Abstract

A cisplatina é comumente usada na quimioterapia do cancro do ovário, no entanto, chemoresistance à cisplatina continua a ser um grande desafio clínico. Oncogénica FOXM1 factor de transcrição foi relatada a ser sobre-expresso em cancro do ovário. Neste estudo, teve como objetivo investigar o papel potencial da FOXM1 em cancros do ovário com chemoresistance à cisplatina. Os nossos resultados indicam que FOXM1 é regulada em amostras de cancro do ovário quimiorresistentes e defende células de cancro do ovário contra a citotoxicidade de cisplatina. FOXM1 facilita a reparação do ADN através da regulação da transcrição alvo directo EXO1 para proteger as células de cancro do ovário da apoptose mediada pela cisplatina. Atenuar a expressão FOXM1 e EXO1 pelo RNA interferente pequeno, aumenta a eficácia da quimioterapia contra o câncer de ovário. Nossos resultados indicam que a segmentação FOXM1 e sua EXO1 gene alvo poderia melhorar o efeito da cisplatina no cancro do ovário, confirmando seu papel na modulação da sensibilidade cisplatina

Citation:. Zhou J, Wang Y, Wang Y, Yin X, Y Ele, Chen L, et ai. (2014) FOXM1 modula Cisplatina Sensibilidade regulando EXO1 no cancro do ovário. PLoS ONE 9 (5): e96989. doi: 10.1371 /journal.pone.0096989

editor: Alexander James Roy Bishop, Universidade do Texas Health Science Center em San Antonio, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de outubro de 2013; Aceito: 14 de abril de 2014; Publicado: 13 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Em realizar deste manuscrito, os autores receberam o apoio da National Science Foundation Natural da China (Grant No. 81272882,81302275, 81.072.137) e do Comitê de Xangai da Ciência e Tecnologia (Grant No. 12411950200). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a neoplasia maligna ginecológica mais letal do mundo, com 225,500 novos casos e 140.200 mortes estimadas para 2008 [1]. A maioria das mulheres com epitelial do cancro do ovário (EOC) apresentam-se com doença avançada (estágio III ou IV) no momento do diagnóstico. tratamento padrão actual de cancro do ovário, em ambas as fases iniciais e avançados, consiste em cirurgia citorredutora completa seguida por quimioterapia, normalmente com base numa platina e taxanos dupleto [2]. Mas o desenvolvimento de chemoresistance ainda apresenta um grande impedimento para o sucesso do tratamento. A maioria dos pacientes sucumbem à chemoresistance e recaída, ea taxa de sobrevida global em 5 anos é de cerca de 31% [3]. Uma melhor compreensão da base molecular da resistência a cisplatina pode levar a novas estratégias anti-tumorais que irá sensibilizar cancros do ovário que não respondem à quimioterapia baseada em cisplatina.

fator de transcrição Mammalian forkhead Box M1 (FOXM1) pertence a uma grande família de forkhead factores de transcrição. membros da família forkhead estão envolvidas numa vasta gama de processos biológicos, incluindo embriogénese, proliferação, diferenciação, apoptose, transformação, tumorigénese, longevidade, e homeostase metabólica [4]. Ao contrário de outros factores de transcrição-FOX, FOXM1 está associado com a proliferação celular e é sobre-expresso no cancro. Por exemplo, os perfis de expressão de gene em carcinomas, incluindo os da próstata, mama, pulmão, ovário, cólon, pâncreas, estômago, bexiga, ovário, fígado e rim, que revelou FOXM1 é sobre-expresso em todos os carcinomas [5] – [9]. A sobre-expressão de FOXM1 em vários tumores indica uma forte dependência das células tumorais em FOXM1 [10]. Além disso, no cancro do ovário, a análise mostrou que via integrada rede factor de transcrição FOXM1 é significativamente alterada em 87% do cancro do ovário seroso de alto grau [11]. FOXM1 promove a proliferação celular, migração e invasão no câncer de ovário [12]. FOXM1 também foi demonstrado desempenhar um papel crucial na capacidade de resposta e a resistência da droga. Por exemplo, tem sido demonstrado que a expressão desregulada FOXM1 pode conferir resistência a fármacos quimioterapêuticos, tais como cisplatina e epirrubicina [13], e proteger as células cancerosas contra danos do ADN-morte celular induzida no cancro da mama [14]. No entanto, permanece elusiva se o FOXM1 desempenhar um papel semelhante responsável por conferir resistência à cisplatina em cancro do ovário.

