíduo usando um conjunto de primers fluorescentes marcado frente previamente validados específico para o TCR 22

BV

subfamílias e um não marcado iniciador específico para a região constante da cadeia beta do TCR [30] reverso. Esta análise spectratyping TRBV-CDR3 representa um passo prescreening que permite poupar tempo e reagentes (dados não mostrados). Uma vez subfamílias TRBV positivos foram identificados, as amostras de cDNA gerada a partir de qualquer indivíduo

ex vivo

ordenadas amostras de células individuais (n = 477) e 5 amostras de células (que representa o equivalente de 300 a células específicas do EBV-450 T CD8 por doador saudável ou doente com melanoma) ou a partir de

in vitro

clones gerados de células T (doadores saudáveis, n = 530 clones; pacientes com melanoma, n = 779 clones) foram submetidos a PCRs específicos-TRBV. A separação e detecção de fragmentos de PCR amplificados, que continha todo o segmento de CDR3 foram realizadas na presença de marcadores de tamanho fluorescentes num ABI PRISM 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems /Life Technologies Corporation, Zug, Suiça) e os dados foram analisados ​​com GeneScan 3.7.1 ( Applied Biosystems). No último passo, os produtos de PCR com interesse foram directamente purificados e sequenciados com o iniciador inverso (Fasteris AS, Genebra, Suíça). A maioria dos produtos de PCR foram sequenciados, no entanto, para vários clonotypes TCR dominantes (n = 8 para altas diluições; n = 10 para os pacientes), iniciadores únicos correspondendo a

CDR3

segmento de gene foram concebidos e utilizados para reacções de PCR como clonotyping previamente descrito [15]. Todos

ex vivo

única célula, 5-celular, e

in vitro

amostras de cDNA geradas T clone de células de doadores saudáveis ​​e pacientes com melanoma foram processados ​​da mesma abordagem rigorosa.

estatística

Tal como indicado ao longo do texto, Kruskal-Wallis não paramétrico, one-way ANOVA e correlação de Spearman foram realizadas com Prism 5.0 (La Jolla, Califórnia, EUA) e

P

0,05 foi considerado estatisticamente significativo. gráficos circulares co-expressão foram comparados uns com os outros usando 10’000 permutações calculados com o SPICE Software 5.2 (NIH, Bethesda, EUA).

Resultados

Avançado diferenciação de células efetoras de células T CD8 específicas para o antigénio EBV seguinte transitória linfo-exaustão e imune reconstituição

Testes recentes de imunoterapia têm mostrado que linfo-exaustão induzida por quimioterapia não mieloablativo favorecida subsequente expansão de células T transferidas adoptivamente por mecanismos homeostáticos ([31]; Figura 1A). Para refinar ainda mais essa estratégia, que anteriormente tinha analisado o impacto de três diferentes regimes de quimioterapia condicionado não-mieloablativo de linfo-exaustão e reconstituição em pacientes com melanoma [24,25]. Os três regimes de quimioterapia induzida depleção transitória significativa de linfócitos, seguido por uma recuperação eficiente do total de linfócitos [24,25] e células T CD8 (Figura 1B, painel esquerdo) conta a níveis normais quatro semanas após a transferência celular adotiva (pós-ACT).

A. Representação esquemática de não myeloablating tratamento de empobrecimento do linfo seguido por ACT de PBMC para pacientes com melanoma. As amostras de sangue foram analisadas para todos os pacientes no momento de ponto leucaferese (Leuka) antes da quimioterapia TLD e pós-ACT (ponto de tempo T1), o que correspondeu a dia 32 (paciente LAU 1144), dia 45 (LAU 1013), ou dia 60 (LAU 618, LAU 936, e LAU 672). B. Painel esquerdo; contagens totais de células T CD8 de cinco pacientes com melanoma em Leuka e pós-ACT. Painel direito; fenótipo do total de células T CD8 mostrando proporções de início diferenciado (EM28

pos; CCR7

negCD45RA

negCD28

pos) e tardia diferenciado (composto de EM28

neg; CCR7

negCD45RA

negCD28

neg e EMRA; CCR7

negCD45RA

posCD28

neg) subconjuntos de quatro dadores saudáveis ​​(HDS) e de cinco pacientes com melanoma em Leuka e pós-ACT. C. Painel esquerdo; contagens totais de células específicas do EBV T CD8 no sangue periférico de cinco pacientes com melanoma em Leuka e pontos de tempo pós-agir. Painel direito; fenótipo de células específicas do EBV T CD8 mostrando proporções de início diferenciado (EM28

