Abstract

É bem reconhecido que o factor hipóxia-inducible 1 alfa (HIF-1α) está envolvido em metástase do câncer, quimioterapia e mau prognóstico. Nós já descobriram que a deferoxamina, um agente de hipóxia-mimética, induz a transição epitelial-mesenquimal (EMT) em câncer colorretal. Portanto, aqui nós exploramos um novo mecanismo molecular para HIF-1α contribuindo para EMT e metástase do câncer através da ligação a ZEB1. Neste estudo, mostramos que a sobre-expressão de HIF-1α com EMT infecção por adenovírus promovido, invasão e migração celular

in vitro

e

in vivo

. A nível molecular, o HIF-1α directamente a ligação ao promotor proximal de ZEB1 através de elemento de resposta a hipoxia (HRE) sítios aumentando assim a expressão de transactivity e ZEB1. Além disso, a inibição da ZEB1 foi capaz de revogar a EMT e celular invasão induzida pelo HIF-1α. expressão de HIF-1α foi altamente correlacionada com a expressão de ZEB1 no epitélio colorrectal normal, tecidos CRC primários e metastáticos. Curiosamente, ambos HIF-1α e ZEB1 foram positivamente associado com Vimentin, um importante marcador mesenquimais da EMT, enquanto negativamente associado com a expressão da caderina-E. Estes achados sugerem que HIF-1α aumenta EMT e metástase do câncer através da ligação ao promotor ZEB1 no CRC. HIF-1α e ZEB1 são amplamente consideradas como factores de iniciação do tumor, mas os nossos resultados demonstram que é um ZEB1 jusante directa de HIF-1α, sugerindo um mecanismo molecular para a HIF-novela induzindo-1α EMT e cancro da metástase.

citação: Zhang W, X Shi, Peng Y, Wu M, Zhang P, R Xie, et ai. (2015) HIF-1α Promove epitelial-mesenquimal Transição e metástases através do Regulamento direta de ZEB1 no câncer colorretal. PLoS ONE 10 (6): e0129603. doi: 10.1371 /journal.pone.0129603

Editor do Academic: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPÃO

Recebido: 03 de fevereiro de 2015; Aceito: 11 de maio de 2015; Publicação: 09 de junho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão disponíveis no papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (81172057, 81302159), presidente da Fundação de Nanfang Hospital, Universidade de Southern Medical (2012C003, 2012B009), e de alto nível fundos tema de correspondência de Nanfang Hospital (G201227)

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

epitelial-mesenquimal de transição (EMT) é um evento essencial na metástase do cancro, durante o qual polarizado células epiteliais estão inclinados para obter certos caracteres de células mesenquimais, assim como mais migração e propriedades invasivas [1]. Os hallmarkers moleculares durante EMT incluem marcadores epiteliais regulada para baixo (por exemplo, E-caderina, placoglobina e desmoplaquina),-regulada marcadores mesenquimais (por exemplo, Vimentin, N-caderina e actina de músculo α-suave) e aumento da expressão de factores de transcrição tais como Caracol, Lesma, twist, dedo de zinco homeobox de ligação 1 (ZEB1) e-box, ZEB2, e /ou E47, o que pode se ligar ao promotor de e-caderina e inibir a sua actividade de transcrição e expressão [2]. Notavelmente, a perda ou a regulação negativa da E-caderina é considerado para ser o primeiro passo e mais importante de EMT. E-caderina pode ser silenciado por diferentes mecanismos, incluindo a metilação aberrante e supressão da transcrição. Entre eles, a sua regulação da transcrição é amplamente estudada em vários tipos de tumores malignos [3].

hypoxia-inducible factor de 1 alfa (HIF-1α) foi avaliado para promover EMT em vários tipos de tumores através de uma modulação ou mais genes associados a EMT [4]. Como um fator de transcrição, HIF-1α regula as actividades dos seus genes a jusante através da ligação ao elemento de resposta a hipoxia (HRE) em suas regiões promotoras. Por exemplo, HIF-1α é capaz de transactivar metalopeptidase de matriz 9 (MMP9) no cancro da mama [5]. No carcinoma hepatocelular, ele ativa Snail reprimindo assim a expressão da caderina-E [6]. Além disso, HIF-1α compete com fator de transcrição 4 (TCF4) para ligação EMT a beta-catenin aumentando assim direto no câncer colorretal [7]. Assim, existe uma relação estreita entre EMT e expressão HIF-1α em câncer com os mecanismos desconhecidos.