EXO1 é uma proteína com actividade de exonuclease de 5 ‘para 3’, bem como uma actividade de ARNase H, que interage com Msh2 e que está envolvida na reparação e recombinação [15] incompatibilidade, [16]. estudo recente mostra que EXO1 contribui para a indução de DNA postos de controle de danos e participa na reparação de danos no DNA [17], [18].

No presente estudo, nós fornecemos as evidências de que FOXM1 e sua reparação directa de ADN a jusante EXO1 gene pode desempenhar no aumento da sobrevivência das células de câncer de ovário após tratamento com cisplatina, e visando eixo /EXO1 FoxM1 pode sensibilizar células de cancro do ovário ao tratamento com cisplatina.

Materiais e Métodos

Declaração de Ética

os protocolos para a manipulação de amostras de cancro do ovário embebidos em parafina e análise de dados do paciente foram aprovados pelos comitês de ética de Renji Hospital, Shanghai Jiao Tong University, na China. consentimentos informados por escrito foram assinados por cada paciente inscrito, se ela ainda estava viva ou por seu parente de primeiro grau se ela morreu. Todas as amostras de tecido foram registradas por um número de processo no banco de dados sem nomes de pacientes ou informações pessoais indicados.

Imunohistoquímica

As amostras de tecido embebidos em parafina foram coletados de 20 mulheres com câncer epitelial de ovário primário , stagesIIto IV, que tinham sido submetidos a cirurgia inicial do departamento de obstetrícia e ginecologia, Renji Hospital, Faculdade de Medicina, Universidade Shanghai Jiao Tong entre 2005-2008. As lâminas foram desparafinadas, re-hidratados e colocados em tampão de ácido cítrico (pH 6,0, 0,1 M) para o aquecimento durante 10 min. A actividade de peroxidase endógena foi bloqueada por incubação em seguida com 3% H

2O

2 durante 10 min. Em seguida, as secções foram incubadas com tampão (Beyotime, China) de bloqueio, durante 1 h e, em seguida, incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpo FOXM1 (1:50, Santa Cruz). A seguir a 10 minutos de incubação de anticorpo biotinilado em segundo lugar, as lâminas foram de novo incubadas com estreptavidina-peroxidase sob a mesma condição. A imunorreacção foi então visualizadas por incubação com diaminobenzidina cromogénio (DAB, Maixin-Bio, China) durante 5 min. Finalmente, as lâminas foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas, foi afastada e montado. Os controlos negativos foram incubadas em tampão de bloqueio sozinho. Estes resultados só foram consideradas se estas amostras de controlo demonstrou uma coloração negativa.

As linhas celulares e Cultura

As linhas de células de cancro do ovário humano A2780 e SKOV3 foram adquiridos no Cell Bank da Academia Chinesa de Science (Xangai, China). Ambas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Hyclone, EUA) suplementado com 10% (v /v) de soro fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina e 100 g /ml de estreptomicina e as células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% CO2 /95% de ar.

siRNA e plasmídeo transfecção e co-transfecção

ARNic em cadeia dupla foram preparadas por RiboBio (Guangzhou, China). SiRNA A sequência de ARNic eram como se segue: FOXM1 siRNA-1: 5′-GCCAAUCGUUCUCUGACAGAATT-3 ‘, siARN-2: 5′-GGACCACUUUCCCUACUUUUUTT-3′ [19]. EXO1 siRNA-1: 5’-CAAGCCUAUUCUCGUAUUUTT-3 ‘, siARN-2: 5′-UAGUGUUUCAGGAUCAACAUCAUCU-3′ [18]. A sequência de controlo negativo (CN) era: 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘. A transfecção e co-transfecção de siRNA e plasmídeo foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante de Lipofectamin (Invitrogen).

