Abstract

proteínas FOXO são importantes reguladores do metabolismo celular e são reconhecidas como nós em múltiplas vias de sinalização, principalmente as que envolvem PI3K /AKT e mTOR. proteínas FOXO funcionar principalmente como fatores de transcrição, mas estudo recente sugere que FoxO1 citosólica participa na regulação da autofagia. No presente estudo, nós achamos que FOXO1 citosólica fato estimula a autofagia celular em várias linhas celulares de cancro, e que regula não só a autofagia basal, mas também que a induzida pela rapamicina e que, em resposta à privação de nutrientes. Estes resultados ilustram a importância de FOXO1 na regulação do metabolismo celular independente da sua função de factor de transcrição. Em contraste com FOXO1, encontramos a FOXO3a estreitamente relacionada é um regulador negativo de autofagia em várias linhas celulares de cancro, uma função não reconhecida anteriormente para esta proteína, diferente da sua função em células de fibroblasto de músculo e benignos. A indução de autofagia pela knockdown de FOXO3a foi encontrado para não ser mediada através da supressão da sinalização mTORC1; em vez disso, o papel regulador do FOXO3a na autofagia estava determinado a ser através de sua capacidade de transcrição suprimir FoxO1. Esta interacção complexa de FoxO1 e FOXO3a sugere um complexo checks- e equilibra-relação entre FOXO3a e FoxO1 na regulação da autofagia celular e metabolismo

Citation:. Zhu WL, Tong H, Teh JT, Wang M (2014) forkhead box Protein O3 Fator de Transcrição negativamente Regula autofagia em células cancerosas humanas inibindo forkhead box Protein O1 Expressão e citosólica de Capitalização. PLoS ONE 9 (12): e115087. doi: 10.1371 /journal.pone.0115087

editor: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Center Ciência, China

Recebido: 17 de julho de 2014; Aceito: 18 de novembro de 2014; Publicação: 29 de dezembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Agência de Ciência, Tecnologia e Pesquisa (A * STAR) e do Conselho de Investigação Médica Nacional de Cingapura. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a autofagia é um processo celular altamente conservado, central para a resposta da célula para a nutrição /energia, bem como o status do fator de crescimento [1], [2]. Adequadamente, um dos principais reguladores a montante de autofagia é sinalização PI3K-AKT-mTOR, sensores para a estimulação do factor de crescimento, amino ácidos e os níveis de energia de células que são cruciais para o crescimento e proliferação de células [3] – [5]. Com efeito, autofagia é regulada em paralelo com o metabolismo e a proliferação celular, a formação de uma resposta integrada para os ambientes externos e internos. Por exemplo, quando os níveis de nutrientes e energia são percebidas como, a proliferação celular baixos e diminuição da atividade anabolizante, enquanto autofagia aumenta para fornecer energia e macromoléculas para funções celulares essenciais [6]. Embora a inibição da autofagia pode resultar em morte celular, a indução de actividade prolongada catabólico excessiva, tais como autofagia, também pode levar à morte da célula; Ambos estes processos podem ser explorados como novas abordagens para o tratamento do cancro [7] – [10]. Por isso, uma profunda compreensão da regulação da autofagia em diferentes contextos celulares é importante para estabelecer o potencial para manipulação terapêutica deste processo.

forkhead caixa de proteína O factores de transcrição (Foxos) são proteínas evolutivamente conservadas que ocupam nós regulamentares em múltiplos vias de sinalização importantes para a resposta celular a energia externa, nutrição, e estimulações de factor de crescimento. Como tal, eles estão envolvidos na regulação anabólica e estados catabólicos de células, e em crescimento, proliferação, e as decisões de morte celular [11] – [17]. Não é surpreendente, portanto, que a disfunção destas proteínas impactos sobre processos patológicos, como diabetes, envelhecimento e câncer [12], [16] – [19].

