Sumário

Dickkopf-1 (DKK1) é um inibidor da via de sinalização /β-catenina Wnt. No entanto, o papel de DKK1 na progressão de cancro de não pequenas células do pulmão (NSCLC) não é completamente compreendido. Neste estudo, a RT-PCR e Western blot foram usadas para examinar a expressão de DKK1 num painel de dez linhas de células NSCLC humanas e tecidos NSCLC. expressão DKK1 foi altamente transactivado na grande maioria destas linhas de cancro. A expressão de DKK1 foi regulada positivamente em ambos os níveis de proteína em tecidos NSCLC em comparação com os tecidos pulmonares normais adjacentes e ARNm. A imuno-histoquímica e imunofluorescência revelou que o DKK1 distribuiu-se principalmente no citoplasma em ambos os tecidos do carcinoma e linhas celulares. a expressão da proteína DKK1 também foi avaliada em parafina de 102 pacientes com NSCLC por imuno-histoquímica, e 65 (63,73%) tumores foram DKK1 positivo. A análise relativa mostrou uma relação significativa entre DKK1 metástase expressão e linfonodo positivo (

P Art 0,05). Os doentes com tumores positivos de DKK1-tinha DFS mais pobres do que aqueles com negativo CICAc (5-anos DFS; 15,4% versus 27%, P = 0,007). Para explorar ainda mais os efeitos biológicos de DKK1 em células NSCLC, que sobre-expressa o DKK1 na célula 95C NSCLC utilizando vector de expressão eucariótica de pCMV-Tab-2b e realizado um knockdown de DKK1 em-um LTEP-2 de células usando um vector de expressão de ARN curta hairpin pSilencer 5.1. DKK1 não têm qualquer efeito sobre a proliferação, mas pareceu desempenhar um papel na capacidade de migração e invasão. Superexpressão de DKK1 promove a atividade migratória e invasiva de 95C, enquanto que DKK1 knockdown resultou na supressão da migração e invasão potenciais de-um LTEP-2 celular. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que o DKK1 pode ser um regulador importante na progressão do NSCLC. DKK1 pode ser um potencial alvo terapêutico em NSCLC

Citation:. Li S, Qin X, Guo X, Cui A, Ele Y, Wei S, et al. (2013) Dickkopf-1 é Oncogênicos e envolvidos no crescimento invasiva em não pequenas células do câncer pulmonar. PLoS ONE 8 (12): e84944. doi: 10.1371 /journal.pone.0084944

editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Abril 2013; Aceito: 19 de novembro de 2013; Publicado: 31 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é uma das neoplasias mais comuns e a incidência está a aumentar [1-4]. Apesar dos avanços na detecção precoce e melhorias no tratamento, a sobrevivência a longo prazo das NSCLC continua a ser insatisfatória. recidiva tumoral e metástase são os principais fatores de influência de prognóstico. Biomarcadores que podem predizer o risco de recorrência e metástase são extremamente urgente. Portanto, é necessário identificar novos alvos que participam na progressão tumoral e de design adequado estratégias de tratamento para doentes com NSCLC.

Dickkopf-1 (DKK1) é uma proteína segregada envolvido na sinalização de Wnt agindo via como um inibidor. No Wnt /β-catenina convencional, Wnt-1 de proteína se liga ao receptor frizzled (FZ) e a lipoproteína de baixa densidade relacionada receptor de sinais /6 (LRP5 /6), desencadeador de proliferação através β-catenina [5 proteína- ,,,0],5,6]. DKK1 se liga a Lrp5 /6 e bloqueia a interacção com Wnt-1, resultando em degradação β-catenina e retardo de proliferação [7-10]. A expressão e os papéis de DKK1 é diferente em vários tipos de câncer, estudos atuais têm relatado que a superexpressão de DKK1 é encontrada em muitos tumores malignos, incluindo o cancro da mama, cancro do pulmão, carcinomas de esôfago e carcinoma hepatocelular (HCC) [11-15], indicando um potencial função oncogénica de DKK1 [16]. Apesar desses estudos, há pouco foi relatado sobre o significado da expressão DKK1 na progressão NSCLC e prognóstico.