-PCR em tempo real

O ARN total foi extraído utilizando Trizol (Invitrogen), e o ADNc foi sintetizado utilizando RT PrimerScript kit de reagente (Takara). Para-PCR quantitativo em tempo real, a mesma quantidade de ADNc foram adicionados a pré-mistura de SYBR EX Taq II (Takara) e executados em tempo real do sistema de PCR StepOne (Applied Biosystem). O programa de ciclos foi de 95 ° C durante 5 s e 60 ° C durante 30 s. Cada amostra foi ensaiada em triplicado, e β-actina foi utilizado como um controle endógeno. Os iniciadores directos e reversos utilizados foram como se segue: FOXM1: 5′-GGAGCAGCGACAGGTTAAGG-3 ‘e 5′-GTTGATGGCGAATTGTATCATGG-3′, EXO1: 5’-CCTCGTGGCTCCCTATGAAG-3 ‘e 5′-AGGAGATCCGAGTCCTCTGTAA-3’. PLK4: 5′-AAGCTCGACACTTCATGCACC-3 ‘e 5′-GCATTTTCAGTTGAGTTGCCAG-3’. XRCC1: 5′-CCTTTGGCTTGAGTTTTGTACG-3 ‘e 5′-CCTCCTTCACACGGAACTGG-3’. BRCA2: 5′-TGCCTGAAAACCAGATGACTATC-3 ‘e 5′-AGGCCAGCAAACTTCCGTTTA-3’. Rad51: 5′-CAACCCATTTCACGGTTAGAGC-3 ‘e 5′-TTCTTTGGCGCATAGGCAACA-3’. β-actina:. CATGTACGTTGCTATCCAGGC 5′-3 ‘e 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’

clonogénicas ensaio

Após a transfecção de NC ou ARNsi específico para o gene, as células foram submetidas ao indicado concentração de cisplatina durante 1 h. Em seguida, as células foram novamente suspensas em meio completo fresco e plaqueadas em 6 poços placa de cultura celular a uma densidade de 500 células /poço. Após a incubação a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 /95% de ar, durante 8-10 dias, o meio foi trocado a cada 3 dias. No final da cultura, as células foram coradas com 1% de azul de metileno em metanol a 50% durante 20 min, lavou-se com água, e as colónias (≥50 células) foram contadas.

Western blot

As células foram lisadas em tampão RIPA com suplemento de inibidor de protease PMSF, seguido por centrifugação a 14000 g durante 10 min. No final da centrifugação, os lisados ​​de células foram recolhidos e a concentração de proteína dos lisados ​​celulares foi medida. A mesma quantidade de proteínas (10-20 ug) foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidas para membrana de PVDF (Millipore). As manchas foram então incubadas com anticorpos primários em 5% de albumina de soro bovino /solução salina tamponada com Tris Tween-20 a 4 ° C durante a noite, seguido por incubação com anticorpos secundários à temperatura ambiente durante 1 h. Os sinais de proteína foram detectados pelo scanner de Odessey. Os anticorpos utilizados neste estudo incluíram: FOXM1 humana (1:100, Santa Cruz Biotechnology), fosfo-histona H2A.X (γH2AX, 1:1000, Cell Signaling Technology), caspase-3 (1:1000, Cell Signaling Technology) , EXO1 (1:100, Thermo Fisher Scienfitic), β-actina (1:2000, Abcam).

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi medida pela Cell Counting Kit-8 ensaio ( DOJINDO Technologies molecular). Resumidamente, as células foram plaqueadas a uma densidade de 5 x 10

3 células /cavidade em placas de 96 cavidades e submetidos a um tratamento diferente. Após 48 h de incubação a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2/95% de ar, as amostras foram incubadas durante mais 2 h com reagente CCK8. A absorvância foi determinada a 450 nm utilizando FLx800 leitor de microplacas de fluorescência (Biotek).

γH2AX coloração imunofluorescente

A2780 e células SKOV3 foram transfectadas com NC ou específica para o gene de siRNA. Após 48 h, as células foram então tratadas com a concentração indicada de cisplatina durante 1 h, e meios frescos foram alteradas. 24 horas mais tarde, as células foram sujeitas a coloração com anti-γH2AX (Ser139). Resumidamente, as células foram fixadas com formalina a 10% durante 15 min, depois permeabilizadas com 0,1% de Triton-100 em 10% de FCS durante 10 minutos. As amostras foram bloqueadas com soro de cabra a 5% em 10% de FCS, durante 1 h e, em seguida, incubadas durante a noite com o primário de coelho anti-γH2AX (Ser139; 1:400; Cell Signaling). Após lavagens com PBS, secundário de cabra anti-IgG de coelho-TRITC (1:400; Sigma-Aldrich) foi adicionada às amostras durante 1 h. As células foram contrastadas com DAPI antes da montagem. As imagens foram capturadas usando um microscópio de varredura a laser confocal TCS SP5 (Leica). Para a quantificação de focos, as células com maior do que 10 focos foram contados como positiva de acordo com o procedimento padrão [20]. As experiências foram repetidas em triplicado.