proteínas FOXO foram relatados para ser os reguladores de autofagia celular, um processo que está intimamente atrelada ao anabolizantes estado /catabólico da célula. Vários estudos têm sugerido que FOXO3a em particular promove a expressão de genes autophagy, levando ao aumento da autofagia [20] – [22]. Estas e outras descobertas conduziram à noção de que as proteínas FOXO em geral, são activadores de autofagia através da sua função como factores de transcrição [23], [24]. Neste ponto de vista, as funções de diferentes proteínas FOXO são considerados semelhantes e sobrepostos no que diz respeito à promoção de autofagia, com distribuição de tecidos representando o seu impacto diferencial em contextos específicos de células. Um importante objectivo da regulação de proteínas FOXO tem sido na sua localização celular, que é reversivelmente regulada por suas modificações pós-traducionais, principalmente a de fosforilação [25] – [28], e acetilação [29], [30], em resposta a estímulos ambientais. Estas modificações pós-translacionais são intimamente ligado à localização celular das proteínas FOXO e as suas interacções com efectores, e, portanto, são considerados como sendo importantes na regulação do nível de actividade destas proteínas [31], [32]. Com efeito, estudos recentes sugeriram que FOXO1 citosólica pode promover autofagia, em resposta ao stress nutricional, por interacção directa com Atg7, demonstrando as funções complicadas deste grupo de proteínas na regulação autofagia [33].

Foi recentemente relataram que FOXO3a pode promover autofagia dependente de FOXO1 no rim embrionário humano e células de fibroblastos de ratinho embrionário, que é mediada por FOXO3a-regulação da subunidade catalítica da PI3K, AKT e subsequente activação aumentada de distribuição citosólica FOXO1 [34]. Em contrapartida, verificou-se que inibe FOXO3a, em vez de melhorar, a autofagia em várias linhas celulares de cancro. Além disso, a supressão de FOXO3a autofagia parece ser mediado pela regulação negativa da transcrição de FOXO1, proporcionando uma nova visão sobre as formas e FOXO3a FOXO1 podem interagir e exercem efeitos opostos sobre autofagia celular. Essas descobertas têm revelado um papel inesperado de FOXO3a na autofagia, e destacar a complexidade da sinalização FOXO e seu impacto biológico em diferentes contextos celulares.

Materiais e Métodos

Reagentes e anticorpos

Os anticorpos que reconhecem GAPDH humana, FoxO1 (C29H4), FOXO3a (75D8), p-4EBP1 (T37 /46), p-S6 (S240 /244), Atg5, Bandeira, e histona H3 eram da Cell Signaling Technology (Danvers, MA); Os anticorpos para a LC3 (APG8A) foi de Abgent (San Diego, CA). O cocktail de inibidores de protease foi de Roche (Basileia, Suíça). Todas as linhas celulares utilizadas no estudo foram obtidas originalmente a partir da American Type Culture Collection.

Cultura celular e tratamento com drogas

As células foram mantidas a 37 ° C com 5% de CO

2 em DMEM (Invitrogen, North Andover, MA), suplementado com 10% de FBS (Hyclone, Novato, CA), 50 unidades /ml de penicilina e 50 ug /ml de estreptomicina (Invitrogen). O tratamento adicional com diferentes inibidores, tais como rapamicina (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ciclo-heximida (Sigma-Aldrich) e cloroquina (Sigma-Aldrich) foram levadas a cabo em DMEM suplementado com FBS a 10%; detalhes de cada condição de tratamento são anotados na respectiva legenda. Para o tratamento de fome diferente, as células foram cultivadas em soro livre, ou meio sem D-glucose, respectivamente.

