Abstract

A planta luteolina flavonóide apresenta diferentes efeitos biológicos, incluindo propriedades anticancerígenas. Pouco se sabe sobre os mecanismos moleculares subjacentes suas ações no cancro colorectal (CRC). Aqui nós investigamos os efeitos da luteolina em células cancerígenas do cólon, com foco no equilíbrio entre ceramida e esfingosina-1-fosfato (S1P), dois mediadores esfing�de com funções opostas sobre destino celular. Usando células de cultura, verificou-se que concentrações fisiológicas de luteolina induzir a elevação de ceramida, seguido de morte apoptótica de células de cancro do cólon, mas não diferenciadas dos enterócitos. estudos de pulso revelou que a luteolina inibe ceramida anabolismo de esfingolípidos complexos. Experiências adicionais levaram-nos a demonstrar que a luteolina induz uma alteração do retículo endoplasmático (ER) -Golgi fluxo de ceramida, fundamental para a sua transformação metabólica de esfingolípidos complexos. Nós relatamos que luteolina exerce a sua acção através da inibição tanto ativação da Akt, e esfingosina quinase (SPHK) 2, com a consequente redução de S1P, um estimulador Akt. administração S1P protegido células cancerígenas do cólon a partir apoptose induzida por luteolina, muito provavelmente através de um mecanismo intracelular, independente do receptor. Em geral, este estudo revela pela primeira vez que a luteolina flavonóides na dieta exerce efeitos tóxicos sobre as células cancerígenas do cólon inibindo tanto S1P biossíntese e tráfego de ceramida, sugerindo sua dieta introdução /suplementação como uma estratégia potencial para melhorar os tratamentos existentes no CRC.

Citation: Abdel Hadi L, Di Vito C, Marfia G, Ferraretto A, Tringali C, Viani P, et al. (2015) esfingosina quinase 2 e Transportes ceramida como objectivos-chave do Natural flavonóides Luteolin para induzir a apoptose em células de cancro do cólon. PLoS ONE 10 (11): e0143384. doi: 10.1371 /journal.pone.0143384

editor: Ashley Cowart, Medical University of South Carolina, United States |

Recebido: 15 de julho de 2015; Aceito: 04 de novembro de 2015; Publicação: 18 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Abdel Hadi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

CRC é um dos neoplasia mais comum e uma das principais causas de morte no mundo. Esse tipo de câncer foi reconhecido como, e continua a ser, um câncer do meio ambiente, sua incidência ser aumentou em paralelo com o desenvolvimento econômico, com a maioria dos casos que ocorrem nos países industrializados, e, principalmente atribuível à dieta [1, 2]. Numerosos estudos ligaram consumo abundante de alimentos de origem vegetal com a diminuição do risco de desenvolver diferentes tipos de cancro, um efeito quimio-preventivo que está relacionado com o elevado conteúdo de vários fitoquímicos com propriedades anti-cancro potentes [3], incluindo os compostos da família dos flavonóides [4 , 5]. Um dos componentes mais comum desta família é luteolina (3 ‘, 4’, 5,7-tetrahydroxyflavone), que está presente em níveis elevados em frutas comuns e vegetais, ervas, e exibe um amplo espectro de efeitos, incluindo actividades anticancro [6, 7]. Luteolina propriedades anti-cancerígenas expandir longo de uma vasta gama de doenças malignas e estão associados a vários efeitos, tais como a inibição da proliferação celular, angiogénese, metástases, indução de apoptose, e sensibilização à quimioterapia [6, 7]. Não obstante, os mecanismos moleculares subjacentes acções luteolina, e particularmente aqueles relacionados com o seu potencial quimioterapêutico, permanecem em grande parte claro.

em células de tumor diferentes, ceramida, o intermediário chave do metabolismo dos esfingolípidos, tem sido mostrado que actua como mediador celular de vários compostos anti-cancerígenos, sendo capaz de regular a diferentes vias de sinalização, e que conduz a paragem do ciclo celular e apoptose [8, 9]. Várias enzimas em diferentes localizações subcelulares estão envolvidos no controlo do nível de ceramida [10]. Os efeitos pró-apoptóticos e de supressão de tumor de ceramida são antagonizados por S1P, um factor pró-mitogénica e sobrevivência para uma variedade de tipos de células [11-13]. metabolismo S1P está diretamente ligado ao de ceramida, a sua esfingosina biossíntese exigindo, derivado da hidrólise ceramida e SphKs (isoforma SphK1 ou SphK2). exposições S1P ambas as ações intracelulares e extracelulares, principalmente através de activação de pró-mitogênica e sinalização pró-sobrevivência [11, 14]. A regulação adequada do rheostat esfingolípidos, que é o equilíbrio entre S1P e ceramida, é essencial para a homeostase celular, e desempenha um papel fundamental na regulação propriedades celulares e destino [11, 13].

