Abstract

adenovírus (ADS), com exclusão de

E1B55K

preferencialmente replicar no câncer células e têm sido utilizados em terapias do cancro. Foi anteriormente mostrado que a proteína Ad E1B55K está envolvido na indução da ciclina E durante a replicação do AD, mas esta função E1B55K não é necessário em células de cancro, em que é frequentemente observada desregulação da ciclina E. Neste estudo, investigou-se a interacção de ciclina E e CDC2 em células infectadas com Ad. Ad infecção aumentou significativamente a grande forma de ciclina E (ciclina EL), promoveu a formação do complexo ciclina E /CDK2 e aumentou a fosforilação de CDK2 no local T160. CDK2 activado causada pRb fosforilação no site do S612. A repressão da actividade de CDK2 com a roscovitina inibidor químico ou com pequenos RNAs de interferência específicos diminuiu significativamente pRb fosforilação, com a repressão concomitante de replicação viral. Os nossos resultados sugerem que induzido Ad-ciclina E activa CDK2 que tem como alvo o repressor transcricional pRb para gerar um ambiente celular para a replicação viral produtiva. Este estudo revela uma nova base molecular para a replicação oncolytic da

E1b

-deleted anúncios e vai ajudar no desenvolvimento de novas estratégias para o Ad virotherapies oncolytic

Citação:. Cheng PH, Rao XM, McMasters KM, Zhou HS (2013) base molecular para a replicação seletiva Viral em células cancerosas: Activação de CDK2 por Adenovirus Induzida ciclina E. PLoS ONE 8 (2): e57340. doi: 10.1371 /journal.pone.0057340

editor: Yi Li, Wuhan Bioengenharia Instituto, China

Recebido: 03 de outubro de 2012; Aceito: 21 de janeiro de 2013; Publicação: 20 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Cheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo NIH Grant R01 CA129975 (a HSZ https://www.nih.gov/). PHC é parcialmente suportada pela bolsa K. C. Huang, da Universidade de Louisville (https://louisville.edu/medschool/pharmacology). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adenovírus Humanos (ADS) são vírus de ADN linear de cadeia dupla que são capazes de infectar e se replicar em uma ampla variedade de tipos de células

in vitro

e

in vivo

, incluindo as células pós-mitóticas. Após a infecção, as proteínas virais iniciais interagem com fatores celulares para criar ambientes favoráveis ​​para a replicação viral [1]. O anúncio

E1 e região contém dois conjuntos de genes,

E1a

e

E1b

, que são dedicados ao controle do ciclo celular, inibição de apoptose e regulação de genes celulares e virais [ ,,,0],2]. Os anúncios com

E1

modificações que preferencialmente replicar em células cancerosas têm sido usados ​​para a terapia genética do cancro.

O viral

gene E1a

se expressa imediatamente após a infecção. O principal papel da

E1a

produtos de genes é para regular a expressão de vários genes celulares e virais [1]. Em vez de directamente a ligação a sequências de ADN específicas em elementos de regulação de transcrição, as proteínas E1A de interagir com vários reguladores-chave da proliferação de células [3], [4]. Os fatores celulares conhecidos para que as proteínas E1A ligam são produtos do retinoblastoma (

Rb

) gene e seus genes estruturalmente relacionados,

p107

e

p130

[5] , [6]. Sequestrando a proteína do retinoblastoma (pRb), E1A activa proteínas reguladoras de transcrição E2F. Estudos sugeriram que o /complexo de E2F de pRb reprime activamente a transcrição de genes alvo e medeia L

1 detenção desencadeada por p19 (ARF), p53, p16INK4a, o TGF-beta, ou o contacto da célula [7] – [9]. Recentemente Pelka

et ai.