siRNAs, primers e plasmídeos

siRNA-1 de FoxO1 (5’UUG UAC AGG UGU UUG GGU CUU CAC C-3 ‘), um siRNA de FOXO3a (5′-GAC CAA AUU ACU UCC CUG GUU AGG C-3′) e de siARN Atg5 (5’-CCA AUU GUU UGA GAU UCC UGA UGG C -3 ‘) foram adquiridos da Invitrogen; siRNA-2 de FOXO1 (5’-ACA GCA GAC UGC UCA CUA UGC AGU L-3 ‘) [35] e FOXO3a (5′-GAG CUC GUG UUG GAU CAU C-3′) [36] foi sintetizado a partir de Sigma- Aldrich. Adiante e iniciadores para a PCR em tempo real foram reversa: FOXO1, 5’-AACCTGGCATTACAGTTGGCC-3 ‘e 5′-AAATGCAGGAGGCATGACTACGT-3′; FOXO3a, 5’-CTTCAAGGATAAGGGCGACAG-3 ‘e 5′-TCGTCCTGGACTTCATCCA AC-3′; Atg4c, 5’-GCAGGAGATTGGTATGGACCAGCT-3 ‘e 5′-GGATGCCTT GCTTCTTCAACTGCT-3′; LC3, 5’-AGACCTTCAAGCAGCGCCG-3 ‘e 5′-ACACTGACAATTTCATCCCG-3′; Atg7, 5’-GATCCGGGGATTTCTTTCACG-3 ‘e 5′-CAGCAGCTTGGGTTTCTTGAT-3′; Atg12, 5’-TCTATGAGTGTTTTGGCAGTG-3 ‘e 5′-ATCACATCTGTTAAGTCTCTTGC-3′; BNIP3, 5’-GCCCGGGATGCAGGAGGAGA-3 ‘e 5′-GAGCAGCAGAGATGGAAGGAAAAC-3′; 18S, 5’-AAGTTCGACCGTCTTC TCAGC-3 ‘e 5′-GTTGATTAAGTCCCTGCCCTTTG-3’. Bandeira-FoxO1 [37] e Flag-FOXO3a [38] plasmídeos de expressão foram adquiridos de Addgene (Cambridge, MA). Bandeira-FoxO1-ΔDB (deleção dos resíduos 208-220 da FoxO1) e Bandeira-FOXO3a-3A (substituição de alanina da THR 32, Ser 253 e Ser 315 de FOXO3a) plasmídeos de expressão foram construídos utilizando QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene , Santa Clara, CA). Flag-FOXO3a (R), que é a proteína FOXO3a tipo largo codificado pelo ADNc resistente a siFoxO3a foi utilizado no estudo, foi gerado por mutação de oito siRNA-1 de FOXO3a segmentação de pares de bases no plasmídeo de tipo selvagem da Bandeira-FOXO3a usando QuikChange II site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene). Todos os plasmídeos foram verificados por sequenciação de ADN. O plasmídeo conjunto fluorescente mRFPGFP-LC3 foi um presente do Dr. Tamotsu Yoshimori [39].

transfecção com siRNA ou vectores de expressão

As transfecções foram realizadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) com base no protocolo do fabricante ; as células transfectadas foram sujeitas a tratamentos desejados durante 24-48 h após a transfecção, como descrito nas respectivas legendas das figuras.

Citosol-núcleo fraccionamento

As células recolhidas foram suspensas em tampão A frio (100 mM de Tris HCl pH 7,6, Mg 15 mM (OAc)

2, KOAc 10 mM, PMSF 10 mM, NP40 a 0,5%, 1% de mistura de inibidores de protease) e deixado em gelo durante 20 min, antes de centrifugação a 2500

g

, durante 5 min a 4 ° C. A fracção sobrenadante foi recolhido como o extracto citoplasmático. O sedimento foi lavado uma vez com o mesmo tampão antes de ser suspensa a 4 ° C em tampão de núcleos de lise (Tris-HCl 100 pH 7,6, NaCl 42 mM, EDTA 50 mM, PMSF 10 mM, SDS a 2%, cocktail de inibidores de protease 1% ). Após 10 min de incubação em gelo, a suspensão foi sonicada durante 3 min em gelo antes da centrifugação a 12.000

g

durante 15 min a 4 ° C. A fracção sobrenadante foi recolhido como o extracto nuclear.

imunotransferência e análise

células submetidas ao tratamento indicado na legenda da figura apropriada foram colhidas, lisadas, e a concentração de proteína foi determinada de acordo com o protocolo padrão. As proteínas foram separadas por SDS-PAGE, e análise de imunotransf erência foi realizada utilizando um procedimento de quimioluminescência aumentada (GE Healthcare, Piscataway, NJ). As células

imagem confocal e análise

foram fixadas com paraformaldeído a 4% , seguido de permeabilização com metanol frio. Para células foi através da rotulagem de imunofluorescência, as células fixadas, permeabilizadas foram incubadas com tampão de bloqueio (soro de cabra normal a 5%, 0,3% de Triton X-100 em PBS) durante 1 h à temperatura ambiente, seguindo-se incubação em anticorpo apropriadamente diluído em anticorpo tampão de diluição (BSA a 1%, 0,3% de Triton X-100 em PBS) durante a noite a 4 ° C. As células foram então lavadas três vezes com PBS e subsequentemente incubadas com FITC de cabra anti-coelho (1:1000) ou rodamina-cabra anticorpos secundários anti-IgG de ratinho (1:1000), conforme apropriado, em tampão de diluição de anticorpo durante 1 hora à temperatura ambiente. Todas as imagens confocais foram tiradas com uma Carl Zeiss LSM 710 microscópio confocal (Oberkochen, Alemanha). imagiologia dados foram analisados ​​pelo software Metamorph Análise (Molecular Devices Inc., Sunnyvale, CA). eficiência de co-localização de MRFP ao de sinais de fluorescência de GFP foi medida usando o software ImageJ.