níveis de ceramida ter sido relatado para ser significativamente reduzida em CRC, quando comparado com o tecido normal do cólon [15], e vários agentes quimioterapêuticos foram encontrados a ter impacto sobre o metabolismo da ceramida e promover a sua acumulação nas células de cancro do cólon (revisto em [16]). Além disso, S1P estimula o crescimento, invasão e sobrevivência das células tumorais de cólon [17, 18], e SphK1 e S1P liase são para cima e para baixo-regulado, levando ao acúmulo S1P no CRC [19, 20]. Essas evidências sugerem que o desequilíbrio da rheostat esfingolipídios favorecer CRC.

Apesar luteolina parece promissora como quimioterápico em algumas células [7] câncer, pouco se sabe sobre o papel do rheostat esfingolipídios em suas ações, e particularmente no CRC. O presente estudo foi desenhado para investigar o papel potencial de ambos ceramida e S1P na citotoxicidade luteolina no CRC. Usando células Caco-2 humanas como modelo de CRC, o nosso estudo revela pela primeira vez que o reostato esfingolipídios como alvo de efeitos citotóxicos luteolina.

Materiais e Métodos

Materiais

Todos os reagentes foram de mais alto grau analítico disponível. Mínimo de Eagle Essential Médium (EMEM), brefeldina A (BFA), livre de ácido gordo-BSA (FFA-BSA), N-acetil-D-eritro-esf ingosina (C2-Cer), N-hexanoil-D-eritro-esf ingosina ( C6-Cer), O-triciclo [5.2.1.02,6] dec-9-il ditiocarbonato de potássio sal (D609), Hoechst 33342, luteolina, toxina da tosse convulsa (PTX), e produtos químicos comuns foram de Sigma Aldrich (St. Louis, MO, EUA). S1P foi comprado de Enzo Life Sciences (Farmingdale, Nova Iorque, EUA), e enjaulado S1P de Alexis Biochemicals (Plymouth Meeting, PA, EUA). Alto desempenho TLC (HPTLC) placas de silica gel e todos os solventes foram da Merck (Darmstadt, Alemanha). soro fetal de vitelo (FCS) foi de Euroclone (Milão, Itália). LY294002, SEW2871, e W123 eram de Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, EUA), e N- (4,4-difluoro-5,7-dimetil-4-bora-3a, 4a-diaza

s

-indaceno-3-pentanoil) -sphingosine (BODIPY-C

5-Cer) a partir de Life Technologies (Monza, Itália).

3H-serina (30 Ci /mmol),

3H-D-eritro-esfingosina (

3H-Sph) (20,0 Ci /mmol) e D-eritro- [4,5-

3H] dihydrosphingosine (60,0 Ci /mmol) era da PerkinElmer Life Sciences (Boston, MA, EUA) e American Radiolabeled Chemicals, Inc. (St Louis, MO, EUA).

cultura celular

a linha de células de carcinoma do cólon humano Caco-2 (BS TCL 87) foi obtido a partir do Instituto Zooprofilatico Sperimentale della Lombardia e dell’Emilia Romagna (Brescia, Itália), e mantidas em EMEM suplementado com 15% de FCS, 2 mM L- glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 ug /ml de estreptomicina, 100 U /mL de penicilina, e 0,25 ug /mL de anfotericina-B a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. células Caco-2 foram semeadas em 1,25 × 10