(2011) indicaram que E1A pode ligar-se directamente a complexos de E2F /DP, interagindo com DP-1, resultando na activação da expressão do gene responsivo a E2F-independentemente da ligação a pRb [10] . Vários grupos mostraram que a expressão de

gene E1a

provoca a acumulação de proteína p53 e a apoptose dependente de p53 [11], [12], quer através da activação da transcrição de p53 ou p53 prevenção de ser degradado pelo proteassoma [11] – [14]

Ad E1B55K foi demonstrado em alguns estudos para neutralizar a estabilização induzida por E1A de p53 [11], [15].. proteínas E1B55K podem inibir as funções de p53 através de pelo menos três mecanismos distintos. E1B55K declaradamente se liga o terminal amino de p53 [16], e esta ligação pode reprimir a activação transcricional da p53, tal como sugerido em ensaios de transcrição [17] e estudos de transfecção transiente [18]. E1B55K também pode interferir com a função da p53, cooperando com a proteína E4orf6 viral para causar a degradação proteolítica da proteína p53 [19] – [21]. Um estudo recente mostrou que E1B55K só funciona como uma ligase E3 SUMO1-p53 que interage com corpos nucleares leucemia promielocítica para inactivar p53 e estimular a sua exportação nuclear [22]. Desse modo, os blocos E1B55K a expressão de genes regulados por p53 e, consequentemente, contraria a apoptose dependente de p53 induzida por E1A, permitindo a replicação viral eficiente [16], [17].

Ad

dl

1520 (ONYX-015) contém uma deleção de 827 pb e uma mutação pontual geração de um codão de paragem prematuro no E1B55K sequência de codificação, evitar a expressão do gene de [23]. Ele foi originalmente proposto que o

E1B55K

-deleted anúncios poderia replicar somente em células de tumor p53 deficiente, como a degradação E1B55K mediada de proteína p53 não era necessária nessas células cancerosas [24], [25].

E1B55K

-deleted anúncios oncolytic foram testados em ensaios clínicos humanos e estão sendo comercializados para o tratamento do câncer na China depois de aprovado pelo Estado da China Food and Drug Administration (SFDA) [26]. No entanto, a hipótese original foi contestada por vários estudos que mostram que

E1B55K

-deleted anúncios são capazes de se replicar em células independentemente do seu estatuto p53 [27] – [30]. Outros estudos têm mostrado que a acumulação de proteína p53, após a infecção com os anúncios transportando mutada in

E1B55K

genes que não são capazes de reprimir a p53, pode nem eficiente induzir a apoptose nem transcricionalmente activa a expressão de genes p53-sensível no Ad-infectados células [31], [32]. Assim, estes resultados sugerem que o bloqueio da actividade de p53 por proteína E1B55K é pouco provável que seja o principal requisito para a replicação viral. O mecanismo (s) de

E1B55K

-deleted replicação viral em células de câncer ainda não está estabelecida, mesmo que os vetores já foram aplicadas na clínica para o tratamento de câncer humano [26].

anteriormente, temos demonstrado que o Ad E1B55K está envolvido na indução de genes relacionados com o ciclo celular, incluindo ciclina e e Cdc25A [33]. Ad E1B55K medeia a grande forma de proteína ciclina E indução (EL ciclina) em células Ad-infectadas [34]. A ciclina E e a forma grande ciclina EL são gerados a partir do processamento alternativo. A tradução de ciclina EL é iniciada no codão ATG localizado uma no exão 2 e ciclina E é a partir do codão ATG no exão 3 [35]. A função E1B55K é necessária para a indução EL ciclina em células normais, mas não é necessário em células cancerosas com a ciclina E. desregulado Deixar de induzir eficientemente ciclina expressão EL nas células normais, a replicação do

E1B55K

-deleted anúncios oncolytic é restrito. No entanto,

E1B55K

-deleted anúncios oncolytic pode induzir eficientemente ciclina EL em células cancerosas e realizar a replicação oncolytic suficiente. Propusemos que a ciclina E desregulamentação em células cancerosas pode ser uma base molecular importante para a replicação oncolytic seletivo de

E1B55K

-deleted anúncios

A ciclina E regula a progressão do ciclo celular, replicação do DNA [34]. [36], [37], e duplicação centrossoma [38], [39]. A expressão de ciclina E é rigorosamente controlada nas células normais. O nível de ciclina E sobe a tarde G

1 fase, picos no G

1 /S fase para promover a entrada S-fase, e diminui posteriormente [35], [40]. A desregulação da ciclina E é frequentemente detectada em muitos tipos de cancros, tal como a amplificação do gene ciclina E [41], a sobre-expressão de ciclina E ARNm ou os níveis de proteína [42], [43], a diminuição do volume de negócios ciclina E [44], e a presença formas de mais activas de ciclina E [45] – [47]. superexpressão constitutiva da ciclina E foi mostrado para induzir instabilidade cromossômica e prejudicar a progressão do ciclo celular normal [48], [49]. A hipótese de que a expressão de ciclina E anormal pode provocar tumores também tem sido apoiado por estudos em animais transgénicos [50] – [52].