PCR quantitativa ensaio

células submetidas ao siRNA knockdown ou o gene sobre-expressão protocolos foram colhidas de acordo com o protocolo padrão. O ARN total foi extraído utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. Subsequentemente, o ADNc da primeira cadeia foi sintetizado sob condições padrão com o Sistema de Síntese Superscript First-Strand (Invitrogen). PCR quantitativo foi realizado com CFX96 Real-Time System (Bio-Rad, Hercules, CA). A quantidade do transcrito foi normalizada para o nível de proteínas 18S ribosomal.

A análise dos dados

As diferenças estatísticas foram avaliadas pelo

t

teste de Student. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a p 0,05 (*) e

p Art 0,01 (**)

Resultados

FOXO3a regula negativamente a autofagia, em contraste com FoxO1. que promove autofagia

Vários relatórios têm demonstrado o envolvimento de proteínas FOXO na regulação da autofagia, mas a forma precisa deste regulamento e os papéis proteínas FOXO diferentes podem desempenhar neste processo, em especial o papel de diferentes proteínas FOXO em diferentes contexto celular, requer maior clarificação. Supressão dos níveis FoxO1 em células de cancro da próstata PC3 por siRNA knockdown inibida autofagia celular, tanto em condições basais e induzida pela rapamicina (Fig. 1A) ou de soro e privação de glicose (Fig. 1B). Dois siRNAs segmentação FoxO1 suprimida a autofagia em células PC3, avaliada por níveis LC3-II, sugerindo um efeito específico alvo deste regulamento (Fig. 1C). Estes dados são consistentes com a noção de que FOXO1 é um regulador positivo da autofagia [23], [33], [34]. Para investigar o papel de FOXO3a em células PC3, estudos semelhantes foram realizadas utilizando siRNA alvejando FOXO3a. Surpreendentemente, foi observado um efeito contrário sobre a supressão da expressão FOXO3a; siRNAs segmentação FOXO3a reforçada autofagia basal, bem como a induzida por rapamicina, medido pelos níveis LC3 lipidada (Fig. 1D). Esta redução de expressão FOXO3a reforçada autofagia induzida por soro ou inanição glucose (Fig. 1E), sugerindo um envolvimento geral da FOXO3a na regulação da autofagia em resposta a sinais nutricionais e de crescimento em células de cancro PC3. A indução de autofagia pela supressão FOXO3a foi validado com dois FOXO3a segmentação siRNAs (Fig. 1F), diminuindo a probabilidade de este ser um efeito fora do alvo. Estudos anteriores em miotubos e fibroblastos mostraram que FOXO3a desempenha um papel importante na promoção da autofagia [20], [34]; portanto, este resultado sugere papéis complexos e celulares específicas ao contexto de FOXO3a na regulação da autofagia. Parecia provável que existam diferenças distintas entre as células cancerígenas derivadas de células de fibroblastos epiteliais muscular e e no presente regulamento. Para determinar se a regulação negativa surpreendente de autofagia por FOXO3a foi limitada a células de cancro da próstata PC3, que examinou o impacto de FOXO3a silenciamento no cólon HCT116 e MDA-MB-231 linhas de células de cancro da mama. Semelhante à observação, em células PC3, knockdown de FOXO3a levou a elevação LC3-II em ambas as linhas celulares (Fig. 2A), o que demonstra essa regulação negativa da autofagia por FOXO3a não se limita a uma única linha de células de cancro.