pos; CCR7

negCD45RA

negCD28

pos) e tardia diferenciado (composto de EM28

neg; CCR7

negCD45RA

negCD28

neg e EMRA; CCR7

negCD45RA

posCD28

neg) subconjuntos de quatro dadores saudáveis ​​e de cinco pacientes com melanoma em Leuka e pós-ACT. Os níveis de anticorpos D. EBV específicas-medidos em amostras de plasma de cinco pacientes com melanoma em vários pontos de tempo antes e depois do tratamento de empobrecimento do linfo. Dia 0 no eixo dos x representa o dia de ACT. Os resultados são representados como unidades arbitrárias em uma escala índice relativo. evolução nível plasmático é mostrado separadamente para cada anticorpo anti-EBV (anti-VCA IgM e IgG, anti-EBNA IgG e anti-EA IgG), e a barra cinza representa o cut-off entre o estado negativo e positivo para cada marcador.

em seguida, analisamos as células T CD8 específicas para o EBV proteína lítica BMFL1 de cinco pacientes com melanoma em estágio IV antes e depois TLD (Figura S1) e de quatro dadores saudáveis. A proporção total de EBV células T específicas de antigénio, antes e após o tratamento permaneceram inalteradas (Figura 1C; painel esquerdo;

P

= 0,625, teste de Kruskal-Wallis). Em comparação com indivíduos saudáveis, as células BMFL1 específica T CD8 de doentes com melanoma mostrou a diferenciação de células efetoras mais avançado, com maior percentual de EM28

neg (definido como CCR7

negCD45RA

negCD28

neg) e EMRA ( definido como CCR7

negCD45RA

posCD28

neg) subconjuntos já antes do tratamento (ou seja, no momento da leucaferese) (Figura 1C; painel da direita). Estes subconjuntos aumentou ainda mais e tornou-se dominante pós-ACT. Em dadores saudáveis, tais diferenciação celular efectora avançada não é normalmente observada nas células T CD8 específicas do EBV, que se assemelha mais estreitamente com as respostas das células T específicas para CMV [14,32]. Para um ponto mais fraco, a diferenciação avançada célula efectora também foi observada no pool total de células T CD8 (Figura 1B; painel da direita), sugerindo que a anterior história de progressão tumoral e tratamentos recebidos, tais como a quimioterapia e imunoterapia, possa ter afectado o T CD8 compartimento da célula.

transientes linfo-esgotamento não resulta em EBV reactivação

para examinar a capacidade da resposta de células T CD8 específicas de antigénio-EBV para controlar a actividade viral durante situações de controlo imune diminuída, determinou-se a quimioterapia não mieloablativo pode ter resultado na reactivação de EBV. Os níveis de anticorpos de plasma para antígeno do capsídeo viral (VCA) IgG e IgM, antígeno nuclear de Epstein-Barr (EBNA) IgG e antigénio precoce (EA) IgG foram medidos antes e depois do TLD e tratamentos de ACT (Figura 1D) [33]. anticorpos específicos de EBV manteve-se estável durante vários meses após o tratamento em todos os pacientes. Isto é consistente com uma infecção latente pelo EBV sem reactivação virai, embora este último não pode ser completamente excluída. A cópia de ADN de EBV números por milhão de PBMC estavam abaixo do nível de detecção em tempo real por reacção de PCR em amostras de sangue antes e depois TLD (dados não mostrados).

O ex vivo EBV repertório de células T CD8 seguinte transitória linfo-esgotamento antígeno-específica revela clonotipo persistência apesar das flutuações de frequência

Nós já desenvolveram uma estratégia de amplificação de cDNA mundial ao nível de 5-celular adequada para a direta

ex vivo

avaliação do uso de segmentos de gene indivíduo TCR BV-CDR3beta (TRBV) [14,34]. Resumidamente, piscinas de ADNc de células T CD8 específicas do epitopo EBV foram inicialmente gerado e utilizado como uma tela para famílias TRBV recorrentes. Posteriormente, o domínio de cada família TRBV foi determinada testando cada amostra de 5 de uma única célula, que compreende a piscina para as famílias TRBV positivos, e representando o equivalente de 300 a 450 células específicas do vírus T CD8 por indivíduo. Os segmentos de genes TRBV-CDR3 JB amplificados foram sequenciados em última análise, ou PCR-clonotyped para identificar a assinatura original TCR de cada clonotipo de células T, como descrito em Materiais e Métodos. Usando essa abordagem, inicialmente compararam o repertório clonotipo TCR de

directamente ex vivo

classificadas 5-celular de células T específicos para EBV com a de células T individuais gerados pelo

in vitro

culturas de diluição limitante . proporções comparáveis ​​de assinaturas clonotipo TCR indivíduo foram encontrados ao usar o

ex vivo

classificadas 5-celular e a

in vitro abordagens

T clonagem de células (Figura S2A), de acordo com estudos anteriores [14 , 15,28]. Além disso, realizada de forma independente

ex vivo

triagem experiências com células T específicas de antigénio de vírus individuais, revelou frequências relativas semelhantes de clonotypes dominante de células T (Figura S2B). Em conjunto, esses resultados indicam que o nosso

ex vivo

abordagem direta permite a caracterização molecular de alta resolução do repertório clonotipo

In vivo

subpopulações específicas de antigénio no bem definidas.