Uma função da ciclina E é para ligar e activar quinase dependente de ciclina 2 (CDK2) [53]. O complexo ciclina E /CDK2 em seguida fosforila substratos tais como pRb e conduz à activação da transcrição dos genes a jusante. Estudos também indicam que a ciclina E tem funções independentes de CDK2 [54], [55].

In vivo

estudos com animais indicam variação entre os fenótipos de ciclina E nula (ciclina E1

– /- E2

– /-) ratos e CDK2 nula (CDK2

– /-) ratos . Ratos falta CDK2 são viáveis, com o desenvolvimento normal, exceto desenvolvimento de células germinativas com defeito [56], [57]; ainda eliminatória da ciclina genes E1 e E2 em ratos provoca letalidade embrionária devido à deficiência na endoreplication de células trofoblásticas gigantes e megacariócitos [58]. Matsumoto

et al.

(2004) identificaram um domínio sinal de localização centrosomal (CLS) em ciclina E [59]. Este CLS domínio permite que a ciclina E para atingir o centrossoma e promover a entrada de fase S de uma forma independente de CDK2. Além disso, Geng

et ai.

(2007) mostraram que uma quinase mutante deficiente (DK-E) ciclina E é capaz de restaurar parcialmente a proteína de manutenção minicromossoma (MCM) entrada fase de carga e S em células nulas ciclina E [54]. Assim, a ciclina E tem dependentes de CDK2 e funções independentes na entrada de fase S e replicação do DNA. Uma questão importante é se induzida por Ad ciclina E pode ativar CDK2 e se a ciclina interação E-CDK2 pode desempenhar um papel crucial na replicação do AD. Esta questão é especialmente importante para o desenvolvimento de estratégias de viroterapia oncolíticos.

Relatamos aqui que induzida por Ad ciclina E se liga com CDK2 e activa que tem como alvo o repressor de transcrição de pRb, que por sua vez pode regular a expressão de genes celulares e virais . Os resultados sugerem que a interação entre a induzida por Ad ciclina E e CDK2 é gerar um ambiente adequado para a replicação produtiva do anúncio.

Materiais e Métodos

linhas de células e condições de cultura

HEK 293 (ATCC n. CRL-1573), fibroblastos de pulmão WI-38 (ATCC no. CCL-75), e A549 do cancro do pulmão humano (ATCC no. CCL-185), linhas de células foram adquiridos a partir da American Type Culture Colecção (Rockville, MD). As células WI-38 foram cultivadas em meio mínimo essencial (MEM) alfa GlutaMAX mM com aminoácidos não essenciais 0,1 e piruvato de sódio 1,0 mM. HEK 293 e A549 células foram cultivadas em meio essencial mínimo alfa. Todos os meios foram suplementados com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e penicilina /estreptomicina (100 U /ml). As células foram cultivadas em 5% de CO

2 incubadora a 37 ° C. Todos os reagentes de cultura de células foram obtidos da Gibco BRL (Bethesda, MD).

vectores adenovirais

de tipo selvagem adenovírus tipo 5 (Adwt, ATCC n. VR-5) foi usado como uma replicação controle -competent. AdCMV /GFP, um vector de Ad com deleção E1 transportar uma proteína fluorescente verde (GFP), foi utilizado como um controlo deficiente na replicação. Adhz63, um vector Ad oncolytic com a supressão do

E1B55K e região, foi construído por nosso laboratório [60].

infecção viral e titulação

As células foram semeadas em 6- bem placas a uma densidade de 2,5 x 10

5 (células /poço) e cultivadas sob as condições indicadas. Subsequentemente, as células foram falsamente infectadas ou infectadas com AdGFP, Adwt, ou Adhz63 a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5. citopático efeito (CPE) foi observado em pontos de tempo concebidos e fotografados com um microscópio invertido (Olympus CKX41). Total de células infectadas e os sobrenadantes de cultura foram recolhidos 48 horas após a infecção pelo (p.i.) e lisadas para libertar as partículas de vírus com três ciclos de congelação e descongelação. Os títulos virais foram determinados pelo método da unidade infecciosa como descrito anteriormente [61], [62]. Resumidamente, as células de HEK 293 foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 10