(A) análise de imunotransferência de lisados ​​de células PC3 transfectadas com ARNsi de controlo (siLuc) ou que a segmentação FOXO1 (siFoxO1), com ou sem tratamento de rapamicina. células PC3 foram transfectadas com o ARNsi indicados durante 48 h antes do tratamento subsequente com DMSO, 20 nM ou 100 nm rapamicina (RAP) durante 24 h antes da colheita e processamento. (B) As células PC3 foram transfectadas com o ARNsi indicados durante 48 h antes da mudança de meio, após o que as células foram submetidas às condições de crescimento indicado; estas condições são DMEM na presença (normal) ou ausência de 10% de FBS (soro -), ou na ausência de D-glucose (com 10% de FBS), como indicado. As células foram colhidas 6 horas após a exposição a estas condições, e processados ​​para análise de imunotransf erência de proteínas a indicar. (C) Knockdown de FoxO1 com dois segmentação siRNAs suprime a autofagia em células PC3. (D, E, F) ilustram os procedimentos de estudo semelhantes como (A, B, C), mas com siRNAs segmentação FOXO3a em células PC3. Todas as experiências foram efectuadas três vezes com resultados semelhantes.

PC3

(A), MDA-MB-231, e células HCT116 foram transfectadas com ARNsi de controlo (siLuc) ou que a segmentação FOXO3a (siFoxO3a). Subsequentemente, estas células foram expostas ao veículo de controlo ou 50 uM de cloroquina 72 h após a transfecção, durante 3 h antes da preparação de lisados ​​de células por análise de imunotransf erência das proteínas indicadas. (B) A microscopia confocal de MDA-MB231 células estavelmente expressando conjunto fluorescente MRFP-GFP-LC3 após a transfecção por qualquer controlo ou FOXO3a siRNA. As imagens foram recolhidas 72 h após a transfecção do ARNsi indicados. (C) A análise quantitativa de imagens da experiência apresentada no painel B, utilizando software Metamorph para determinar o número médio de partículas de RFP-positiva por célula em controlo (siLuc) e células tratadas siFoxO3a. (D) Análise de co-localização de RFP e GFP do experimento descrito no painel B para avaliar a progressão autofágica. RFP e GFP co-localização indicada por Pearson Coeficientes foi analisada pelo software ImageJ. Em ambos (C) e (D), 50 células foram analisadas para cada condição. Os dados são apresentados como média ± S.E.M. ( “**”,

P

0,01), e os métodos detalhados são descritos nos Procedimentos Experimentais. células PC3 (E) foram transfectadas com ARNsi de controlo (siLuc) ou que a segmentação Atg5 (siAtg5), FOXO3a (siFoxO3a), ou combinação de ambos, como indicado. As células foram colhidas 72 h após a transfecção e os lisados ​​foram processadas para análise.

O padrão de níveis LC3-I e II-LC3 por si só não é suficiente para ilustrar o processo de autofagia real, como seja o aumento da iniciação de autofagia ou reduzida progressão da autofagia ao sistema de degradação lisossomal pode levar à elevação dos níveis de LC3-II. Para esclarecer o papel do FOXO3a neste processo, foi determinado o impacto de FOXO3a silenciamento em fluxo autofagia real usando duas abordagens. Uma abordagem envolveu o tratamento das células com cloroquina, na presença de FOXO3a knockdown, que foi realizada em todas as três linhas de células cancerosas, isto é, PC3, MDA-MB-231 e as células HCT-116. Supressão do FOXO3a resultou na acumulação de LC3-II nestas células; e a adição de cloroquina aumentou ainda mais os níveis LC3-II, sugerindo que a supressão FOXO3a aumento LC3-II através da indução autofagia (Fig. 2A). A segunda abordagem envolveu a medição da progressão da autofagossomas nas autophagolysosomes ácidas por imagem confocal. As células MDA-MB-231 que expressam de forma estável a proteína de fluorescência em tandem MRFP-GFP-LC3 foram transfectadas com FOXO3a ou ARNsi de controlo; subsequentemente, a co-localização de GFP com RFP, um indicador de fusão autophagosome-lisossoma e a degradação da proteína, foi examinado [39]. GFP fluorescência é lábil em condições ácidas; Por conseguinte, a perda de fluorescência verde que é observado como deslocalização de RFP da GFP acompanha o aumento da acidez no autofagossomas à medida que evoluem em autophagolysosomes. Neste sistema, FOXO3a silenciamento não só conduziu a um aumento de focos positivo LC3, mas também a uma redução significativa na GFP co-localização com RFP, reflectindo o estado de fluxo aumentado autofagia (Fig. 2B, 2C, 2D). Além disso, siRNA redução mediada dos níveis Atg5 inibida autofagia induzida por FOXO3a knockdown (Fig. 2E), fornecendo evidências de que supressão de FOXO3a promover a indução de autofagia em uma forma dependente Atg5. Estes dados estabelecem claramente que, enquanto FOXO1 promove autofagia como esperado, FOXO3a regula negativamente o processo nestas células cancerosas, que joga um papel oposto.