A seguir, determinou-se a persistência de clonotypes células T EBV BMFL1 específicos-em indivíduos saudáveis ​​ao longo do tempo. A maioria dos clonotypes estavam presentes em ambos pontos de tempo precoces e tardios (Figura 2A). Além disso, uma correlação mostrou uma associação estatisticamente significativa entre as frequências de clonotypes detectadas durante um período de 4 anos (Figura 2B; Rho = 0,739,

P Art 0,001, correlação de Spearman). Pudemos observar o aparecimento de novos clonotypes ao longo do tempo, no entanto estes clonotypes recentemente detectados eram de baixas frequências (

5%) (Figura 2B). Juntos, estes resultados estão em linha com os anteriormente relatados por nosso grupo [14] e outros [23], e indicam que uma vez estabelecida em adultos saudáveis, a composição clonal durante herpes crônica vírus infecção é mantida estável durante pelo menos vários anos.

(2006) pontos de tempo a e C. TRBV composição clonotipo de células T CD8 específicas do EBV em PBMCs de dois dadores saudáveis ​​(a) pelo início (2002) e tardios, e em CMSPs de quatro doentes com melanoma ( C) a Leuka tempo-ponto e pós-ACT. Cada clonotipo é representado por sua família TRBV específica e seu número de código (ClONO). frequências clonotipo são calculados pela presença de cada sequência clonotípico entre as amostras 5 de células individuais (dadores saudáveis, n = 142; melanoma pacientes, n = 344) classificados diretamente

ex

vivo

. De nota, Só as frequências a partir de qualquer nova “aumentar” ou “diminuir” clonotypes são retratados. B e D. A correlação das frequências clonotipo individuais obtidos a partir de

ex

vivo

classificadas amostras 5 de célula (B) entre amostras de sangue no início (2002) e tardia (2006) pontos de tempo de dois dadores saudáveis ​​e (D) entre Leuka e pós-ACT a partir de cinco doentes com melanoma (correlação de Spearman). Inserções mostram a correlação entre clonotypes TCR com frequência inferior a 10% para os doadores saudáveis ​​e 20% para os pacientes.

Foram avaliados ainda mais a EBV antígeno-específica repertório TCR em cinco pacientes com melanoma para determinar o potencial de recuperação de clonotypes células T dominantes seguinte TLD e ACT (Figura 2C). Da mesma forma que os dadores saudáveis, o repertório geral TCR persistiu seguinte TLD e agir com a grande maioria dos clonotypes sendo detectável antes e após o tratamento (Figura 2C). Excepto para o paciente LAU 936, os clonotypes que desapareceram ou apareceram foram de baixa frequência ( 5%), o que pode estar relacionado com a sensibilidade da técnica mais do que o aspecto real ou o desaparecimento de um clonotipo específica. No entanto, encontramos mais acentuadas flutuações nas frequências dos clonotypes detectáveis ​​entre os pacientes em comparação com os doadores saudáveis, que foi especialmente evidente para os clonotypes com freqüências 20% (Figura 2D). Coletivamente, nossos dados mostram que a composição clonal de células T CD8 específicos do EBV foi mantido globalmente em pacientes com melanoma submetidos a TLD e seguido por reconstituição imune, apesar das flutuações em frequências dentro pacientes específicos e por clonotypes detectáveis ​​em frequências mais baixas.

clonotypes específicas de antigénio EBV contendo sequências TRBV públicas são frequentemente partilhadas entre dadores saudáveis ​​e pacientes com melanoma

a grande similaridade das células T CD8 específicos do epitopo EBV entre adultos saudáveis ​​e doentes foi a preferencial