ZEB1 é um fator de transcrição crucial da EMT [8-10]. No entanto, a associação entre o HIF-1α e ZEB1 é pouco conhecido. Neste estudo, nós mostramos que o HIF-1α superexpressão induzida EMT e fenótipos metastáticos no CRC. HIF-1α regulada directamente expressão ZEB1 através do elemento de resposta de hipoxia de 3 (HRE-3), que está localizado no promotor proximal ZEB1. Supressão de ZEB1 inverteu estes efeitos induzidos por overexpresssion HIF-1α. Os perfis de HIF-1α de expressão, ZEB1 e Vimentin eram muito semelhantes em pacientes com CCR, que era oposta à expressão da caderina-E. Estes resultados indicam que a progressão CRC e metástase, induzida pelo HIF-1α, é mediada pela regulação direta de ZEB1.

Materiais e Métodos

Células e amostras clínicas

CRC linhas de células HT29 e HCT116 foram mantidas no nosso laboratório, com a condição com RPMI 1640 (GIBCO) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), como descrito anteriormente [26]. CRC humana e os de acordo com os tecidos normais adjacentes foram obtidos de dez pacientes com CRC que foram submetidos a colonoscopia; CRC humana e os tecidos dos nódulos linfáticos metastáticos combinados foram obtidas de trinta e dois pacientes com CCR submetidos hemicolectomia em Nanfang Hospital (Guangzhou, China). Essas pessoas nos deram o seu consentimento informado por escrito (conforme descrito no formulário de consentimento PLOS) para participar neste estudo e publicar estes detalhes do caso. Os estudos utilizando tecido humano foram revistos e aprovados pelas comissões de revisão ética de pesquisas envolvendo seres humanos em Nanfang Hospital, Southern Medical University (Permit Number: NFYY-2012-75).

Construção e produção de adenovírus recombinante

HIF-1α-expressando plasmídeo, pDC316-HIF-1α-EGFP, foi construído por inserção do ADNc de HIF-1α de comprimento completo nos sítios de restrição NheI e NotI entre as endonucleases de o vector de expressão pDC316 que continha EGFP (pDC316-EGFP). Para knockdown estável de ZEB1, as seguintes sequências foram clonadas no pDC316-HIF-1α-EGFP. shZEB1 para a frente: 5′-GATCCCCAGATGATGAATGCGAGTCGttcaagagaTGACTCGCATTCATCATCTTTTTTGGAAA-3 ‘e shZEB1 reversa: 5′-AGCTTTTCCAAAAAAGATGATGAATGCGAGTCAtctcttgaaCGACTCGCATTCATCATCTGGG-3’ tal como descrito anteriormente [8]. Ambos os plasmídeos foram verificados por sequenciação de ADN.

Todos os adenovírus, incluindo adenovírus 5 expressando HIF-1α (Ad5-HIF-1α), a sobre-expressão de HIF-1α e ZEB1 knockdown (Ad5-HIF-1α-shZEB1) eo controlo, Ad5-EGFP, foram geradas usando AdMax sistema de empacotamento de adenovirus (Microbix Biosystems Inc., Ontario, Canadá) de acordo com as instruções do fabricante. amplificação de grande escala dos vectores adenovirais acima foram conduzidos em células HEK293T por recombinação homóloga entre um plasmídeo de vaivém (pDC316) e um plasmídeo de esqueleto (pBHGlox_E1, 3Cre). Os títulos dos vírus purificados foram determinadas por ensaio de formação de placas padrão de acordo com as instruções do fabricante (Virapur, San Diego, CA).

infecções de adenovírus in vitro células

HT29 e HCT116 foram cultivadas até à 80% de confluência. Após lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS), as células foram incubadas com Ad5-EGFP e Ad5-HIF-1α ao MOI de 0,1, 1, 10, 100 e 1000, respectivamente. Noventa minutos após a infecção, os vírus foram substituídos por meio de crescimento regular. 24 ou 48 horas após a infecção, a eficiência da transdução de EGFP construções que expressam foi observada por microscopia de imunofluorescência e expressão de HIF-1α foi analisada por PCR ou por transferência de western.