4 /cm

2, e usado tanto como de cólon modelo de células de câncer (células CC) (na confluência, 3 dias após o plaqueamento), ou enterócitos diferenciadas (DES) ( 21 dias após a confluência) [21]. diferenciação intestinal foi confirmada por avaliar características morfológicas específicas e marcadores bioquímicos conforme relatado anteriormente [21]

tratamentos com células

As soluções de reserva das moléculas administrados foram preparadas dissolvendo-os da seguinte forma:. luteolina, SEW2871 , W123, e enjaulado S1P em DMSO, C2-Cer e BFA em etanol absoluto, C6-Cer como complexo 1: 1 com FFA-BSA, e S1P em FFA-BSA (4 mg /ml em PBS). Na altura das experiências, as soluções de estoque foram diluídas em meio fresco para a concentração apropriada e administrado às células. Em experiências paralelas, as células foram incubadas com veículos diluídas como controlo. Todos os solventes, nas concentrações finais utilizadas, foram encontrados sem efeito sobre o metabolismo dos esfingolípidos, quer ou sobrevivência celular. Quando utilizado, W123 e PTX foram administrados 1 h antes de e durante os tratamentos. Para a geração de S1P intracelular, as células foram carregadas com CC S1P enjaulado (em EMEM contendo 1 mg /mL FFA-BSA) a 37 ° C durante 2 h. O meio foi então removido, e fotólise foi realizada através de um pulso de 30 s de UV a 360 nm com a intensidade máxima.

Determinação da viabilidade celular e a apoptose

A viabilidade celular foi determinada pelo MTT ensaio. Resumidamente, após o tratamento por um período de tempo indicado, o meio foi substituído por MTT dissolvido em meio fresco (0,8 mg /ml) durante 4 horas. Os cristais de forma zan foi então solubilizado em isopropanol /ácido fórmico (95: 5 v /v) durante 10 minutos e a absorvância (570 nm) foi medida utilizando um leitor de microplacas (Wallack Multilabel Counter, Perkin Elmer, Boston, MA, EUA).

Para avaliar a apoptose, a coloração Hoechst e análise de caspase 3 clivada foram realizadas. Em particular, as células cultivadas em lamelas de vidro foram marcadas com 10 uM de corante Hoechst 33342 durante 15 min a 37 ° C, no escuro. Após lavagem com PBS, as células foram fixadas com glutaraldeído a 0,5% em PBS (10 min, 4 ° C). A morfologia nuclear foi examinada por um microscópio de fluorescência (Olympus BX-50), equipado com uma câmera rápida de alta resolução CCD (ColorView 12) e um software de análise de imagem (Análise de suave Imaging System GmbH). Caspase 3-clivagem foi avaliada por western blot (ver abaixo).

quantificação de ceramida e metabólicas estudos

A fim de avaliar o conteúdo ceramida e metabolismo dos esfingolípidos, esfingolipídeos celulares foram marcadas com 25 nM

3H-Sphl (0,5 uCi /ml) ou 200 nM de L-

3H-serina (6,0 uCi /ml) tal como anteriormente relatado [22, 23], para diferentes tempos. Em particular, para a quantificação de ceramida, foi realizado um 6 h de pulso seguido por um 24 h perseguição, uma condição que justifique uma marcação metabólica steady-state. Para os estudos do metabolismo, as experiências foram realizadas de impulsos durante 1-2 h. No final do tempo de pulso /ranhura, o meio foi cuidadosamente recolhido, as células foram raspadas da placa e esfingolípidos e S1P foram extraídos e parcialmente purificada como previamente descrito [22, 24]. Após a contagem para a radioactividade por cintilação líquida, as fases orgânica e aquosa final foram submetidos a HPTLC, utilizando clorofórmio /metanol /água 55: 20: (. Em vol) 3 e no n-butanol /ácido acético /água 3: 1: 1 (em vol.) para a separação dos complexos esfingolípidos e SLP, respectivamente. placas de HPTLC foram então submetidos a auto-radiografia digital com Beta-Imager 2000 instrumento (Biospace, Paris, FR). A radioactividade associada com lípidos individuais foi determinado com o software M3-Vision fornecido com o instrumento.