A citometria de fluxo

A apoptose foi exmamined por análise de citometria de fluxo de coloração Anexina V e PI (BD) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, após o tratamento indicado, as células foram ressuspensas a uma concentração de 1 × 10

6 células /ml, em seguida, 5 ul de FITC anexina V e 5 ul de PI foram adicionados a 1 × 10

5 células (100 ul) e as células foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 min. Após a incubação, as células foram analisadas por citometria de fluxo FC500 /FC500 MPL (Beckman Coulter). Para a análise do ciclo celular, as células foram tripsinizadas, sedimentadas, e depois ressuspenso em solução de iodeto de propídio (/ml de iodeto de propídio 50 ug, 0,1 mg /ml de ARNase, e 0,05% de Triton-X). Todos os reagentes foram adquiridos a partir de Sigma. Após 40 min de incubação, as células foram analisadas por FC500 /FC500-MPL.

Cromatina ensaio de imunoprecipitação

imunoprecipitação da cromatina (ChIP) experimentos foram realizados como previamente descrito [21]. 24 horas após tratamento com cisplatina, as células foram fixadas em formaldeído a 1% durante 10 min para permitir a reticulação e, em seguida, extinta com glicina. As células foram colhidas e lisadas em tampão de lise de SDS. Lysate a ultra-sons, pré-limpa, incubadas com anticorpos, e recolhidos com Proteína-A + G DNA do esperma agarose /Salmon. ADN-proteína ligações cruzadas foram invertidos e o DNA de cromatina foi purificado e sujeito a análise por PCR. Os iniciadores 5′-AAA TCT GGC AAC CCT ACC TCA-3 ‘e 5′-TTA AGT GTG CCT GTC AGT TCC-3′ foram utilizados para amplificar a região do EXO1 FHRE1 contendo (-1934 /-1575), e os primers 5’-CAA TTT CGA TTT GTA GAG ACG AC-3 ‘e 5′-CTT CGG CCA ACT CAT AGG GT-3’ foram utilizados para amplificar a região contendo FHRE2 (-459 /-74). Após a amplificação, os produtos de PCR foram resolvidos em gel de agarose visualizado por GelRed (Biotium).

repórteres promotor e ensaios de luciferase

A região promotora EXO1 foi amplificados por PCR a partir de DNA genômico extraído de células A2780 usando directo e inverso, os iniciadores que contêm sítios de restrição NheI e HindIII (5′-CTA GCT AGC AGG ACC AAA GAG TCA CCA AC-3 ‘e 5′-CCC AAG CTT GGG CAC TAA CTT GCC TAC ACA 3′). Após digestão de restrição, o fragmento foi clonado no vector de gene repórter de base PGL-3 para a construção do promotor gerado EXO1, promotor pGL3-FHER2 construir -490 /-148 foi clonado por PCR (iniciadores: 5’-GCT CTA CAG AAA GAA CCC AGC AAC GTG TGA-3 ‘, 5′-CCC AAG CTT GGG CAC TAA CTT GCC TAC ACA 3’). mutagénese local forkhead putativo foi realizada utilizando um kit de mutagénese dirigida ao local (ExCell Biologia). pGL3-Basic, pGL3-EXO1, de tipo selvagem pGL3-FHRE2, de tipo selvagem pGL3-FHRE2 mais siARN FOXM1, e mutante pGL3-FHRE2 foram transfectados para células, respectivamente. As células transfectadas foram tratadas com cisplatina por 24 h e as suas actividades de luciferase foram medidas pelo sistema de ensaio de luciferase (Promega).

A análise estatística

Foi utilizado software SPSS19.0 para calcular os desvios-padrão e estatisticamente significativa diferenças entre as amostras. Os asteriscos em cada gráfico indicam mudanças estatisticamente significativas, com valores

P

calculados pelo Student

t

teste da seguinte maneira: *,

P Art 0,05; **,

P

≤0.01; ***,

P

≤0.001.

valores P

de foram consideradas estatisticamente significativas 0,05

Resultados

1.. FOXM1 expressão foi regulado para cima em tecidos de cancro do ovário a cisplatina e células resistentes