A transcrição reversa de reacção em cadeia da polimerase (RT-PCR) , quantitativo em tempo real PCR (qPCR) e Western Blot Analysis

Estes ensaios foram realizados essencialmente como descrito anteriormente [27-29]. Os iniciadores utilizados para RT-PCR eram como se segue: HIF-1α sentido: 5′-TCCATGTGACCATGAGGAAA-3 ‘e anti-sentido: 5′-CCAAGCAGGTCATAGGTGGT-3′; iniciadores utilizados para qPCR foram como se segue: HIF-1α: 5’-TTTTTCAAGCAGTAGGAATTGGA -3 ‘(sentido) e 5′-GTGATGTAGTAGCTGCATGATCG -3′ (anti-sentido); ZEB1: 5’-CCTGTCCATATTGTGATAGAGGC-3 ‘(sentido) e 5′-ACCCAGACTGCGTCACATGT-3′ (anti-sentido); desidrogenase de gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH): 5’-GTCAACGGATTTGGTCGTATTG-3 ‘(sentido) e 5′-CTCCTGGAAGATGGTGATGGG-3’ (anti-sentido). Os anticorpos primários, HIF-1α (Novus Biologicals, Littleton, CO), ZEB1 (Santa Cruz), a caderina-E (Santa Cruz), vimentina (pré-diluído, Abcam), placoglobina (Abcam), N-caderina (Santa Cruz) e GAPDH (Abcam) eram produtos comerciais.

Migração, invasão e ensaios de cura de feridas

não revestidos transwells Costar (Corning Costar Co., Corning, NY) foram utilizados para ensaios de migração e Matrigel-revestido transwells (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) utilizados para ensaios de invasão. As células foram privadas de soro durante a noite e em seguida semeado para dentro da câmara superior, com meio isento de soro RPMI 1640. RPMI 1640 suplementado com FBS 10% foi adicionado para dentro da câmara inferior. As células que migraram através da membrana Transwell foram coradas e quantificado. Para o ensaio a cicatrização de feridas, o risco foi feita através da monocamada de células utilizando uma ponta estéril. A capacidade das células para migrar foi monitorizada em diferentes pontos de tempo, utilizando um microscópio de luz

histológica e análise imuno-histoquímica

hematoxilina e eosina (H E). E imuno-histoquímica (IHC) foram efectuadas tal como anteriormente descrito [28]. Em resumo, as amostras foram fixadas em paraformaldeído a 4% em PBS durante a noite e posteriormente embebido em cera de parafina. As secções foram cortadas uma espessura de 5 um e coradas com H E para análise histológica. IHC foi realizada análise para a expressão de HIF-1α, ZEB1, E-caderina e vimentina. O tecido em que 10% das células de cancro a ser positivamente corada foi considerada como positiva. Para a análise quantitativa, foi calculado o rácio de células coradas positivamente para todas as células de tumor em cinco áreas aleatórias com uma ampliação de 200 vezes. Todas as avaliações histológicas, incluindo a percentagem de células positivas foram realizadas de forma duplo-cego por dois patologistas para minimizar o viés de observação.

eletroforética Mobilidade Mudança Assay (EMSA)

EMSA foi realizada utilizando um oligonucleótido de cadeia dupla contendo uma sequência de ligação de consenso para o HIF-1α como previamente descrito [27, 28]. As seguintes sequências de cadeias de sentido foram utilizados para os ensaios de ligação de competição e: sequências de tipo selvagem contendo o HRE (P1: 5′-GAGGCGTGGGACTGATGGTAGCC -3 ‘, ~ -521 -517 nt; P2: 5′-GGGGGCGGACACGCGAGG -3′ ~ -529 – 525 nt; P3: 5’-CCGGTCGCCGCGTGTCCTCGCC -3 ‘, ~ -634 -630 nt; P4: 5′-ATACTCCGGTCACGTTTCAGTTTTCTC -3’, ~ -1347 -1342 nt) e as sequências mutantes de acordo HRE (P1-mut: 5 ‘ – GAGGCACAGGACTGATGGTAGCC -3 ‘; P2-mut: 5′-GGGGGCGGATGTGCGAGG -3′; P3-mut: 5’-CCGGTCGCCGCACATCCTCGCC -3 ‘e P4-mut: 5′-ATACTCCGGTTGTGTTTCAGTTTTCTC -3’). Os nucleótidos foram final marcado com [γ-32P] ATP (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Fremont, CA) e polinucleótido-quinase de T4 (Promega). Os extractos nucleares de células infectadas com Ad5-HIF-1α-EGFP e o controlo foram preparadas e utilizadas em EMTS como descrito anteriormente [28]. E foram incubadas em 1 × tampão de ligação contendo 2,5% de glicerol, 50 ng /poli ul (dl-dC), de 5 mm de MgCl2, 0,05% de Nonidet P-40, e 4 pmol de oligonucleótido marcado com biotina num volume total de 20 ul à temperatura ambiente durante 20 min. As misturas ligadas foram-fraccionado por tamanhos num gel de poliacrilamida não desnaturante a 6% a 180 V em 0,5 x tampão TBE. O gel foi em seguida secou-se e autorradiograf ados.