3H-esfingolípidos foram identificados por co-migração com padrões internos cromatografados na mesma placa. teor de ceramida foi determinada calculando o estado estacionário

3H-ceramida /

relação de 3H-esf ingomielina, e multiplicando-o por conteúdo esfingomielina endógena (22, 23). níveis de ceramida Similares (diferentes para menos de 12%) foram obtidos após a marcação de células em equilíbrio com

3H-Sph e

3H-serina.

degradação 3H-S1P foi avaliada como tritiada água por destilação fraccionada da fase aquosa a partir do meio de cultura, e medição da radioactividade por cintilação em líquido [22]. experimentos de controle com adição

3H

2O mostrou que há perda de trítio por evaporação ocorreu sob as condições experimentais utilizadas.

localização intracelular de ceramida fluorescente

O transporte ER-Golgi de ceramida foi avaliado qualitativamente com BODIPY-C

5-Cer como relatado anteriormente [25]. Resumidamente, células cultivadas em lamelas de vidro foram carregadas com 2,5 uM BODIPY-C

5-Cer durante 30 min, a 4 ° C, e, em seguida, incubadas em meio condicionado (30 min a 37 ° C), na ausência ou na presença de luteolina. Os espécimes foram então fixadas com glutaraldeído, e analisadas por microscopia de fluorescência (ver acima).

actividade de SPHK

As células foram colhidas em tampão de SPHK (Tris-HCl a 20, pH 7,4 contendo 40 mM β-glicerofosfato, 1 mM de EDTA, deoxypyridoxine 0,5 mM, NaF 15 mM, 1 mM β-mercaptoetanol, de Na 1 mM de

3VO

4, PMSF 0,4 mM, glicerol a 10%, e inibidores de protease completos), e interrompido por congelamento-descongelamento. Quantidades iguais de proteínas [26] foram ensaiadas quanto à actividade SPHK, utilizando as condições experimentais conhecidos para favorecer selectivamente SphK1 ou actividade SphK2 [27, 28]. A mistura foi incubada a 37 ° C durante 15-30 min. A reacção foi terminada pela adição de clorofórmio /metanol (2:. 1, em vol), seguida de dupla compartimentação, primeiro em meio alcalino e, em seguida, em condições ácidas. S1P na fase orgânica final foi resolvido por HPTLC, e quantificadas por autor radiografia digital. Os valores de fundo foram determinados em controlos negativos, em que o ATP não foi adicionado à mistura de reacção.

Western blotting

As células foram lisadas (20 min a 4 ° C) em solução salina tamponada com Tris (20 Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM) contendo, 1% de Nonidet P-40, NaF 10 mM, Na 1 mM de

3VO

4, pirofosfato de sódio 10 mM, PMSF 1 mM, e inibidores de protease. Após centrifugação, os sobrenadantes foram ensaiados quanto a proteínas [26], e uma quantidade igual de proteínas (15-30 ug) foram submetidas a SDS-PAGE em gel de poliacrilamida a 10%. Após transferência para membranas de nitrocelulose, as amostras foram incubadas (durante a noite, 4 ° C) com os seguintes anticorpos: anti-SphK1 e anti-SphK2 (Abcam, Cambridge, UK), anti-fosfo-Akt, anticorpo anti-caspase-3 (celular Signaling Technology, Inc., Danvers, MA), e, em seguida, com um anticorpo anti-conjugado com HRP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). -Anti-β actina (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) e anti-GAPDH anticorpos (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) foram utilizados como controlo de carga. sinais imunorreactivas foram visualizadas por Supersignal Oeste Femto (Thermo Scientific (Rockford, IL), e exposição a filme Kodak Biomax (Rochester, NY) imunorreactiva densidade da banda foi determinada com um densitómetro (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA;. Quantity One Software ).

a análise estatística

Os dados são expressos como média ± SD de pelo menos três experiências independentes em duplicado. Os dados foram analisados ​​usando o software StatMate, versão 4.0 (GraphPad). a análise estatística foi realizada usando o Student