Neste estudo, foram analisados ​​pela primeira vez a expressão de um painel de linhas celulares de NSCLC humanas e 102 espécimes ressecados das NSCLC, e explorou a correlação entre a expressão DKK1 e fatores clinicapathological. Posteriormente foram detectados os efeitos biológicos de DKK1 sobre migração e invasão em células de carcinoma do pâncreas cultivadas.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este estudo foi aprovado pelos comitês de ética de segunda Hospital da Universidade de Medicina de Hebei e Tianjin Chest Hospital.All os participantes desde que o seu consentimento informado por escrito para participar neste estudo.

célula de cultura e transfecção

a linha de células A549 andenocarcinoma pulmão e de pulmão grande linha celular NCI-H460 foram adquiridas a partir da ATCC. As linhas de células de pulmão andenocarcinoma SPC-A-1, LTEP-A-2, GLC82 A2 e PC-9; linhagens de células escamosas do pulmão YTMLC-9 e pulmonares grandes linhas de células 95C, 95D são dotados de Tianjin instituto do câncer de pulmão [14]. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA), soro de meio contendo 10% de bovino fetal (FBS, Gibco), 100 UI /ml de penicilina e 100 mg /ml de estreptomicina mantida a 37 ° C em ar humidif içado contendo 5% de CO

2.

As células foram cultivadas até 80% de confluência e transf ectadas com o vector recombinado eucariota e o vector vazio utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, CA, EUA) de acordo com a recomendação do fabricante.

amostras de doentes

neste estudo, foram utilizadas amostras de tecido NSCLC fixados em formol 102 pacientes ‘para a coloração imuno-histoquímica que foram obtidos a partir da segunda Hospital da Universidade de Medicina de Hebei. Dez tecidos frescos de doentes, incluindo NSCLC primária e combinados tecidos normais adjacentes foram obtidos a partir de Tianjin Chest Hospital. Todos os tecidos foram armazenados em azoto líquido antes da utilização. As amostras de tecido foram moídos em azoto líquido, para isolar o ARN total e as proteínas.

plasmídeo construção

O vector de expressão eucariótico pCMV-Tag-2b (Invetrogen) foi reconstruído para expressar DKK1. sequência de 815 pares de bases de comprimento DKK1 (NM: 012.242,2) incluindo

EcoR I

e

BamH I

locais de enzimas de restrição foi amplificado a partir de ADN genómico. As sequências iniciadoras foram: para a frente 5′-TGGATCCATGATGGCTCTGGGCGCAGCGGGAG-3 ‘, reverso: 5′-CGAATTCTTAGTGTCTCTGACAAGTGTGAAGCCTAGAAG-3’. O produto amplificado por PCR foi subclonado no vector pCMV-Tag-2b. O vector recombinante foi designado como pCMV-Tag-2b-DKK1. O vector foi construído por knockdown utilizando um vector de expressão eucariótico pSilencer 5,1 (Ambion). A sequência alvo do gene DKK1 foi 5′-AATAAGTACCAGACCATTGAC-3 ‘, e o vector resultante foi designado como pSilencer-DKK1. A sequência de controlo negativo foi 5’-CTACCGTTGTTATAGGTG-3 ‘. O plasmídeo ARNsi de controlo negativo (pSilencer-NC) codifica um siARN, que não tem qualquer semelhança de sequência significativa com sequências de genes humanos. Todas as seqüências de construção foram projetados de acordo com a linha siRNA alvo localizador de Ambion. A análise da sequência foi realizada para verificar os vetores resultaram.

Western Blotting

Western blot foi realizada para detectar a expressão de DKK1 em amostras de NSCLC ressecados e linhas celulares de NSCLC. As amostras congeladas NSCLC foram moídas em nitrogênio líquido; As linhas celulares foram cultivadas a 80% de confluência e colhidas. As amostras de tecido e as células foram lisadas em tampão de lise RIPA (solução salina tamponada com fosfato contendo 1% de Triton X-100 1 nM e PMSF) a 4 ° C durante 30 min e centrifugou-se a 12,000rpm durante 15 min. A concentração de proteína foi quantificada utilizando o ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL). Quantidades iguais de proteína foram carregadas e electroforese em um gel de SDS-PAGE a 10%, o qual foi, em seguida, transferidos para nitrocelulose membrana (NC). A membrana foi incubada durante 60 min em PBS contendo 0,1% de Tween-20 e 5% de leite desnatado para bloquear qualquer ligação não específica; isto foi seguido por incubação a 4 ° C com anticorpo policlonal de coelho anti-DKK1 humano (tempo de vida, WA, EUA, 1: 500 diluições). A membrana foi lavada três vezes durante 10 min em PBS com 0,1% de Tween-20 e, em seguida, incubadas durante 1 h com HRP-conjugado anti-coelho de bovino (1: 5000 diluições) anticorpo secundário (tecnologia biológica Boster, Wuhan, China) em quarto temperatura. As proteínas immumoreactive foram então detectados utilizando substrato ECL seguindo recomendação do fabricante. β-actina foi utilizada como uma proteína endógena para normalização. IPP software de análise de imagem foi usada para quantificação.