A geração de plasmídeos, transfecção transiente de relatório e Luciferase Assay

Produção de tipo selvagem e mutante construções repórter foi realizada como previamente descrito [29]. Um 567 bp do fragmento de promotor contendo o elemento ZEB1 HRE-3 foi clonado no vector pGL3 para gerar a construção repórter de tipo selvagem, nomeado como pluc-567. Mutação no HRE-3 motivos (pluc-567-mut) foi introduzido em pluc-567 da luciferase construir com o QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene, La Jalla, CA, EUA). Ambas as construções foram verificadas através de sequenciação. As células foram infectadas com Ad5-EGFP ou Ad5-HIF-1α durante 48 h, seguida por transfecção com pluc-567 ou pluc-567-Mut e pRL-CMV (

Renilla luciferase

). O potencial de transativação foi testada com o Dual-Glo Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, EUA), medindo a actividade luciferase após 48h.

camundongos nude e ensaio de metástase

Este experimento animal era realizada em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o IACUC (Institutional animal Care e do Comitê Use), eo protocolo foi aprovado pela Comissão de Ética de Experimentação animal de Nanfang Hospital (número de autorização: NFYY-2013-56) . Todas as cirurgias foram realizadas sob anestesia pentobarbital de sódio, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Após a cirurgia, todos os ratinhos nus foram sacrificados por anestesia com pentobarbital de sódio. Seis semanas de idade ratos nus fêmea BALB /c foram adquiridos de Guangdong Provincial Experimental animal Center (Guangzhou, China) e divididos aleatoriamente em quatro grupos (Ad5-EGFP: N = 8; Ad5-HIF-1α: N = 12; Ad5 HIF-1α-shRNA: N = 5; Ad5-HIF-1α-shZEB1: N = 5) antes da injecção. Os animais foram submetidos a anestesia intraperitonial com uma solução de 40 mg /kg amobarbital de sódio. Depois os ratinhos foram anestesiados profundamente, uma pequena incisão longitudinal flanco superior esquerdo foi feita e o baço foi suavemente exposta. células suspensas individuais (1,5 × 106 células /ratinho) foram injectados em 70 ul de PBS sob a cápsula do baço. Após a remoção da agulha, o local de injecção foi pressionado com uma esponja de algodão asséptica para evitar fugas. Depois disso, o baço foi devolvido para dentro da cavidade abdominal e a parede abdominal e periotneium foram suturada com seda [30-32]. Os ratos foram sacrificados após 5 semanas, a possibilidade de metástase analisados ​​e os sítios metastáticos foram coletadas para H . Coloração E e ensaio qPCR

A análise estatística

A análise foi realizada utilizando GraphPad Prism software 6. Todos os valores foram expressos como média ± DP. A significância estatística das diferenças foi determinado por estudante do

t

-teste. Todas as análises foram em frente e verso, emparelhado (por IHC resultados em amostras clínicas) ou desemparelhados e uma

P

valor de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

superexpressão HIF-1α EMT induzida in vitro

Para obter uma melhor eficácia infecção de adenovírus em linhas celulares de cancro de CRC, HT29 e HCT116 as células foram primeiro transduzidas com adenovirus 5 que expressam reforçada verde proteína fluorescente (Ad5-EGFP) ou Ad5-HIF-1α-EGFP na multiplicidade de infecção (MOI) de 10, 100 e 1000, respectivamente, com os efeitos observados por microscopia em 48 horas (Fig 1A). Aproximadamente 100% das células expressaram EGFP com uma MOI de 100, o que era muito similar a um MOI de 1000. RT-PCR (Fig 1B esquerda) e Western blot (Fig 1B) direito resultados confirmaram o aumento drástico de expressão de HIF-1α . O mesmo efeito foi encontrado em células HCT116 (dados não mostrados). Portanto, a MOI de 100, foi adoptada em todas as experiências seguintes.