t

-test as diferenças foram consideradas estatisticamente significativas a

p Art .. 0,05

Resultados

Luteolin induz a apoptose em células CC

o primeiro avaliou o efeito de luteolina em DES e a viabilidade celular CC. Como mostrado na Fig 1A, até 100 luteolina uM exerce nenhum efeito tóxico evidente em DES, e até mesmo na concentração mais elevada (200 uM), uma modesta , se for o caso, foi observado um efeito citotóxico. ao contrário, na mesma gama de concentração, luteolina induziu uma redução dose-dependente da viabilidade celular CC (Figura 1A). Em concentrações luteolina maior do que 20 uM, alterações na morfologia da célula CC característico de células apoptóticas, incluindo encolhimento e extensa separação do substrato de cultura, foram observados (não mostrado). Após 24 horas de tratamento com doses citotóxicos de luteolina, fluorescência microscópica análises com Hoechst 33342 revelaram que as células CC apresentou alterações morfológicas apoptóticos, com condensação e fragmentação dos núcleos, e exibiu fluorescência azul brilhante (Fig 1B, à direita). Por outro lado, nas mesmas condições, des foram encontrados com aparência normal, e o corante fluorescente núcleos corados morfologicamente normais, com uma fluorescência azul fracamente (Fig 1B, esquerda). Além disso, a imunocoloração de caspase-3 revelou que a luteolina induzida activação pró-caspase-3 em células de CC, mas não em DES (Figura 1C).

(A) As células CC (CC) e Des foram tratados com diferentes concentrações de luteolina, e após 48 h a viabilidade celular foi ensaiada por MTT. Os dados são a média ± DP de três experiências independentes; *, P 0,05 e **, P 0,01 controle vs.. (B) imagens microscópicas representativos de DES e CCs corados com Hoechst 33342 após o tratamento com 100 luteolina mM durante 36 horas. (C) Análise Western blot da caspase-3 níveis intracelulares ativos de DES e CCs Pro-caspase-3 e tratadas ou não com 100 M luteolina durante 36 horas.

A acumulação de ceramida está envolvido em luteolina induzida por apoptose

nas condições experimentais utilizadas, o nível basal de ceramida foi significativamente menor em células CC do que em DEs (2,45 ± 0,38 e 4,73 ± 0,59 nmol /mg de proteína, respectivamente). Após 24 h de tratamento com doses citotóxicas de luteolina, verificou-se que o nível de ceramida de células CC foi significativamente aumentada (mais de 3 vezes) por luteolina no tóxico, mas não as doses sub-tóxicos (Fig 2A). O aumento induzido por ceramida luteolina foi mensurável nas células CC antes de alterações morfológicas nucleares e evidentes. Nas mesmas condições de tratamento luteolina, não houve variação significativa no teor de ceramida foi observada em DES (Figura 2A). Estes resultados levaram-nos a investigar os mecanismos subjacentes aumento ceramida induzida por luteolina, concentrando-se em células CC.

células des e CC (A) foram tratados com luteolina e, após 24 h, ceramida celular foi quantificada. células CC (C) (B) e foram tratadas com diferentes concentrações de C2-Cer (B, quadrado), C6-Cer (B, triângulo) ou D609 (C), e após 48 h a viabilidade celular foi avaliada por MTT. Todos os dados são a média ± S.D. de três experiências independentes. *, P 0,05; **, P 0,01 vs controlo.

A exposição de células de CC a doses crescentes de C2-permeável célula e C6-Cer resultou num efeito citotóxico dependente da dose (Fig 2B). A potência destes análogos de ceramida para induzir a morte celular CC foi inversamente relacionada com o seu comprimento da sua cadeia de acilo, como seria de esperar com base na sua permeabilidade celular. Além disso, o tratamento de células com D609, um inibidor da sintase de esfingomielina [29], induziu um efeito citotóxico também (figura 2C). tratamento D609 (0,5 mM durante 24 h), induziu um aumento significativo (1,94 vezes, p 0,01) de ceramida (a partir de 2,45 ± 0,38-4,76 ± 0,59), indicando que este tratamento foi eficaz na elevação de ceramida intracelular. células tratadas com CC ou ceramidas D609 mostraram condensação da cromatina e a activação de caspase-3 (não mostrado), indicando um aumento induzido da ceramida celular foi capaz de imitar luteolina na indução de apoptose.

luteolina inibe o metabolismo de ceramida para esfingolípidos complexos

Para investigar o mecanismo subjacente à acumulação de ceramida induzida por luteolina, que, em seguida, realizou experimentos de pulso com esfingosina rotulados. Descobrimos que

3H-Sph foi rapidamente incorporada em células CC, independentemente do tratamento luteolina. Na verdade, radioactividade total incorporada foram responsáveis ​​por 373 ± 20 e 385 ± 25 nCi /prato em células CC tratados com luteolina controle e, respectivamente. Em ambos os casos, após uma hora de pulso, o nível intracelular de