3 (células /poço) e, em seguida, infectadas com 5 vezes vírus diluídos em série. CPE foi gravado e marcou após incubação durante 7 dias. A percentagem de redução no título do vírus é calculado pela fórmula,% de redução = [(titulação de grupo de controlo – título de grupo experimental) /titulação de grupo de controlo]. × 100%

ADN viral ensaio de síntese |

Após a infecção virai, as células foram recolhidas a diferentes pontos de tempo. A síntese de ADN virai foi determinada com mancha de Southern; 1 ug de DNA genómico isolado foi digerido com a enzima de restrição

Pst I e analisado com gel de agarose a 1%, que foi subsequentemente transblotted para um Hybond-N + de membrana (YA3609; Amersham Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL) . A sonda foi preparado por digestão de 0,5 ug pBHGE3 [63] com o

Pst I e marcado, seguindo o protocolo de Amersham AlkPhos directa de etiquetagem e sistemas de detecção (RPN 3690, GE Healthcare, Piscataway, NJ). A mancha foi pré-hibridizados durante 3 horas a 63 ° C. A hibridação e restringência lavagens foram realizadas a 55 ° C e seguido pela detecção quimioluminescente de acordo com o protocolo do fabricante.

análise Western blot

As células infectadas foram colhidas nos pontos de tempo indicados e lisadas com CDK2 tampão de lise (Tris 20 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl 5 mM de

2, 0,5% de Nonidet P-40, 0,1% de Brij 35, glicerofosfato de sódio 5 mM, vanadato de sódio 1 mM, ditiotreitol 1 mM). As análises de Western blot foram realizados tal como descrito anteriormente [64]. Resumidamente, 80 ug de lisados ​​celulares foram sujeitos a electroforese através de géis de 12% SDS-poliacrilamida e transferidos para uma membrana Immobilon-P (Millipore, Billerica, MA). Os anticorpos primários utilizados neste estudo foram de coelho anti-ciclina E (H-20), CDK4 (C-22), de ratinho anti-ciclina D1 (DCS-6), PCNA (PC10), p21 (F-5), pRb (IF8) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), de ratinho anti-CDK2, p27 (BD Biosciences, San Jose, CA), pCDK2 T160 (a sinalização celular, Danvers, MA), de coelho anti-fosforilado pRb (fosfo-pRb ) S612, e actina (Sigma, St. Louis, MO), anti-fosfo-pRb S795 (New England Biolabs, Beverly, MA), e anti-fosfo-pRb T821 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Actina foi utilizado como um controlo interno. As membranas foram então incubadas com anti-ratinho de imunoglobulina G (IgG) ou anti-IgG de coelho ligados a peroxidase específicos da espécie de anticorpo inteiro (GE Healthcare, Piscataway, NJ). detecção quimioluminescente foi realizada com reagentes ECL de acordo com as recomendações do fornecedor (GE Healthcare). A intensidade da banda foi quantificada por digitalizada Gel-Pro Analyzer 4.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD) de acordo com a tutorial do fabricante. densitométrica valor para cada banda foi expressa como densidade óptica integrada (I.O.D.) e os resultados foram normalizados com a actina. Os valores finais representam as médias de variação percentual relativa, de pelo menos três experiências independentes, em comparação com o grupo simulado ± D.P. .. diferença estatística foi avaliada com o teste t de Student. Um valor de p . 0,05 foi considerado significativo

A imunoprecipitação

As células A549 foram semeadas em pratos de 150 mm a uma densidade celular de 5 x 10

6 (células /prato) e, em seguida, falsamente infectadas ou infectadas com AdGFP, Adwt, ou Adhz63 a um MOI de 5. em 48 horas pi, as células foram recolhidas e lisadas com tampão de lise de CDK2 de acordo com o método descrito em publicações anteriores [34], [65]. Os lisados ​​celulares (500 ug) foram imunoprecipitados com a ciclina E (HE111), o anticorpo monoclonal de murganho (Santa Cruz) ou anticorpo anti-CDK2 (BD Transduction Laboratories) a 4 ° C durante 4 h, seguido pela adição de proteína A-Sepharose CL 4B (82.506; Sigma) e incubando durante a noite. Os imunocomplexos foram analisados ​​por Western blot com anticorpos anti E e CDK2-ciclina.