Células HT29

(A) foram transduzidas com Ad5-HIF-1α no MOI indicado valores durante 48 horas. A intensidade da fluorescência e campo brilhante na mesma área foram observadas na ampliação original como 100X. (B) mRNA (esquerda) e de proteínas (à direita) expressões de HIF-1α foram detectados utilizando RT-PCR e western blot, respectivamente. GAPDH foi usada como controlo de carregamento. (C) a morfologia celular de células HT29 de tipo selvagem ou HT29 transduzidas com os adenovírus indicados (ampliação original = 400X). (D) Análise de transferência de Western de HIF-1α, E-caderina, placoglobina, vimentina e N-caderina nas células HT29 e HCT116 infectadas com adenovírus. GAPDH foi usada como um controlo interno. (E) Dobre mudança de invasão e migração das células indicadas. A quantificação dos resultados foi mostrado no gráfico de barras com médias ± DP. *

P Art 0,05. (F) a cicatrização de feridas ensaio. As monocamadas de células foram riscados com uma ponta de pipeta e as imagens foram tiradas 0, 24 e 48 horas após a formação da ferida. *

P Art 0,05.

Curiosamente, ao observar as células infectadas com adenovírus, encontramos células HT29-Ad5-HIF-1a eram muito mais fusiforme, como fibrobalsts, em comparação com células de tipo selvagem HT29 que estavam ao redor com o bem adesão célula-célula (Fig 1C). A transição acima da morfologia celular, na verdade, era como o mesmo que o processo de mudança de EMT. Por isso, o próximo detectada a expressão de marcadores EMT e verificaram que a E-caderina e placoglobina, dois marcadores epiteliais importantes de EMT, foram significativamente regulada negativamente em HT29 Ad5-HIF-1α-infectadas e células HCT-116 em comparação com as células de controlo. Pelo contrário, as moléculas de mesenquimais, vimentina e N-caderina foram acentuadamente aumentada após a infecção Ad5-HIF-1α-EGFP (Figura 1D). Além disso, um aumento na invasão e migração (características cruciais de EMT fenótipo) de ambas as linhas de células com sobre-expressão de HIF-1α também foi detectada (Fig 1E). Consistentemente, a ferida cura ensaio demonstraram que a largura nas células HT29-Ad5-HIF-1a eram muito mais estreita do que em células HT29-Ad5-EGFP com as parcelas de tempo indicados, respectivamente (Figura 1F). Os resultados acima sugerem que a superexpressão HIF-1α induz EMT e promove a invasão e migração em linhas celulares de CRC.

HIF-1α superexpressão metástase promovido in vivo

Para avaliar o efeito da superexpressão HIF-1α sobre a metástase do câncer

in vivo

, HT29 células foram transduzidas com Ad5-HIF-1α-EGFP ou Ad5-EGFP, respectivamente, a uma MOI de 100. Quarenta e oito horas mais tarde, as suspensões de células únicas foram colhidas e injectadas ratinhos BALB /c ratinhos nus por meio de um método subsplenic. Como mostrado na Fig 2A, vários nódulos de tumor intra-hepáticos foram facilmente inspeccionado grosseiramente no grupo de Ad5-HIF-1α-EGFP-injectados, ao passo que menos ou mesmo nenhuma nódulos foram encontrados em ratinhos de controlo. Para confirmar a diferença acima referida, nós examinamos H E e coloração encontradas regiões tumorais basofílicas muito mais desenvolvidos em fígados de ratinhos injectados com as células HT29-Ad5-HIF-1a comparado com o grupo de controlo, como mostrado na Fig 2B. Quantidade análise mostrou que um aumento significativo (5,3 vezes) de metástases do fígado foi observado no grupo de Ad5-HIF-1α-injectado, em comparação com o grupo de controlo (Fig 2C). Real-time PCR resultados confirmou que o nível de HIF-1α nas lesões do fígado de ratos injectados com HT29-Ad5-HIF-1α foi muito maior do que injectados com Ad5-HT29-EGFP (Figura 2D). Estes resultados sugerem que a sobre-expressão de HIF-1α promove metástase hepática de CRC em modelo animal

representativos imagens fotográficas (A) e H . E coloração (B) de fígado de camundongos BALB /c cinco semanas após a injeção subsplenic de células HT29 transduzidas com Ad5-vírus HIF-1a ou de controlo. As setas brancas indicam nódulos metastáticos. (C) A comparação de metástases hepáticas entre ratos HT29-Ad5-no HIF 1α (N = 12) e controle de ratos (N = 8). *

P Art 0,05. (D) A confirmação da superexpressão de HIF-1α de nódulos metastáticos em camundongos injetados com Ad5-HIF-1α por qPCR, em comparação com aqueles injetados com os vírus controle.