in vivo

seleção de clonotypes dominantes com correntes TRBV pertencentes ao

TRBV14

,

TRBV20

e

TRBV29

famílias (Figura 2). Foram também identificadas pelo menos catorze sequências TRBV públicos, com dois CDR3 motivos RDxTGNGY e VGxGGTNEKL, que foram sobre-representados e compartilhado dentro de indivíduos saudáveis ​​e pacientes com melanoma (Figura 3A). clonotypes públicas são definidas pela presença da mesma sequência TRBV-CDR3 BJ idêntico encontrada em pelo menos dois indivíduos não aparentados. De acordo com relatórios anteriores [35], vários dos clonotypes TRBV públicas identificadas no presente estudo foram codificados por dois ou três variações da sequência de nucleotídeos diferentes. Quando comparamos as frequências de clonotypes TRBV públicas dentro dos respostas de células T CD8 específicos do EBV geral, um terço delas representada clonotypes dominantes (com freqüências 5%) (Figura 3B). Entre 35 a 48% de clonotypes específicas de antigénio EBV foram encontrados em baixas frequências (entre 1 e 5%), enquanto que cerca de um quarto foram encontradas apenas uma vez em dadores saudáveis ​​ou de pacientes. Em conjunto, os nossos dados mostraram evidência para um nível elevado de semelhança de células EBV BMFL1 específicos de T CD8 entre doentes com melanoma e em indivíduos saudáveis, conforme ilustrado por (i) a partilha de sequências TRBV público frequentes e (ii) a persistência destes TRBV pública clonotypes com o tempo e seguindo TLD.

a. Compilação de sequências de TCR-domínio beta 14 aminoácidos pública detectados entre três indivíduos saudáveis ​​e cinco pacientes com melanoma. Cada clonotipo cadeia beta de TCR é descrita pelo segmento TRBV, sequência de CDR3-beta, segmento TRBJ, número de sequência de nucleótidos variantes identificadas para cada sequência de aminoácidos, assim como a proporção de dadores saudáveis ​​e pacientes a partir dos quais foi identificado cada sequência. B. Distribuição de sequências públicas dentro das células T CD8 específicos do EBV globais em dadores saudáveis ​​e pacientes de acordo com a sua frequência relativa; clonotypes dominantes (com frequência 5%) são representadas em preto, baixa dominante (1-5%) em sequências de cinza e originais em branco.

gene aprimorado expressão polifuncionalidade por células T CD8 específicas para o antigénio EBV individuais depois transitória linfo-exaustão e reconstituição imune

Para investigar mais o efeito de TLD e ACT, que caracterizou a evolução da resposta das células EBV-specific CD8 epitopo T em pacientes que foram submetidos a 1013 LAU dois ciclos sucessivos de DPN e a reconstituição imunológica (Figura 4A), sem mostrar sinais de reactivação de EBV (Figura 1D). A frequência de “memória-like” EM28

pos e tardia diferenciadas EM28

neg células T específicos do EBV primeiros diferenciadas /EMRA CD8 foram comparáveis ​​entre os dois pontos de tempo de leucaférese (Leuka I e Leuka II) ( A Figura 4B). Em linha com os dados apresentados na Figura 1, foi observada a melhorada diferenciação celular efectora das células T específicas do EBV antes (em Leuka I) e na sequência de linfo-esgotamento (Leuka II), quando comparado com as células T específicas do vírus a partir de dadores saudáveis .

A. Calendário do regime de tratamento para o paciente LAU 1013, que recebeu duas rodadas de TLD (retratado como caixas cinzentas). As setas cinzentas indicam leucaferese (Leuka Leuka I e II) e a reinfusão de PBMCs, respectivamente. As amostras de sangue foram tiradas no dia 45 (pós-Leuka I) e no dia 15/22 (pós-Leuka II), após a reinfusão. B. fenótipo de células T CD8 específicas-BMFL1 EBV (painel esquerdo) e total de células T CD8 (painel da direita) mostrando as proporções de EM28

pos início diferenciado (; CCR7

negCD45RA

negCD28

pos) e tardia diferenciado (composto de EM28

neg; CCR7

negCD45RA

negCD28

neg e EMRA; CCR7

negCD45RA

posCD28

neg) subconjuntos de PBMC tirado 1013 LAU paciente em Leuka I (n = 2) e Leuka II (n = 3) pontos de tempo. As barras de erro (média +/- SD) representam repetições experimentais independentes. C. direto

ex

vivo

expressão cumulativo de memória genes /associado-homing (

CD62L /SELL

,

CCR5

,

IL7R

,

CD27 Comprar e

EOMES

) e os genes relacionados com a efetoras (

PRF1

,

KLRD1 /CD94

,

IFNG

e

GZMB

). células T CD8 específicos do EBV individuais foram classificadas a partir do início diferenciadas EM28

pos e EMRA tarde diferenciadas em Leuka I (n = 266) e Leuka II (n = 162) pontos de tempo e processados ​​para a amplificação de cDNA global como descrito em Materiais e Métodos.

P

-Valores foram realizadas pelo one-way ANOVA; ns, não significativo.