pequeno ARN interferente (siRNA) transfecção

Os oligonucleótidos foram sintetizados por siRNA Eurogentec (Fremont, CA). Três diferentes ARNic em cadeia dupla foram desenhados para alvejar CDK2 em nucleótidos 399-419 (# 1), 619-639 (# 2), e 691-711 (# 3) de acordo com Genbank NM001798.2 adesão (Centro Nacional de Biotecnologia Informação GenBank) . Um duplex controle siRNA negativa contendo duas fitas de 19 bases de RNA complementares com saliências 3’dTdT foi obtido a partir Eurogentec (SR-CL000-005). As células foram semeadas numa placa de 6 poços a uma densidade de 10

5 (células /poço) e, em seguida, transfectadas com 200 duplexes nM CDK2 siRNA ou um duplex de ARNsi de controlo não específico com Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram colhidas 48 h após a transfecção. Oitenta? G de lisados ​​celulares foram analisados ​​por Western blot com CDK2, pCDK2 T160, pRb, pRb fosforilada (p-PRB), ciclina E, proteínas da cápside, e anticorpos de actina.

Todas as experiências acima, excepto que especificamente indicado, foram repetidos pelo menos três vezes.

Resultados

ciclina e /CDK2 complexo formado em células infectadas com adenovírus

Temos anteriormente estabelecida a ligação entre a ciclina e e replicação de adenovírus [33], [34]. Os dados mostrados na Figura 1 que o Ad recapitular E1B55K participa na indução da grande forma de proteína ciclina E (ciclina SR), o que contribui para a replicação virai eficiente. Ciclina E e ciclina EL são gerados a partir splicing alternativo com diferentes codão de início ATG em exons 2 e 3 [35]. O terminal N de ciclina induzida por vírus EL é 15 aminoácidos mais longa do que a de proteína ciclina E. proteína ciclina E é constitutivamente expressa em células de cancro do pulmão humano A549 [34]. Tipo selvagem Ad5 (Adwt), com a intacta

E1B55K e região, induzida ciclina significativa expressão EL em ambos WI-38 células de fibroblastos de pulmão humano e células cancerosas A549 humano pulmão (Fig. 1A, pistas 2 e 5 ), e o efeito citopático causado eficiente (CPE) (Fig. 1B, painéis b e e). Adhz63 vector Ad com

E1B55K

-deletion [60] também induziu ciclina EL significativa em células A549 (Fig. 1A, pista 6) e causou CPE eficiente das células (Fig. 1B, painel C). No entanto, o vector não conseguiu induzir ciclina EL sobreexpressão em células WI-38 (Fig. 1A, pista 3) e o seu efeito citopatogénico (Fig. 1B, painel F). Para comparar a replicação de Adwt e Adhz63 em A549 e células WI-38, foram determinados os títulos destes dois vírus. A replicação Adhz63 foi fortemente reprimida nas células WI-38, que mostra apenas 10% de replicação relativa em comparação com Adwt (Fig. 1C). Quando comparada com a replicação Adhz63 que de Adwt em células A549, consistente com os resultados de CPE, observou-se 80% de replicação relativa de Adhz63. Assim, a replicação é mais Adhz63 reprimida em células WI-38 do que em células A549. O resultado é consistente com nossa observação anterior que ciclina indução EL em células cancerosas está conectado com a replicação seletiva de

E1B55K

-deleted anúncios em células de câncer [34].

WI-38 ou A549 As células foram infectadas com AdGFP, Adwt ou Adhz63 a um MOI de 5. As células (a) foram recolhidos às 48 h e, em seguida, analisado por Western blot. Os lisados ​​celulares foram imunotransferidas para ciclina E e actina. Actina foi utilizado como um controlo de carga. (B) CPE foi fotografado em 72 h após a infecção (p.i.). Toda a microscopia foi originalmente com uma ampliação de x100. (C) títulos virais foram determinados às 72 horas p.i. com o método da unidade de infecção. O valor indica a média de três experiências independentes, mostrados como a variação percentual média em relação ao grupo de controlo Adwt ± S.D. * P . 0,05 comparado com o grupo Adwt, de Student

t

-test

A ciclina E pode promover a entrada de fase S e participar na replicação do DNA via dependente de CDK2 [53] e vias independentes-CDK2 [59]. Para estudar se a função ciclina E na replicação do anúncio é CDK2 dependente ou independente, procuramos primeiro a investigar o contato físico entre CDK2 e ciclina EL em células afectadas por anúncios. As células A549 câncer de pulmão foram falsamente infectadas ou infectadas com AdGFP, Adwt ou Adhz63. Para entender como