HIF-1α regulada expressão ZEB1

Ambos HIF-1α e ZEB1 têm sido implicadas em cancro e metástases EMT [4, 9, 11]. Em seguida, investigámos se o HIF-1α superexpressão tinha um efeito sobre a expressão de ZEB1. Com efeito, a regulação positiva de ARNm e de proteína dos níveis de ZEB1 foi encontrado junto com a sobre-expressão de HIF-1α nas células HT29, conforme mostrado na Figura 3A 3B. Além disso, as tendências de HIF-1α e expressão ZEB1 em linhas celulares de CRC (SW480, HCT116, HT29, LoVo e DLD1) eram bastante semelhantes (Fig 3C). Consistentemente, este achado também foi apresentado em amostras de CRC emparelhados e tecidos de cólon epitélio normal adjacentes que foram detectadas por western blot e coloração IHC (Fig 3D 3E). Nós também descobrimos que os níveis de ambas as proteínas eram muito mais elevado em tumor do que em tecidos normais adjacentes. Em nível celular, tanto HIF-1α e ZEB1 foram expressos principalmente no núcleo e no citoplasma, especialmente no núcleo, que eram teoricamente coerente com o sítio de localização do factor de transcrição. E também, as observações de sua co-localização revelam que HIF-1α pode interagir com ZEB1 fisicamente.

(A) os níveis de expressão endógena de HIF-1α e ZEB1 nas cinco linhas de células indicadas foram detectados por qPCR com GAPDH como controlo interno. (B C), as células HT29 foram transduzidas com Ad5-vírus HIF-1a ou controlo durante 48 horas, seguindo por qPCR e Western blot para detectar a expressão de HIF-1α e ZEB1. GAPDH foi usada como um controlo interno. níveis (D) HIF-1a e proteína ZEB1 em tecidos emparelhados não neoplásicas /cancerosas colorectal. N: normal; T: tumor. O nível de cada proteína foi normalizada contra a GAPDH. (E) imagens representativas de coloração IHC em amostras fixadas em formalina CRC humanos embebidos em parafina para HIF-1α e ZEB1. Painel esquerdo mostrou os tecidos colorrectais normais adjacentes. Painel direito mostrou espécimes CRC. ampliação original, 200X.

Regulamento do ZEB1 pelo HIF-1α através HRE-3

Para avaliar se ZEB1 é regulado diretamente pelo HIF-1α, foram analisadas as sequências do promotor de ZEB1 com os métodos de bioinformática. Descobrimos que havia quatro locais HRE potenciais no promotor proximal (~ 3500 nt a montante, o codão de iniciação ATG definido como 0) do gene ZEB1 (Fig 4A). Havia HRE-1 a -517 -521 ~ nt; HRE-2 a -525 -529 ~ nt; HRE-3 em -630 -634 ~ nt e HRE-4 em -1.342 -1.347 ~ nt. Com base nisto, as sondas P1, P2, P3 e P4 com locais de tipo selvagem e mutante HRE foram concebidos, respectivamente, como descrito em materiais e métodos. Os resultados de ensaio revelaram que a EMSA HIF-1α de ligação foi aumentada de forma significativa depois da incubação de extractos nucleares a partir de células HT29-Ad5-HIF-1α com o HRE-3 contendo o promotor de oligonucleótido ZEB1 (Fig 4B). No entanto, havia apenas bandas semana muito ou mesmo nenhuma banda apresentados nas células HT29-Ad5-HIF-1a ou outras células de controlo com o HRE-1, 2 ou 4-oligonucleótido contendo (dados não mostrados). Além disso, a concorrência para HIF-1α de ligação por oligonucleótidos não marcados contendo HRE-3 e sondas contendo mutado HRE-3 não apresentaram bandas HIF-vinculativo-1a (Fig 4b). Estes resultados sugerem que o HIF-1α foi capaz de se ligar promotor ZEB1 através do sítio HRE-3.