Para testar a hipótese de a FOXO3a é um regulador negativo de células de cancro em autofagia linhas, um estudo de recuperação específico para o alvo foi realizada em células PC3 pela expressão ectópica de FOXO3a (R), que codifica a mesma sequência de proteína de tipo selvagem mas FOXO3a continha mutações silenciosas tornando-a resistente à FOXO3a siARN. A análise de imunotransferência demonstraram que a expressão ectópica de FOXO3a (R) suprimiu tanto autofagia basal e induzida por autofagia FOXO3a knockdown, em comparação com a das células que expressam controlo de vector (Fig. 3A). Digno de nota, a expressão de uma forma de FOXO3a, chamado FOXO3a-3A (incapaz de ser fosforilada por AKT), que exclusivamente localizada para o núcleo [20], inibiram a autofagia tanto quanto o tipo FOXO3a selvagem que localizados tanto no núcleo e no citosol (Fig. 3B). Estes achados sugerem que FOXO3a regula negativamente a autofagia por meio de sua nuclear, provavelmente transcricional função

células PC3 (A) foram transfectadas com ARNsi de controlo ou que a segmentação FOXO3a.; cada grupo de células foi também co-transfectadas com vector de controlo de expressão ectópica ou que expressa FOXO3a (R). Os lisados ​​de células foram colhidas por imunotransferência 72 h após a transfecção. (B) As células PC3 foram transfectadas com plasmídeos de expressão diferentes 3, que são vetor-Flag controlo, Bandeira-FOXO3a ou Flag-FOXO3a-3A, respectivamente; os lisados ​​de células foram preparados 72 h após transfecção por análise de imunotransf erência das proteínas indicadas.

regulação FOXO3a de autofagia é mediada por FOXO1

Verificou-se que knockdown de FOXO3a resultou numa aumento do nível de proteína FOXO1 (Fig. 4A), levantando a possibilidade de que FOXO1 medeia o efeito de indução da supressão autofagia FOXO3a. Para investigar a relação entre FoxO1 e FOXO3a na regulação da autofagia, que simultaneamente suprimida a expressão destas duas proteínas. knockdown concomitante de FOXO1 não só inibiu autofagia basal, como esperado, mas também aboliu completamente a elevação de autofagia induzida por FOXO3a knockdown (Fig. 4A), sugerindo que FOXO1 é indispensável na indução autofagia resultante da supressão FOXO3a. A transfecção de dois diferentes ARNsi de segmentação FOXO3a ambos resultou no nível de proteína FOXO1 elevada (Fig. 4B), o que torna a possibilidade de efeitos fora do alvo dos siRNAs um cenário improvável. Consistente com o impacto sobre os níveis de proteína, a avaliação da transcrição por PCR em tempo real mostraram um aumento da expressão FoxO1 com FOXO3a knockdown (Fig. 4C), sugerindo que FOXO3a regula transcrição nível FoxO1. Além disso, o tratamento de células com ciclo-heximida concorrentemente com FOXO3a knockdown eliminado o aumento do nível de proteína FOXO1 (Fig. 4D), fornecendo mais evidências para FOXO3a regulação da expressão, estabilidade do FOXO1 não. Tomados em conjunto, estes dados suportam as conclusões de que o aumento em FOXO1 resultante do FOXO3a knockdown é provavelmente o resultado do aumento da transcrição e a síntese de FOXO1.