E1b

-deleted anúncios replicar seletivamente nas células cancerosas, nós nos concentramos em células de câncer de pulmão A549 em que ambos Adwt e

E1b

-deleted Adhz63 pode induzir eficientemente ciclina EL e replicar. Às 48 h pós-infecção (p.i.), as células foram recolhidas e lisadas. Nós usado pela primeira vez anticorpos E anti-ciclina para imunoprecipitar a proteína E ciclina e analisados ​​os imunocomplexos com o Western Blot. Os dados mostram que a proteína ciclina E precipitado a partir de células pseudo-tratados ou tratados com AdGFP replicação defeituosa (controlos negativos) não exibiram uma associação significativa com a proteína de CDK2 (Fig. 2A, pistas 1 e 2). No entanto, a partir de imunocomplexos e células A549 Adwt- Adhz63-infectadas continham ambos ciclina E e ciclina EL com um aumento de CDK2 de ligação (Fig. 2A, pistas 3 e 4). Para verificar esta ligação ciclina E /CDK2, nós também utilizado anticorpo anti-CDK2 para puxar para baixo o complexo de proteína e, em seguida, examinou o nível de proteínas E ciclina no complexo ciclina E-CDK2. A proteína CDK2 foi imunoprecipitada aumentada em Adwt e células Adhz63-infectadas com uma precipitação concomitante de ciclina SR (Fig. 2B, pistas 3 e 4), especialmente para células Adwt-infectadas (pista 3). Os resultados mostram que a replicação competente e Adwt Adhz63 induzir a expressão de ciclina EL e aumentar a formação de complexo ciclina EL /CDK2 em células de cancro A549, indicando que a ciclina EL induzida nas células DA-infectadas associa fortemente com CDK2.

lisados ​​de células A549 (a) foram imunoprecipitados com anticorpo anti-ciclina E (diluição 1:50). Os imunocomplexos foram analisados ​​por Western blot com anticorpos ciclina E e CDK2. (B) Os lisados ​​celulares foram imunoprecipitados com anticorpo anti-CDK2 e imunologicamente para CDK2, ciclina E e ciclina EL.

ciclina induzida por Adenovirus EL aumenta a fosforilação CDK2

CDK2 é ativado pela fosforilação no local da T160 fosforilação e esta aumenta a sua mobilidade electroforética, resultando em bandas de migração mais rápida [66]. Nós investigamos se ciclina EL indução eo aumento da interação entre ciclina EL e CDK2 em células A549 após a infecção Adwt e Adhz63 pode promover a fosforilação CDK2 no local T160 específica. A análise dos lisados ​​de células com transferência de Western demonstrou que a indução de EL ciclina levou a um aumento da CDK2 de migração mais rápida, consistente com a proteína fosforilada-CDK2 (pCDK2) T160 (a forma activa de CDK2), especialmente às 48 h p.i. (Fig. 3A, pistas 7 e 8). Verificou-se a forma mais rápida migração de CDK2 com fosfo-CDK2 anticorpo (T160) (# 2561, a sinalização celular). A análise densitométrica destas bandas demonstrou que a infecção Adwt causou uma 1,3-2,7 vezes maior (P = 0,03) no nível de pCDK2 T160 e infecção Adhz63 causou uma 1,5-1,9 vezes maior (P = 0,0026) em comparação com o mock-controle grupo de 48 h pi (Fig. 3B, pistas 3 e 4). O resultado na Figura 3B é consistente com o que na Figura 3A (pistas 7 e 8).

células A549 foram falsamente infectadas ou infectadas com AdGFP, Adwt, ou Adhz63 a um MOI de 5. As células foram recolhidas a 24 h ou 48 h pi e, em seguida, analisado por Western blot. Os lisados ​​celulares foram imunotransferidas para (A) e CDK2 ciclina E; (B) pCDK2 T160; e (C) ciclina D, PCNA e CDK4. Actina foi utilizado como um controlo de carga. A intensidade da banda foi quantificada digitalizados e os valores representam as médias das percentagens mudança relativa em comparação com o grupo simulado ± S.D. a partir de três experiências em triplicado independentes. * P . 0,05 em comparação com o grupo-controle simulada, t de Student