Anteriormente, foi demonstrado que FOXM1 é sobre-expresso em cancro do ovário e que a sobre-expressão FOXM1 foi significativamente correlacionado com cancro do ovário de alto grau, o que indica que FOXM1 pode desempenhar um papel no cancro do ovário oncogénica [12]. Até agora, o papel de FOXM1 em resistência à cisplatina de cancro do ovário não foi elucidado. Para investigar a expressão de FOXM1 no cancro do ovário sensíveis ou resistentes a cisplatina, amostras de tecido de cancro do ovário foram obtidas de 10 mulheres com câncer epitelial de ovário recorrente em 6 meses após a terapia padrão, e outras 10 mulheres que estavam quimiossensíveis. Todos os pacientes receberam a cirurgia citorredutora óptima seguido de 6 ciclos de quimioterapia sistémica, com a combinação da cisplatina e paclitaxel. Entre os 10 pacientes quimiossensíveis, 7 deles recorreram após 12 meses e 3 deles não se repetiu até agora. Todas as lâminas foram a partir de tecidos de cancro do ovário ressecados na operação inicial. Os slides embebidos em parafina marcação imunoistoquímica com anticorpo FOXM1 e lâminas coradas representativos foram mostrados em Fig.1A e Fig.1b. Moderada a alta expressão FOXM1 foram detectados em até 8 de 10 casos resistentes, mas apenas em 4 de 10 casos sensíveis (Figura 1C). Em seguida, comparou-se a resistência a cisplatina e expressão FOXM1 em três linhas de células. SKOV3, que mostraram maior expressão de FOXM1, também era o mais resistente à cisplatina, enquanto ES2, o que foi a mais sensível à cisplatina, FOXM1 expressa no nível mais baixo (Fig.1d). Estes resultados indicam que a cisplatina exposições de cancro do ovário resistentes maior nível de expressão FOXM1 em comparação com cancro do ovário sensíveis a cisplatina.

(A) secção imunologicamente representativas FOXM1 é mostrada a partir do grupo quimiossensíveis paciente, (B) secção imunologicamente representativas é FOXM1 mostrado a partir do grupo de pacientes resistente à quimioterapia. (C) O número de casos com o nível indicado de expressão FOXM1 em grupo quimiossensíveis e resistente à quimioterapia, são mostrados. (D) A IC

50 valores de diferentes linhas celulares foram mostrados no painel superior, e a expressão de FOXM1 na célula linhas foram mostrados no painel inferior.

2. FOXM1 é sobre-regulada em células de câncer de ovário após tratamento com cisplatina

para continuar a determinar o padrão de expressão de FOXM1 em células de cancro do ovário, nós tratados A2780 e SKOV3 com diferentes concentrações de cisplatina, e descobriu o nível de mRNA de FOXM1 aumentou apenas ligeiramente após tratamento com cisplatina (Fig.2a). Descobrimos, contudo, que a proteína FOXM1 notavelmente aumentada numa concentração e forma dependente do tempo em ambas as linhas celulares, e correspondia ao nível de γH2AX (Fig.2B e Fig.S1), que é o padrão de ouro de quantificação danos no ADN [22 ]. Nós também executada no tratamento /OFF de cisplatina, foi observado o nível elevado de proteína FOXM1 em ambas as linhas de células às 24 horas após o tratamento, e o efeito prolongado até 96 horas (Fig.2C). Uma vez que o aumento do nível de proteína FOXM1 não corresponde ao aumento do nível de ARNm FOXM1, era possível que a proteína de elevada FOXM1 foi em grande parte mediada pela estabilização da proteína [23].

células A2780 e SKOV3 (A) foram tratados com a concentração indicada de cisplatina durante 24 h. Após o tratamento, os níveis de transcrição de ARNm FOXM1 foram determinadas por PCR em tempo real e p-actina foi utilizado como um controle endógeno. Cada coluna e barra representa D.P. ± média. de determinações em triplicado. Prepararam-se (B) Os lisados ​​celulares após o mesmo tratamento que em (A), resolvidas por SDS-PAGE e sujeito a imunotransf erência utilizando anticorpos anti-análise FOXM1, anti-γH2AX, ou anti-β-actina, respectivamente. células A2780 e SKOV3 (C) foram tratadas com 2 ug /mL e 4 ng /cisplatina ml durante 12 h, respectivamente, em seguida, foram cultivadas em meio completo fresco para os pontos de tempo indicados (o tempo quando o meio completo foi adicionado foi definida como 0 h) . Western blot foi realizada para determinar a expressão de FOXM1 e β-actina.