(A) Representação esquemática do promotor proximal (~ 3500 nt a montante) do gene ZEB1. HRE: hipóxia elemento de resposta. (B) Os oligonucleótidos para EMSA foram de tipo selvagem (pista 1-3) e a sonda mutante 3 (pista 4-5) a partir do promotor ZEB1, que continha um consenso HRE-3. Os extractos nucleares preparados a partir de HT29-Ad5-HIF-1α (pista 3 e 5) ou células de controlo (pista 2 e 4) foram incubadas com [γ-32P] ATP sonda marcada antes da electroforese. O controlo negativo foi realizada com sonda do tipo selvagem sem o extracto nuclear (pista 1). (C) Representação esquemática da região do promotor de ZEB1 e as construções de relatório utilizados em experiências infectadas com adenovírus. As construções de tipo selvagem continha (pluc567-wt) ou mutante (Mut-pluc567) HRE-3 localizado -634 -630 ~ nt a montante do local de início da transcrição de ZEB1. (D) A activação do plu567 ou em células HT29-EGFP Ad5-HIV (N = 3 experiências em replicado) Ad5-HIF-1α- ou Mut-pluc567. *,

#

P Art 0,05.

Em seguida, determinou-se o efeito da superexpressão HIF-1α sobre a actividade de transcrição de ZEB1. Com base nos resultados de EMSA, um plasmídeo contendo o promotor HRE1-3 (pluc567) e a mutagénese dirigida ao local de HRE-3 plasmídeo (pluc567-mut) foram gerados e transientemente transfectados para células HT29 que foram pré-incubadas com Ad5-HIF -1α ou Ad5-EGFP durante 24 h, ensaio de luciferase dupla revelou que a actividade de pluc567 em células HT29-Ad5-HIF-1a aumentado mais do que 5 vezes, em comparação com células de controlo, ao passo que o aumento foi significativamente reduzido com a transfecção pluc567-Mut (Fig 4C 4D). Estes resultados demonstraram que o HIF-1α ZEB1 activado directamente através da ligação ao local de HRE-3 no promotor proximal ZEB1.

ZEB1 é crítica para EMT-HIF-1α induzida e metástase

Para detectar se ZEB1 é necessário para EMT induzida pelo HIF-1α e fenótipo metastático, geramos um plasmídeo com HIF-1α expressar e ZEB1 knockdown, e, em seguida, embalada em adenovirus (Ad5-HIF-1α-shZEB1). Uma vez que o nível endógeno de ZEB1 em células HT29 foi muito menor do que em células HCT116 (Figura 3C, à direita), que era consistente com os seus níveis de proteína em nossos dados anteriores [12]. Portanto, as células HCT116 foram designados para realizar todas as experiências ZEB1 knockdown.

In vitro

, as células HCT116 foram transduzidas com Ad5-HIF-1α-shZEB1 e Ad5-HIF-1α, respectivamente . ensaios de borrão, invasão e migração ocidentais foram realizadas após 48 horas. Como mostrado na Fig 5A, expressão de E-caderina foi upregualted e expressão de vimentina foi regulada negativamente acompanhada com o knockdown de ZEB1. Consistentemente, as capacidades de invasão e de migração foram reduzidos em 34% e 45%, respectivamente.

In vivo

, observou-se vários nódulos tumorais na superfície de fígados e H E coloração revelou regiões tumorais basófilos nos fígados de ratinhos injectados com células HCT116-Ad5-HIF-1α. Em contraste, os animais injectados com células HCT116-Ad5-HIF-1α-shZEB1 tinha diminuído dramaticamente cargas tumorais com uma redução no número e tamanho dos ninhos tumorais residuais, acompanhada de necrose mais maciça com a região de inflamação (Figura 5D 5E).

(a) análise de Western blot de ZEB1, e-caderina e vimentina em células HCT116-HIF-1α-shZEB1 HCT116-Ad5-HIF-1α ou. GAPDH foi usada como controlo de carregamento. Invasion (B) Ensaios de Migração e (C) foram realizadas nas mesmas duas linhas celulares. As imagens representativas de células invadidas nas inserções de transpo� câmaras foram mostrados na ampliação original = 200X. *

P Art 0,05. (D) representativos imagens fotográficas e H E de coloração de fígado de ratinhos BALB /c de 5 semanas após a injecção de células HCT116 subsplenic-HIF-1α-shZEB1 HCT116-Ad5-HIF-1α ou. (E) A quantificação dos números médios dos focos metastáticos no fígado de ratos (N = 5). *

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A expressão de HIF-1α, ZEB1, E-caderina e vimentina em amostras de CRC primários e metastáticos