RT-PCR e PCR em tempo real

Para a análise de expressão DKK1 em células NSCLC, o RNA total foi isolado com Trizol. A igualdade de ARNm a partir de cada amostra foi reversamente transcrito em ADNc utilizando iniciadores aleatórios. GAPDH foi usada como controlo interno, as reacções de PCR foram realizadas usando os seguintes iniciadores: DKK1, directo 5′-CAACGCTATCAAGAACCTGC-3 ‘, reverso 5′-GATCTTGGACCAGAAGTGTC-3′; GAPDH, Atacante 5’-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3 ‘, Reverse 5′-TGGXGTGTGAACCACGAGAA-3’. A PCR foi optimizada para o número de ciclos para assegurar a intensidade do produto para estar dentro da fase linear da amplificação, os produtos de PCR foram então analisados ​​por electroforese em gel de agarose a 2%.

-PCR em tempo real foi realizado utilizando SYBR

® verde (Código DRR041A, Takara) num volume total de 30 uL sobre um ciclos de dois passos utilizando o seguinte protocolo de temperatura: 10 seg a 95 ° C seguido por 42 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 55 ° C por 30s. As reacções foram colocadas numa placa de 96 poços (ABI) utilizando um instrumento em tempo real pré-aquecido (ABI 7500HT). Os níveis relativos de expressão foram quantificados e analisados ​​utilizando o software Bio-Rad iCycler iQ. Três experiências independentes foram realizadas para analisar a expressão dos genes relativos e cada amostra foi testada em triplicado. Os valores Ct foram usados ​​para calcular a expressão dos níveis de ARNm. A quantidade de expressão do gene alvo (2-Ct) foi normalizada utilizando a referência endógena GAPDH, a montante do gene-alvo na amostra de controlo foi definido como o calibrador a 1,0. As sequências dos iniciadores utilizados para PCR em tempo real foram listados na Tabela S1.

ensaio de proliferação

ensaio MTT foi utilizado para analisar a proliferação celular. Após 24 horas da transfecção, as células foram semeadas em placa de 96 poços a 5,0 x 10

3 células /ml e cultivadas durante 24 h, 48 h, 72h e 96h, respectivamente. Em cada ponto de tempo, 10 ul de reagente MTT (5 mg /ml, Sigma) foi adicionado a cada poço, e incubou-se durante 4h a 37 ° C. 200 ul de DMSO (Invitrogen) foi adicionado para dissolver os cristais de formazano durante 30 min após o descarte do sobrenadante. espectrometria de absorvância foi medida a um comprimento de onda de 490 nm no leitor de microplacas (Spectra Max M5, MD, EUA). Para garantir os resultados Cada amostra foi testada em triplicado e todas as experiências foram realizadas três vezes.

Cicatrização de feridas ensaio

A capacidade de migração foi determinada utilizando o ensaio de cicatrização. As células equivalentes foram plaqueadas em placas de 12 poços sem antibióticos. Após 24 horas da transfecção, as células foram feridas com uma ponta de micropipeta de plástico estéril 100 ul, e os detritos flutuantes foram lavadas com PBS e cultivadas em meio isento de soro. Largura da ferida foi medida a diferentes pontos de tempo. 3-4 locais diferentes foram visualizados e fotografados em um microscópio invertido de contraste de fase (40 × objetiva, TE2000-E, Nikon, Japão).

Boyden ensaio de câmara

ensaio de câmara de Boyden foi usada para examinar a capacidade de invasão de células. As células foram transfectadas com lipofectmine 2000. Após 16 horas, as células foram tripsinizadas e ressuspensas. 5,0 × 10

4 células em 300 ul de meio RPMI-1640 foram colocadas no compartimento superior (tamanho de poro de 8 uM; BD Biosciences). As câmaras inferiores foram cheias com 500 ul de meio completo com 10% de FBS. Após incubação durante 48 horas a 37 ° C, as células na superfície superior do filtro foram removidas com um cotonete. As células migratórias na superfície inferior das inserções foram fixadas e coradas com violeta de cristal a 0,1% durante 30 min a 37 ° C e lavadas duas vezes com PBS. As células coradas foram depois visualizadas sob um microscópio e o número de células foi contado em cinco campos aleatórios (ampliações 100 ×). câmara de Boyden foram realizados em duplicado em duas experiências separadas.