3. Segmentação FOXM1 aumenta a sensibilidade a cisplatina no cancro do ovário

Dado que FOXM1 foi sobre-expressos em câncer de ovário, e foi ainda mais up-regulada em resposta ao tratamento com cisplatina, a hipótese de que a segmentação FOXM1 poderia sensibilizar células de cancro do ovário a cisplatina. Nós transientemente transfectadas dois siRNAs segmentação FOXM1 em A2780 e SKOV3, ambos os siRNAs notavelmente reduzidas expressão FOXM1 e siRNA-2 tem um efeito maior silenciamento nas duas linhas celulares (Fig.3 e 3B). 48 h após a transfecção siRNA-2, as células foram tratadas com a concentração indicada de cisplatina. ensaio clonogénico foi realizada em 1 h de pós-tratamento com cisplatina, e a viabilidade celular foi medida utilizando um ensaio de CCK8 às 48 h pós-tratamento com cisplatina. Como esperado, FOXM1 siARN transfecção em células A2780 e células SKOV3 rendeu ambas as linhas de células mais sensíveis à toxicidade de cisplatina, tal como evidenciado por uma comparação da CI

50 valores entre precipitação siRNA e células tratadas com siRNA FOXM1 (~1.7 ug /ml vs ~ 4,1 ug /ml em A2780, -2,5 mg /mL vs ~6.1 ug /ml em SKOV3) (Fig.3C). O tratamento com cisplatina FOXM1 siRNA e também resultou numa redução significativa no número de células A2780 e SKOV3 como medido pelo ensaio clonogénico (~17% versus -45% em A2780, -16% vs ~37% em SKOV3) (Fig.3D). Além disso, nós examinamos se a knockdown de FOXM1 levou a um aumento da apoptose após tratamento com cisplatina. Como mostrado na Fig.3E, combinado com cisplatina FOXM1 siRNA resultou em aumento da taxa de apoptose em ambas as linhas celulares (~18% vs ~38% em A2780, ~ 20% vs. ~ 40% em SKOV3). Correspondente com ensaio de apoptose, análise de Western blot mostrou também reforçada a caspase-3 clivada, após co-tratamento com ARNsi FOXM1 e cisplatina (4A). Colectivamente, estes resultados indicam que o direccionamento FOXM1 proporciona uma estratégia para sensibilizar cancro do ovário a cisplatina.

A2780 e células SKOV3 foram transientemente transfectadas com ARNsi (100 nM) dirigido contra FOXM1. As células de controlo foram deixados não transfectada, ou um controlo negativo siRNA (100 nM) -transfected. 48 h após a transfecção, o nível de ARNm de FOXM1 (A) e o nível de proteína (B) foi determinada por PCR em tempo real e Western blotting, respectivamente. Cada coluna e barra representa D.P. ± média. de determinações em triplicado. (C) 48 horas após a transfecção as células SKOV3, A2780 e foram tratadas com concentrações crescentes de cisplatina durante mais 48 h e as suas taxas de viabilidade foram medidos por CCK8 e em comparação com as células sem tratamento com cisplatina. (D) 48 h após a transfecção siRNA, A2780 e células SKVO3 foram tratadas durante 1 h com 1 ug /mL e 2 ng /ml de cisplatina, respectivamente. Em seguida, as células foram plaqueadas em placas de 6 poços, as colónias foram coradas e contadas após incubação durante 8-10 d. Os resultados apresentados são representativos de três experiências independentes. Os gráficos apresentam uma quantificação em percentagem dos poços não tratados. Cada coluna e barra representa D.P. ± média. de determinações em triplicado. (E) 48 h após a transfecção as células SKOV3, A2780 e foram tratados durante mais 48 h com 1 ug /mL e 2 ng /ml de cisplatina, respectivamente. Após o tratamento, a apoptose foi determinada por análise de citometria de fluxo de coloração Anexina V e PI. O painel da direita mostra médias ± D.P.. de três experiências independentes.

(a) 48 h após a transfecção as células SKOV3, A2780 e foram tratados durante 24 h com 2 ug /mL e 4 ng /ml de cisplatina, respectivamente. Após o tratamento, foram preparados lisados ​​celulares, resolvidas por SDS-PAGE e sujeitas a análise de immunobloting FOXM1, γH2AX, caspase-3 clivada e β-actina. (B) A2780 e células SKOV3 com ou sem o silenciamento de expressão FOXM1, foram tratados com 1 ug /mL e 2 ng /mL de cisplatina durante 1 h, respectivamente. γH2AX focos de células A2780 e células SKOV3 foram quantificados no ponto de tempo diferentes: 24, 48 e 72 h após tratamento com cisplatina. Percentagem de células positivas γH2AX foi plotado. células não tratadas foram utilizados como controle.