3H-Sph representou menos do que 5% do total de radioactividade incorporada (não mostrado), indicando um metabolismo esfingosina eficiente ocorreu em células de CC, e não foi afectada por luteolina. A maior parte da radioactividade incorporada estava associado a derivados da esfingosina N-acilados, representado, principalmente, por ceramida e esf ingomielina, e, em quantidades muito mais baixas, por glicoesfingolípidos. tratamento luteolina aumentou significativamente a quantidade de radioactividade incorporada em metabólitos N-acilados (213,7 ± 17,3 e 282,4 ± 24,9 nCi /prato, no controle e células tratadas com luteolina), e modificou a sua distribuição entre os diferentes metabólitos esfingosina. De facto, em células tratadas com luteolina, ceramida radiomarcado foi encontrado mais de duas vezes superior à das células de controlo (Fig 3A, painel superior), e foi acompanhada por uma redução significativa dos esfingolípidos complexos, incluindo tanto esfingomielina e glicoesfingolípidos (Fig 3A , painel superior). Foram obtidos resultados semelhantes em experiências de pulso com serina marcado, utilizado como precursor da síntese de novo de esfingolípidos (Figura 3A, painel inferior). No seu conjunto, estas variações resultou num aumento significativo da proporção dos esfingolípidos ceramida /complexo nas células tratadas com luteolina comparação para controlar os (mais do que 10 e sete vezes após

3H-Sphl e

3H-serina pulso, respectivamente, p . 0.001)

() células CC a foram pulsadas com 25 nM

3H-Sph (painel superior) ou 200 nM

3H-serina (painel inferior) em a ausência (barra branca) ou presença (barra cinzenta) de luteolina 100 uM durante 2 h. No final do conteúdo da ceramida radiomarcado celular (Cer), esfingomielina (SM) e glicoesfingolípidos (GSL) foi medida. **, P 0,01. (B) As células foram incubadas CC na ausência (CT) ou a presença de luteolina (LU), em seguida, com BODIPY-C

5-Cer e analisadas por microscopia de fluorescência (barra, 10 uM). (C) As células CC foram incubados sem (A) ou com (b), BFA (1 ug /ml) durante 30 minutos, e, em seguida, pulsadas com

3H-Sphl ou

3H-serina com luteolina (100 uM) durante 2 h. A proporção dos esfingolípidos ceramida /complexo é relatado. Os dados são a média ± S.D. de duas experiências independentes. **, P 0,01.

Depois de um 2 h de pulso com L-

3H-serina, controle e células tratadas com luteolina incorporadas quantidades semelhantes de radioatividade no esfingolipídeos totais (22,3 ± 2,7 e 24,9 ± 3,0 nCi /prato). Nas condições experimentais utilizadas,

3H-ceramida representado a principal esfingolípidos marcado, e foi significativamente aumentado nas células tratadas com luteolina (Figura 3A, painel inferior). Tal como no caso de

pulso 3H-Sphl, elevação de ceramida foi acompanhada por uma redução significativa de ambos esfingomielina e glicoesfingolípidos (Figura 3A, painel inferior).

luteolina prejudica o tráfego ER-Golgi de ceramida

sobre as bases dos resultados acima, era de grande interesse para investigar se a redução do metabolismo de ceramida para esfingolípidos complexos é devido a alterações no seu transporte do RE para o aparelho de Golgi. Para este fim, primeiro estudado o efeito de luteolina sobre o transporte intracelular de BODIPY-C

5-Cer, um análogo de ceramida fluorescente capaz de imitar o tráfego ER-Golgi de ceramida natural em células vivas [30]. Após a marcação das células de controlo com BODIPY-C

5-Cer, vesículas intracelulares altamente fluorescentes acumuladas em estruturas perinucleares compactos, representativo do aparelho de Golgi (Fig 3B, esquerda), indicando a saída normal de ceramida a partir da ER. Em contraste, em células tratadas com luteolina uma fluorescência em toda a propagação das células com um padrão reticular difusa, e acompanhada por uma redução da fluorescência perinuclear foi evidente (Fig 3B, direita). Estas variações, em conjunto com os resultados do estudo de pulso, são consistentes com a hipótese de que as doses citotóxicas de luteolina prejudicar o transporte de ceramida a partir do RE para o Golgi. Para substanciar isso, nós investigamos o efeito de BFA, o que perturba o Golgi, induzindo a sua fusão com o ER [31], na diminuição induzida pelo luteolina metabolismo de ceramida. Descobrimos que o BFA reduziu significativamente a acumulação de ceramida induzida por luteolina, e esta foi acompanhada pela elevação de ambos esfingomielina e glicosilceramida. Como consequência, na presença de BFA, a elevação induzida por luteolina do rácio de ceramida /esfingolípidos complexos foi marcadamente reduzida (Figura 3C).