Para avaliar a relação entre HIF-1α, ZEB1 e EMT principais marcadores em tecidos clínicos, IHC coloração foi realizada em 32 pares de amostras de CRC primárias e linfonodo metastático (Fig 6A). A percentagem média de células coradas positivamente para todas as células de tumor em cada tecido foi avaliada independentemente por dois investigadores, tal como descrito em materiais e métodos. Verificou-se que as percentagens de ambas as células de CRC HIF-1α- e ZEB1-positivos eram mais do que 65%, enquanto que a percentagem em linfonodo metastático foi aumentada aproximadamente de 86% para o HIF-1α e 78% para ZEB1 (Fig 6B). Ao mesmo tempo, o nível de vimentina também era bastante elevada em ambos os tecidos primários e metastáticos; apesar de não haver diferença significativa entre os dois grupos. Para o E-caderina, a percentagem de células de tumor-E-caderina positiva no tecido CRC primária foi de cerca de 29%, ao passo que diminuiu significativamente para 12,7% no grupo metastática (Fig 6B). Estes resultados suportam as nossas observações com as linhas celulares de CRC que a expressão HIF-1α foi associado positivamente com ZEB1 e vimentina, e negativamente associados com a E-caderina, e HIF-1α e ZEB1 pode contribuir diferencialmente para EMT e metástase.

imagens representativas de IHC (a) e quantificação de células tumorais positivas (B) em ambas as amostras de CRC primários e o nó de linfa de acordo metastático. ampliação original, 200X. *

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Discussão

Uma das maneiras fundamentais para o tratamento do câncer é a compreensão dos mecanismos moleculares para tumorigênese e metástase do câncer. Neste estudo, que revelou que ZEB1 é um alvo a jusante de HIF-1α e tem um papel crítico na EMT e fenótipos metastáticos induzidas por sobre-expressão de HIF-1α. Propomos que se liga a HIF-1α directamente ao promotor de ZEB1 e serve como regulador positivo crítica, promovendo assim EMT e metástase do cancro. Nossas descobertas descobrir um novo mecanismo pelo qual HIF-1α regula a progressão do tumor e invasão.

HIF-1α expressão é comumente regulada em um monte de tumores malignos, e muitas publicações têm relatado a estreita correlação entre a expressão de HIF-1α eo aumento da agressividade e maior capacidade metastática no ovário, mama, pulmão, próstata, cólon e pâncreas carcinomas [11-14]. Para nível molecular, HIF-1α exerce a sua função biológica através da ativação de genes alvo, tais como Caracol, Twist and TCF3, que são todos associados com EMT e metástase [15-18]. No entanto, é importante para a identidade alvos mais desconhecidos e para revelar a ligação entre a activação do HIF-1α e outros oncogénicos ou supressores de tumores.

ZEB1, um factor de transcrição pró-metastática, está envolvida na progressão do cancro e metástase [ ,,,0],19, 20]. Mecanicamente, a expressão ectópica de ZEB1 é suficiente para regular negativamente E-caderina e para induzir EMT no cancro da mama através da ligação para o e-caixas conservadas no promotor de E-caderina. A função de inibição de ZEB1 em E-caderina promovendo assim EMT também é observada em modelos de xenoenxerto de [8] CRC. Além disso, ZEB1 medeia alterações claudina-1-regulados na invasão celular e na anoikis CRC [21]. Semelhante a ZEB1, Caracol e torção também são importantes fatores de transcrição EMT por silenciar E-caderina através da ligação ao elemento E-box no promotor de E-caderina [22]. Snail foi identificado como um gene alvo de HIF-1α no rato [23]; Torção está diretamente regulados por HIF-1α em carcinoma de cabeça e pescoço de células escamosas (CECP) [18, 24]. Em outras palavras, os que também quer dizer que a via de HIF-1α pode regular a E-caderina repressão, presumivelmente através do caracol ou torção. Assim, devido às capacidades semelhantes de HIF-1α e ZEB1 para induzir EMT e os fenótipos de sobreposição de HIF-1α e ZEB1 em ratinhos nulos, é provável que estes dois genes estão localizados na mesma via para regular a metástase do cancro. Portanto, temos a hipótese de que poderia haver uma forte ligação interactiva entre ZEB1 e HIF-1α. Na verdade, descobrimos que HIF-1α foi capaz de se ligar promotor ZEB1 através HRE-3 e regulada positivamente transactivity ZEB1. Estas descobertas também sugerem que Snail, Twist and ZEB1, os três principais reguladores EMT pode regular EMT e metástases com alguns mecanismos muito semelhantes. Curiosamente, Peinado et al relatou que Caracol, Lesma, ZEB1 e ZEB2 recrutar complexos específicos de remodelação da cromatina suporta uma ligação dinâmica entre a repressão de transcrição e genes epigenética silenciamento de E-caderina durante a progressão do tumor e EMT [25].