células PC3 (A) foram transfectadas com ARNsi de luciferase (siLuc) , FOXO1 (siFoxO1), ou FOXO3a (siFoxO3a), ou combinações, como indicado. As células foram colhidas 72 h após a transfecção, os lisados ​​celulares e processados ​​para análise de imunotransf erência das proteínas indicadas. (B) knockdown FOXO3a com dois FOXO3a segmentação siRNA para ilustrar o impacto no nível de proteína FOXO1. (C) em tempo real A análise de PCR dos níveis de ARNm e FoxO1 FOXO3a em ARNsi de controlo (cinzento) ou FOXO3a siRNA (preto) células transfectadas. As células foram colhidas e transformadas 48 h após a transfecção; 18S ARN ribossomal foi analisada como controlo de normalização. Os dados foram apresentados como a média ± S.D. ( “**”,

p Art 0,01). (D) As células PC3 foram transfectadas com ARNsi de controlo ou ARNsi FOXO3a como indicado. Após 48 horas da transfecção, as células foram tratadas com controlo de DMSO ou 10 ug /ml de ciclo-heximida, durante 24 h, como indicado, antes de serem colhidas para análise de imunotransf erência das proteínas indicadas. A relação FoxO1 /GAPDH para cada condição é tão apresentada após quantificação banda por ImageJ. (E) em tempo real A análise de PCR de nível de expressão FOXO1 endógeno em células PC3 transfectadas com plasmídeo de controlo (vector) ou que expressam FOXO3a (R); em cada grupo de células plasmídeo transfectado, quer ARNsi de controlo ou ARNsi FOXO3a foram simultaneamente introduzidos. As células são colhidas para preparação de ARN e Q-PCR, análise de 72 h após a transfecção; FoxO1 níveis de transcrição foram analisadas, conforme descrito em Procedimentos Experimentais. 18S foi usada como o controlo de normalização. Os dados foram apresentados como a média ± S.D. ( “**”,

p Art 0,01). Todos os experimentos foram realizados três vezes com resultados semelhantes.

Para investigar ainda mais o potencial regulação transcricional negativo de FoxO1 por FOXO3a, avaliamos o impacto da FOXO3a superexpressão na transcrição FoxO1 endógeno. Quando introduzido em células PC3, foi observado impacto directo de FOXO3a (R) sobre a expressão FOXO1, com ou sem concomitante de knockdown FOXO3a. O efeito inibitório de FOXO3a (R) sobre a expressão basal FOXO1 era modesto, mas significativo. Em contraste, a introdução de FOXO3a (r) quase completamente obliterado o aumento da FoxO1 transcrição induzida por FOXO3a siRNA, trazendo-o de volta para perto do nível basal (Fig. 4E). Este estudo de resgate FOXO3a fornece evidência direta para a inibição FOXO3a de FoxO1 transcrição em células PC3. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que regula negativamente FOXO3a autofagia celular através da inibição da transcrição de FOXO1, um regulador positivo do metabolismo celular e autofagia.

Elevação em FOXO1 citosólica, resultante da supressão FOXO3a, induz autofagia

é bem estabelecido que FoxO1 regula positivamente a autofagia pelo aumento da transcrição de alguns genes autofagia [23], [24]. No entanto, estudos recentes têm fornecido provas convincentes de que FoxO1 citosólica promove autofagia independente da sua actividade de regulação da transcrição [33], [34]. Este estudo até agora demonstrou que a supressão do aumento FOXO3a a transcrição e FoxO1protein nível total, que é a causa de autofagia elevada. Não está claro, porém, se esta autofagia dependente FoxO1 é principalmente devido à sua função nuclear ou citosólica. Procuramos definir esta questão usando algumas abordagens diferentes. O fraccionamento do ligado celular PC3 seguinte knockdown de FOXO3a revelou uma elevação significativa de FOXO1 citosólico, enquanto que a quantidade de FOXO1 nucleares permanecem inalterados (Fig. 5A). Este resultado sugere que o aumento resultante da supressão FOXO1 FOXO3a acumula principalmente no citosol. Nós especulamos que esta elevação predominantemente citosólica de FoxO1 era o provável culpado para a ativação da autofagia seguinte FOXO3 knockdown, de acordo com alguns relatórios recentes [33], [34]. Consistente com o estudo de fraccionamento, a quantificação de RT-PCR dos genes alvo FOXO conhecidos envolvidos na autofagia, tais como Atg4c, Atg7, LC3, Atg12, e BNIP3, não mostrou nenhum aumento significativo na expressão sobre FOXO3a knockdown embora FOXO1 foi elevada como esperado (Fig . 5B)