Akt está envolvida na disfunção induzida por ceramida luteolina de tráfego

como a activação da serina-treonina quinase Akt (proteína-quinase B) é crucialmente envolvidas na sinalização de sobrevivência em vários tipos de células [32], que em seguida investigado se Akt está envolvida na toxicidade luteolina. Nós descobrimos que o tratamento luteolina causou uma redução dose-dependente de Akt fosforilada em células CC (Figura 4A). Além disso, o LY294002, um inibidor específico da via PI3K /Akt, foi capaz de mimetizar os efeitos sobre o metabolismo de ceramida luteolina, através do aumento de ceramida e reduzindo esfingolípidos complexos (Figura 4B).

CC (A) foram tratados com 50 e 100 uM de luteolina durante 2 h e submetida a imunotransf erência com anticorpos anti-pAKT. p-actina foi utilizado como controlo de carga. (B) As células foram submetidas a pulsar com

3H-Sphl na ausência (CT) ou a presença de LY294002, durante 2 h. Os níveis de ceramida (Cer), esfingomielina (SM) e glicoesfingolípidos (GSL) são apresentados como média ± S.D. de, pelo menos, três experiências independentes. **, P 0,01 vs células CT.

Luteolin desequilibra o reostato esfingolipídios inibindo SphK2

As análises dos metabólitos 1-fosforilação de

3H-Sph (incluindo

3H- S1P e

3H-água, o seu produto de degradação) revelaram que tanto S1P- e a radioactividade associada à água foram significativamente reduzidos em luteolina (Figura 5A e 5B). A constatação de que a luteolina induziu uma diminuição de ambos S1P e seu produto de degradação nos levou a avaliar o possível efeito de concentrações citotóxicas de luteolina na expressão e atividade SPHK. Western blot não revelou diferenças significativas na expressão de ambos SphK1 e proteínas SphK2 (Fig 5C). De interesse, descobrimos que 50-100 mM luteolina inibiu significativamente a atividade SphK2 de uma forma dependente da dose, mas foram ineficazes na SphK1 (Fig 5D).

(A) e (B) células CC foram pulsadas com

3H-Sph durante 2 h na ausência (barra a branco) ou na presença de 100 uM de luteolina (barra cinza). No final, a S1P marcado (A) e água (B) foram avaliadas em células e meio, respectivamente. (C) As células foram tratadas com CC luteolina 50-100 uM durante 2 horas, e quantidades iguais de proteínas foram então analisadas quanto a proteínas e SphK1 SphK2 por imunotransferência. GAPDH foi usada como controlo de carga. actividades (D) e SphK1 SphK2 foram ensaiados na ausência ou na presença de luteolina, utilizando homogenato celular CC como fonte de enzima. Os dados são a média ± S.D. de três experiências em duplicado. **, P 0,01 vs. controlo

A inibição induzida por luteolina de ambos anabolismo ceramida e actividade SphK2 conduziu a um aumento significativo da relação de ceramida /S1P (mais do que seis vezes, p 0,01)., que é um desequilíbrio relevante do rheostat esfingolipídios.

redução S1P é funcional à toxicidade luteolina

a redução induzida por luteolina de S1P intracelular nos levou a avaliar se a administração S1P afeta luteolina citotoxicidade. Nós primeiro descobriu que o tratamento S1P aumentou significativamente a fosforilação de Akt em células CC (Fig 6A, para cima). Além disso, a co-administração de S1P e luteolina resultou num aumento significativo de células viáveis ​​(figura 6A, abaixo), e reduziu a inibição da fosforilação de Akt luteolina (Fig 6B)