Além de ciclina E, ciclina D também está envolvida na transição do G

1-S fase . Assim, também examinámos o nível de ciclina D. Curiosamente, o nível de ciclina D foi diminuída após a infecção virai. A análise densitométrica das bandas demonstrou que a infecção Adwt e Adhz63 às 24 h diminuiu a proteína ciclina D com os níveis de 11% (P = 0,0000025) e 71% (P = 0,001) da infecção simulada, respectivamente (Fig. 3C, pistas 3 e 4). Os níveis de ciclina D em células infectadas com Adwt ou Adhz63 foram diminuiu ainda mais a 48 h a 3% (P = 0,00000043) e 8% (P = 0,00002), respectivamente (Fig. 3C, pistas 7 e 8). Enquanto isso, o nível de CDK4 e o antigénio nuclear de proliferação celular (PCNA) não se alterou significativamente em qualquer um dos grupos. CDK4 é regulada e activado por ciclina D para processar o G

1-S transição [67], [68]; PCNA, conhecido por regular a replicação do ADN e de reparação do ADN, está associada com vários complexos de ciclina /CDK na progressão do ciclo celular [69], [70]. Os resultados mostram que os anúncios diminuição da produção de ciclina D e não afetou os níveis de CDK4. ciclina Assim, a infecção Ad induzida especificamente EL que ativou CDK2 via fosforilação em seu local T160, sugerindo um papel crítico de ciclina EL e CDK2 na replicação do anúncio.

aumento adenovírus pRb fosforilação

A ciclina E- CDK2 fosforilada activado (pCDK2) é conhecida para controlar a G

1-S transição por fosforilação dos substratos a jusante. Considerando que pRb é um dos alvos conhecidos para pCDK2, nós examinamos se a aumento de pCDK2 activada altera a fosforilação de pRb em S612, que é um resíduo preferido CDK2-fosforilação [71], [72]. Verificou-se que o nível de fosfo-pRb S612 foi aumentada para 314% (P = 0,016) e 240% (P = 0,03) nas células infectadas com Adwt e Adhz63, respectivamente, mesmo que o nível de proteína de pRb fosforilada é diminuído ligeiramente ( Fig. 4A, pistas 3 e 4). Não foi possível detectar qualquer alteração significativa de p-PRB T821, outro resíduo fosforilação preferidos-CDK2 [71], [73] e os preferenciais-CDK4 p-PRB S795 [74] (Fig. 4A). Os resultados sugerem a selecção do local do S612 em pRb por CDK2 Ad-activado para a fosforilação de proteínas.

células A549 foram falsamente infectadas ou infectadas com AdGFP, Adwt ou Adhz63 e recolhidos às 24 h ou 48 h pi , seguido por análise Western blot. Os lisados ​​celulares foram imunotransferidas para (A) pRb, fosfo-pRb (p-PRB) em S612, T821 e S795 ou (B) de p21 e p27. Actina foi utilizado como um controlo de carga. * P 0,05 comparado com o grupo controle simulada, t de Student

Os adenovírus reprimir CDK inibidores

Também foi observado que os níveis de proteína de ambos p21 e p27 são reduzidos. em células A549 infectadas com Adwt Adhz63 e, especialmente para a p21 (Fig 4B). P21 e P27 são os inibidores de CDK conhecidos, que regulam negativamente a actividade de complexos de ciclina E /CDK2 para prevenir a progressão do ciclo celular [75]. A análise densitométrica destas bandas demonstrou que o nível de proteína p21 diminuiu para os níveis de 8% (P = 0,0000002) e 44% (P = 0,00066) do controlo simulado, em células A549 depois de infecção com Adwt e Adhz63 às 24 h, respectivamente (Fig. 4B, pistas 3 e 4). O nível de p21 foi ainda reprimido em células A549 a 48 h após a infecção com Adwt (2%, P = 0,00000034) e Adhz63 (6%, P = 0,0000007) (Fig. 4B, pistas 7 e 8). infecção ad também diminuiu os níveis de proteína p27 a 36% (Adwt, P = 0,0015) e 49% (Adhz63, P = 0,00043) a 24 h; 16% (Adwt, P = 0,00012) e 37% (Adhz63, P = 0,0092) durante 48 h em células A549 (Fig. 4B). Os resultados sugerem que os anúncios ativar a CDK2 induzindo ciclina EL e reprimindo p21 e p27.