4. FoxM1 bater-down resulta em reparo de DNA deficiência

foi relatado que FoxM1 regulamentados vários genes na via de reparação do ADN [14], [24], o próximo examinou se as células FOXM1 knock-down eram suscetíveis à DNA quebras no cancro do ovário. Para este fim, as células tratadas com siRNA FOXM1 e células tratadas com embaralhamentos foram tratados com cisplatina, e análise de Western blotting foi realizado 24 h pós-tratamento. Notavelmente γH2AX aumentada foi detectada em células tratadas com siRNA FOXM1 após mesmo tratamento com cisplatina (4A). Além disso, nós coradas para γH2AX 24, 48 e 72 horas pós-tratamento com cisplatina. γH2AX focos por núcleo foi contado em mais de 100 células em cada ponto de tempo. Os resultados foram expressos como percentagem de células positivas γH2AX em cada ponto de tempo. células exibidas elevada percentagem de danos de DNA não transformados (células positivas γH2AX) em 48 h e 72 h após o tratamento com cisplatina FOXM1 siRNA-tratada quando comparado células tratadas com scramble para (Fig.4B). Portanto, estes dados suportam a conclusão de deficiência de reparação do ADN nas células tratadas com siRNA FOXM1.

5. Triagem para gene alvo FOXM1 envolvida na reparação DSB induzida pela cisplatina no câncer de ovário

Vários genes alvo de FOXM1, tais como

BRCA2

,

XRCC1

,

Rad51

,

EXO1

,

PLK4

, tem sido relatada a ser envolvidos na reparação do ADN após as DNA rupturas de filamentos duplos (LAP) [14], [24]. Estes resultados levaram-nos a determinar se estes genes alvo FOXM1 mediar reparação do ADN dependente de FOXM1 no câncer de ovário. QPCR foi empregue para determinar o perfil da expressão dos genes acima, após tratamento com cisplatina.

EXO1

mRNA mostrou a mudança mais robusto e correspondeu-se com a mudança de proteína FOXM1 após tratamento com cisplatina em A2780 e SKOV3 (Fig.5a). Os outros genes, no entanto, foram ligeiramente ou moderadamente induzidos após o mesmo tratamento (dados não mostrados). Curiosamente, também descobrimos que a proteína EXO1 não só foi altamente expressa em A2780 e SKOV3 comparação com células ES2 (Fig.S2A), mas foi regulada de forma dose e do tempo dependentes na A2780 e SKOV3 quando tratados com cisplatina, assim como FOXM1 proteína (Fig.5B e Fig.S2B). ON tratamento /OFF de cisplatina também resultou em aumento da expressão de EXO1 até 96 h (Fig.5C). Não era de estranhar que knockdown de FOXM1 foi acompanhada por redução de 60-70% na expressão de mRNA EXO1 (Fig.5D). No entanto, FOXM1 batendo-as não resultou em paragem do ciclo celular profunda (Fig.S2D), o que sugere que a redução da EXO1 não foi um efeito indirecto de mudança do ciclo celular. Além disso, não só FOXM1 silenciar a expressão da proteína EXO1 atenuada em resposta ao tratamento com cisplatina (Fig.S2C), mas também depois de ON /OFF treatement cisplatina (Fig.5E). Estes resultados indicam que EXO1 é um gene alvo candidato de FOXM1 na via de reparação de ADN em cancro do ovário.

células A2780 e SKOV3 foram tratados com a concentração indicada de cisplatina para 24 análise de PCR em tempo (A) e Western blotting (B). Os resultados são apresentados a partir de três experiências independentes em triplicado. Colunas, quer dizer; Barras, DP. células A2780 e SKOV3 (C) foram tratadas com 2 ug /mL e 4 ng /cisplatina ml durante 12 h, respectivamente, em seguida, foram cultivadas em meio completo fresco para os pontos de tempo indicados (o tempo quando o meio completo foi adicionado foi definida como 0 h) . Western blot foi realizada para determinar a expressão de EXO1 e β-actina. (D) As células A2780 SKO3 e foram transfectadas com ARNsi FOXM1, 48 h mais tarde, a expressão EXO1 foi determinada por análise por PCR em tempo real. Os resultados são apresentados a partir de três experiências independentes em triplicado. Colunas, quer dizer; Barras, DP. (E) 24 h após a transfecção as células, A2780 e SKOV3 FOXM1 siRNA foram tratados com 2 mg /ml e 4 ng /cisplatina ml durante 12 h, respectivamente, em seguida, foram cultivadas em meio completo fresco para os pontos de tempo indicados (o tempo quando o meio completo foi adicionado foi definida como 0 h). A seta (↓) indica a transfecção e tratamento com cisplatina subsequente. Western blot foi realizada para determinar a expressão de FOXM1, EXO1 e β-actina.