(A) do painel superior.: CC células foram tratadas com 0,5-1 uM S1P durante 2 h. Quantidades iguais de proteínas celulares foram então analisados ​​para Akt fosforilada (pAkt) por imunotransferência. Painel inferior: CC células foram tratadas com diferentes concentrações de S1P na presença de 50 uM luteolina, e após 48 h a viabilidade celular foi analisada pelo ensaio de MTT. (B) P-Akt /β-actina relação de (média ± D.P.) antes e após o tratamento de células de CC com 1 uM de S1P e /ou 50 ^ M durante 2 h luteolina. *, P 0,05 e **, P 0,01 vs células não tratadas; #, P 0,05 versus células tratadas com luteolina. Um Western blot representativo é relatado na parte inferior. (C) As células foram incubadas com CC luteolina sozinho (Lu) ou na presença de 1 uM de S1P e /ou 1 uM SEW2871; 5 uM W123; ou 100 ng /ml de PTX. (D) As células foram incubadas com CC luteolina na ausência ou presença de 1 uM de S1P em gaiolas com ou sem 100 ng /ml de PTX durante 48 horas. A viabilidade celular foi medida sem (cinza escuro) ou com (cinza claro) irradiação UV por 30 s. Em (C) e (D), a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT, e a viabilidade das células tratadas com luteolina foi considerado como 100%. Os dados são a média ± S.D. de pelo menos duas experiências independentes. **, P 0,01.

Para determinar se S1P exerce efeitos protetores sobre a morte induzida por luteolina através de uma via que envolve S1PRs, dois inibidores farmacológicos foram utilizados com diferentes mecanismos de ação. Uma vez que a ligação do receptor de S1P1 para a S1P foi mostrado para ser envolvido no cancro com colite induzida [33], que numa primeira fase, o possível papel do receptor de S1P1 em efeito de S1P nas células CC. O SEW2871 agonista de S1P1 específica foi incapaz de imitar-efeito protector S1P na toxicidade luteolina (Figura 6C), e S1P antagonista W123 foi sem efeitos relevantes sobre a sobrevivência mediada por S1P de células CC (Figura 6C, faixas 3 e 4, respectivamente). Para abordar a questão de saber se S1P induzidos efeitos pró-sobrevivência foram dependentes dos seus receptores acoplados à proteína G específicas, que ensaiada a sobrevivência celular na presença de PTX, porque todos os receptores S1P conhecidos são, pelo menos em parte, juntamente com proteína Gi /o [34]. Como mostrado na Fig 6C, PTX era incapaz de influenciar o efeito estimulador de S1P na sobrevivência celular, sugerindo que as proteínas-G PTX-sensíveis que não estão envolvidos nas vias de sinalização de melhoramento da sobrevivência das células de S1P. Finalmente, para determinar a capacidade de S1P para agir como mediador intracelular, é carregado células CC com um derivado photolysable (Caged) de S1P. Como mostrado na Fig 6D, após a fotólise, a S1P enjaulado exibiram uma significativa, o efeito de protecção contra a morte celular induzida por luteolina, e este efeito permaneceu unmodified.in a presença de PTX.

Discussão

neste estudo, inicialmente relatam que, luteolina exibe um efeito apoptótico dependente da dose sobre as células de CC na gama de 50-200 | iM, conhecida como concentração fisiológica de polifenóis no tracto gastro-intestinal [35]. De relevância, na mesma gama de concentrações, a flavona mostrou nenhuma toxicidade em Des, usado como modelo de células epiteliais intestinais normais. Assim, verifica-se que a luteolina exibem atividade citotóxica para células CC humanos com pouco ou nenhum efeito sobre as células normais, sugerindo que pode representar um candidato ideal para novas terapias.

O nosso estudo também revela pela primeira vez que um teor aumentado de ceramida celular está no comando do diferente sensibilidade das células des e CC à toxicidade luteolina. Inicialmente descobriu que, nas condições de cultura utilizadas, as células CC mostrou cerca de metade dos níveis de ceramida, quando comparado com o DES. De interesse, uma diminuição semelhante no conteúdo celular de ceramida foi encontrado no cancro do cólon humano, quando comparado com a mucosa de cólon normal (15), sugerindo que as células CC são particularmente sensíveis à elevação da ceramida. Além disso, descobrimos que o tratamento luteolina nível de ceramida reforçada em células CC, mas não em DES. experimentos de pulsos com Sphl e rotulado serina revelou que, tanto a via de reciclagem, e

de novo

via de síntese da ceramida estão envolvidos no aumento induzido por luteolina de ceramida em CC.