Interrupção da ciclina EL e CDK2 interação reduz replicação adenoviral

Para investigar mais o papel de CDK2 na replicação viral , foi utilizada a roscovitina inibidor de CDK2 química (Ros; CYC202) para interromper a ciclina EL e interação CDK2. Ros é um derivado de purina, que inibe a actividade de CDK2 por se ligar ao seu local activo [76]. Ros reduz a fosforilação em CDK2 [77] e bloqueia o aumento induzido por androstenediona de CDK2 activa fosforilada [78]. Se é necessária a activação de CDK2 para a replicação viral, bloquear a actividade de CDK2 deve reduzi-la. A Figura 5A, que representa uma das quatro experiências repetidas, que mostra com maior Ros, CPE causada por infecção Adwt e Adhz63 foi parcialmente inibida. A Figura 5B mostra que o tratamento com 5 uM de ROS provocou uma redução de 50% na Adwt título (P = 0,0002) e redução de 71% em Adhz63 título (P = 0,034), quando comparado com o grupo-controlo tratado com veículo com sulfóxido de dimetilo (DMSO , definido como 0 uM ROS). O tratamento com 10 uM Ros levou a mais diminuições de títulos virais: redução de 81% em Adwt (P = 0,00001) e 87% de redução em Adhz63 (P = 0,012). Os rendimentos virais reprimidos são consistentes com o fenómeno de CPE na Figura 5A.

(A) células foram tratadas com 0 uM (grupo-controlo tratado com veículo com DMSO), 5 uM, 10 uM ou roscovitina, e mock- infectadas ou infectadas com AdGFP, Adwt ou Adhz63 a um MOI de 5. Toda a microscopia é originalmente a uma ampliação de x100 feita às 48 horas pi (B) títulos virais foram determinados 48 h após a inoculação em com o método da unidade de infecção. Os valores representam as médias ± S.D. de quadruplicado independente. * P 0,05 em comparação com o roscovitina 0 mM, Estudante de

t

-test

Em seguida, examinou os níveis de ADN e as proteínas produzidas em células afetadas pelo tratamento Ros viral.. A síntese de ADN virai foi determinada por Southern blot sondado com o genoma do Ad. O DNA Adwt linear é 36Kb com um total de 28

Pst

Eu sítios de restrição. O maior fragmento é 4333 pb e o menor fragmento é de apenas 12 pb. Os tamanhos dos fragmentos de ADN representativos foram marcados na Figura 6. A síntese de ADN virai de Adwt Adhz63 e às 24 h p.i. foi fortemente inibida na presença de 10 uM Ros (Fig. 6A, faixas 6 e 12). Consistentemente, as proteínas da cápside viral foram significativamente inibida na presença de 10 uM Ros (Fig. 6B, pistas 4 e 6). A inibição da actividade de CDK2 com Ros reduziu a fosforilação de pRb no sítio S612 em AdGFP, Adwt e células tratadas com Adhz63 (Fig. 6c). Curiosamente, o tratamento Ros marcadamente reprimidos a indução de EL proteína ciclina causada por infecção e Adwt Adhz63 (Fig. 6C, pistas 4 e 6). Em suma, estes dados mostram que a inibição da CDK2 com Ros reprimida fosforilação de pRb e replicação viral inibido.

(A) As células A549 foram coletadas em 0 h e 24 h após a inoculação a síntese de DNA viral foi determinado por transferência de Southern. Às 24 h após a inoculação, as células foram colhidas e os lisados ​​celulares foram imunotransferidas para (B) TIPO adenovírus 5 proteínas da cápside, (C) ciclina EL, P-pRb S612, e actina. Actina foi utilizado como um controlo de carga. * P . 0,05 em comparação com o 0 mM grupo tratado com roscovitina, t de Student

siRNA inibir CDK2 reprime replicação adenoviral, impedindo pRb fosforilação

Uma vez que o inibidor químico Ros pode também influenciam outras CDK e cinases [79], nós também aplicado a interferência de RNA para silenciar especificamente a expressão de CDK2.