() células PC3 a foram transfectadas com ARNsi de luciferase (-) ou FOXO3a (siFoxO3a), como indicado, e colhidas para análise de imunotransf erência das proteínas indicadas 72 h após a transfecção.; ver Procedimentos Experimentais para obter detalhes. Histona H3 e GAPDH foram utilizados como controlo de carga para as proteínas nucleares e citosólicos, respectivamente. As relações de quantidades banda, FoxO1 /GAPDH e FoxO1 /histona H3, para cada condição foram obtidos utilizando ImageJ. (B) análise por PCR em tempo real para os níveis de expressão relativa das indicadas relacionadas com genes autophagy 48 h após a transfecção de células PC3 com ARNsi de controlo (preto) ou dois diferentes ARNsi de segmentação FOXO3a (cinzento claro e escuro, respectivamente). Os dados foram apresentados como a média ± S.D. (C, D) sobre-expressão de uma função de transcrição forma inativa /citosólica de FoxO1, FoxO1-ΔDB, aumenta a autofagia. As quantidades de vesícula LC3 positiva de ambos PC3 (painel C) e as células H1299 (painel D) foram comparados na mesma análise entre Flag-FOXO1-ΔDB sobre-expressando células e células un-transfectadas. FITC e rodamina etiquetado anticorpos secundários foram utilizados para a detecção de anticorpos anti-LC3 ou anti-Flag tag, respectivamente. O nível autofagia em cada população de células foi quantificada utilizando o software Metamorph; os dados foram representados graficamente no lado direito de cada painel. foram analisadas 50 células para cada condição. Os dados foram apresentados como a média ± S.E.M. ( “**”,

p Art 0,01).

Para avaliar diretamente o impacto da FoxO1 citosólico na autofagia em células de cancro PC3, nós introduzida em células num vector de expressão que contêm Flag-tagged FOXO1 modificado para ter uma mutação de ligação ao ADN defeituosa, FOXO1-ΔDB [33]. O FOXO1-ΔDB assim expressa é não-funcional, tal como um factor de transcrição e, curiosamente, quase exclusivamente localizada no citosol. Em ambas as células PC3 (Fig. 5C) e H1299 células (Fig. 5D), proteína Flag-FoxO1-ΔDB foi localizada exclusivamente para o citosol como esperado [33] e Flag-FoxO1-ΔDB expressando células (vermelho) tinham nível claramente mais elevado de autofagossomas do que a de células não-transfectadas. A análise da imagem mostrou aumento estatisticamente significativo da autophagosome em células que expressam FOXO1 cytosolically localizada. Estes dados fornecem evidência direta para apoiar a noção de que a acumulação citosólica de FoxO1 nestas células cancerosas, de fato promove autofagia, independente da sua função nuclear.

indução citosólico FoxO1 mediada da autofagia é independente da supressão da atividade mTORC1

mTORC1 é um sensor bem reconhecido para a nutrição e o factor de crescimento de sinalização; inibe a autofagia em resposta à sinalização de crescimento. Assim, examinamos a actividade de sinalização mTORC1 quando a expressão ou FOXO1 FOXO3a é suprimida com siARN. FOXO3a knockdown levou a uma elevação significativa da autofagia como visto acima; alterações não significativas no padrão de fosfo-4EBP1 e fosfo-S6 foram observados em células com knockdown FOXO3a enquanto autofagia foi marcadamente induzidos (Fig. 6A, DMSO), sugerindo que a elevação de autofagia induzida por FOXO3a knockdown provavelmente não era através da inibição da mTORC1 . Digno de nota, FoxO1 knockdown mediado baixo regulação da autofagia foi acompanhada por uma inibição da sinalização mTORC1, com base em ambos os padrões de fosfo-S6 (Fig. 6B, DMSO) fosfo-4EBP1 e, que também apoiou a noção de que a regulação FOXO da autofagia era não mediada através da sinalização mTORC1 clássico neste caso.

(a) as células PC3 foram transfectadas com ARNsi de segmentação FOXO3a como indicado. Após 48 horas da transfecção, as células foram submetidas a tratamento de rapamicina durante 24 h antes do processamento para a análise de imunomarcação de proteínas indicadas. (B) As células PC3 foram submetidos ao estudo semelhante ao descrito em (A), excepto siRNA alvejando FOXO1 foi utilizado tal como indicado. Todos os experimentos foram realizados três vezes com resultados semelhantes.

Para melhor avaliar a interação entre a sinalização mTOR e autofagia FOXO-regulada, combinamos quer FOXO3a ou FoxO1 knockdown com o tratamento rapamicina em células PC3.