6. FOXM1 liga-se directamente ao promotor EXO1 e regula a sua actividade

FOXM1 postulado que poderia aumentar a transcrição EXO1 em resposta ao tratamento com cisplatina. A análise das sequências identificou dois elementos de resposta de consenso (forkhead FHREs) na região promotora (fig.6a) [25], [26]. Para demonstrar que FOXM1 se liga directamente à sequência do promotor endógeno EXO1 após tratamento com cisplatina, foi realizada ensaios de imunoprecipitação chromotatin em A2780 e células SKOV3. O anticorpo anti-FOXM1, mas não o anticorpo de controlo (IgG), precipitou a região FHRE2 contendo (-459 /-74) (Fig.6B), no entanto, a região de FHRE1 contendo (-1934 /-1575) não estava precipitado (dados não mostrados). Para avaliar o papel funcional do FHRE2 na regulação EXO1, foi realizada mutagénese específica dentro FHRE2 de promotor EXO1 pGL3-FHRE2 (Fig.6C). Como mostrado na Fig.6D, mutação do FHRE2 abolida a capacidade de FOXM1 para activar o repórter construir após tratamento com cisplatina em A2780 e SKVO3, além disso, a co-transfeco de siARN e FOXM1 de tipo selvagem pGL3-FHRE2 também resultou em baixa luciferase atividade. Curiosamente, pGL3-FHRE2 tem actividade de transcrição forte do que sequência de promotor completa. Estes resultados sugerem que FHRE2 medeia o efeito transcricional de FOXM1 no promotor EXO1 e que pode haver alguns outros locais que podem ser reconhecidos por factores de transcrição de inibição da região a montante de FHRE2.

(A) Sequência e posição da sequência de consenso no promotor FHRE EXO1. (B) Os ensaios de ChIP foram feitas em células A2780 e SKOV3. fragmentos de cromatina das células foram imunoprecipitados com anticorpo anti-FOXM1 e IgG de controlo negativo e sujeito a PCR. 1% dos lisados ​​de células totais foram sujeitas a PCR antes da imunoprecipitação como entradas. (C) a estrutura esquemática do tipo selvagem (WT) e formas mutantes (Mut) de FHRE2 contendo repórteres promotoras. A actividade da luciferase (D) com ou sem mutação no promotor EXO1. células A2780 e SKOV3 foram transfectadas com o tipo selvagem ou repórter contendo FRHE2 mutante, ou co-transfectadas com FOXM1 siRNA e de tipo selvagem repórter (PGL-3-básica e pGL3-EXO1 foram utilizados como controlo negativo e positivo, respectivamente), em seguida, tratados com cisplatina durante 24 h. Depois, a actividade da luciferase nas células foram medidas. Três experimentos independentes foram conduzidos.

7. regulação de reparação do ADN de FOXM1 é parcialmente mediada pela EXO1

EXO1 tenha sido comprovada a estar directamente envolvidos no mecanismo de reparo do DNA [18], [27], [28]. Assim, o próximo exploraram se EXO1 responde por resistência a cisplatina mediada por FOXM1. Nós transitoriamente derrubado a expressão de EXO1 em células A2780 e SKOV3 por siRNA transfecção. Ambos os siRNAs segmentação EXO1 efetivamente reduziu mRNA e expressão de proteínas em A2780 e linhas SKOV3 celulares (Fig.7A e 7B). Knockdown de EXO1 também sensibilizados células à cisplatina, como evidenciado por uma comparação de IC

50 valores (~2.3 ug /ml vs ~4.2 ug /ml em A2780, ~4.1 ug /ml vs ~6.4 ug /ml em SKVO3) e os números de clone (~ 23% vs ~42% no A2780, ~21% vs ~38% em SKOV3) entre corrida siRNA e células tratadas com siRNA específicas EXO1 (Fig.7C e 7D). Em conformidade com o acima exposto, o mesmo tratamento com cisplatina resultou em mais células apoptóticas em células transfectadas com ARNsi específicos EXO1 (~18% vs ~27% em A2780, ~21% vs ~33% em SKVO3) em comparação com as células tratadas com embaralhar (Fig.7E). Embora EXO1 knock-down não afetou a expressão de FOXM1, que fez parte recapitular o efeito cisplatina sensibilização dos FOXM1 silenciamento em células de cancro do ovário. células tratadas com siRNA EXO1 também mostrou mais danos do DNA, o reforço da apoptose vias de sinalização e eficácia reparo de DNA prejudicada, conforme detectado por immunoblotting para γH2AX e caspase-3 (Fig.7F) e γH2AX quantificação (Fig.7G).