A imuno-histoquímica e imunofluorescência

Para investigar o estado da proteína DKK1 em amostras de NSCLC clínicos que tinham sido incluídas em blocos de parafina, IHC coloração foi realizada de acordo com o procedimento seguinte. As secções de parafina foram desparafinados com xilol e reidratados em soluções de etanol classificados. Actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com 3% H

2O

2 durante 15 min à temperatura ambiente e, em seguida, as secções foram aquecidos com 0,01 M de citrato (pH = 6,0) a 95 ° C durante 15 minutos em micro-ondas para a recuperação de antigénio . Após incubação com anticorpo anti-DKK1 policlonal de coelho (ab22827, Inc Abcam, Cambridge, MA, diluição 1: 200) durante 2 h à temperatura ambiente, controlos negativos sem o anticorpo primário. As secções foram incubadas com o anticorpo secundário IgG marcado com HRP anti-coelho. A intensidade da coloração de DKK1 foi avaliada utilizando os seguintes critérios [12,14]: fortemente positivo (2+), coloração castanha escura 50% de células tumorais no citoplasma; fracamente positivo (1+), qualquer menor grau de coloração marrom nas células tumorais; ausente (pontuada como 0), imunorreactivos com DKK1 10% ou menos do que as células tumorais. As pontuações foram avaliadas por dois patologistas sem conhecer os dados clínico-patológicos.

TE13 células foram cultivadas em lamelas de vidro, que foram então fixadas com paraformaldeído a 4% e permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 10 min a sala temperatura. As células foram subsequentemente bloqueadas com 3% de BSA durante 30 min à temperatura ambiente, e, em seguida, incubadas com anticorpos primários diluídos em PBS contendo 3% de BSA durante 60 min à temperatura ambiente. Depois de ter sido lavada com PBS, as células foram coradas com anticorpo secundário conjugado com FITC (Santa Cruz Biotechnology) durante 30 min a 37 ° C. Finalmente, as lamelas foram lavadas com PBS e os núcleos foram montadas com DAPI e visualizados com microscópio confocal de varredura a laser.

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada com o software SPSS 10.0. Os dados são apresentados como a média ± DP. Foram utilizados o teste t de Student e análise unidireccional da variância. As relações entre as variáveis ​​agrupadas foram analisadas pelo teste do qui-quadrado. As curvas de sobrevivência foram produzidos de acordo com o método descrito por Kaplan e Meier. As diferenças entre as curvas foram estimadas usando testes de log-rank. Os valores P 0,05 foram considerados significativos. Todas as experiências foram realizadas pelo menos em triplicado [15].

Resultados

DKK1 expressão em linhas de células NSCLC humanas cultivadas

A expressão de DKK1 foi caracterizado por um número de humano linhas celulares de NSCLC. proteína DKK1 foi detectável em todas as linhas de células (Figura 1). expressão mais elevada foi observada nas linhas celulares LTEP-A-2 e GLC-82. expressão mais baixa foi observada em linhas de células de cancro A2 e 95C. a expressão de ARNm de DKK1 também foi examinada por meio de RT-PCR, os resultados foram consistentes com os resultados de Western blot (Figura 1 B). A localização subcelular de expressão de DKK1 na linha de células NSCLC foi definido por coloração imunofluorescente. Os resultados mostraram que a expressão de DKK1 foi distribuída principalmente no citoplasma com um aspecto granular (Figura 1 C).

(A) Expressão de DKK1 no nível de ARNm (RT-PCR: 28 ciclos de amplificação). ARNm de GAPDH foi usada como um controlo interno. (B) Expressão de DKK1 no nível da proteína. β-actina foi utilizada como controlo interno. (C) localização subcelular da proteína DKK1 endógena na célula de NSCLC. DKK1, corado com rodamina B, estava no citoplasma da célula que aparece material de grão fino. núcleo da célula apareceu como fluorescência azul coradas com DAPI (ampliação de 100 ×).

DKK1 Expressão em tecidos NSCLC

Para examinar a expressão da proteína DKK1 em NSCLC, seções 102 pacientes com NSCLC de parafina foram avaliados por análise imuno-histoquímica. Destes, 46 (45,1%) mostraram forte expressão DKK1 positiva, principalmente no citoplasma das células tumorais, com uma distribuição granular castanho escuro. 19 (18,63%) amostras foram expressão positiva fraca com partículas amarelo pálido. enquanto os restantes 37 (36,27%) foram negativos. A taxa total de coloração positiva foi 63,73%. Em contraste, nenhum dos epitélio normal mostrou nível significativo de coloração imuno-histoquímica (Figura 2A). Analisamos ainda mais a correlação entre a expressão DKK1 e os parâmetros clínico; é interessante notar que as expressões de DKK1 positivos foram acompanhados principalmente com metástases dos gânglios linfáticos (Tabela 1). A sobrevivência (5 anos DFS) taxa livre de doença total de 5 anos de pacientes com DKK1-negativo foi de 27%, enquanto os pacientes com tumores DKK1-positivos mostraram DFS mais pobres do que aqueles com tumores negativos (5 anos DFS; 15,4% versus 27%, P = 0,007) (Figura S1). Estes resultados indicam que a sobre-expressão de DKK1 é um evento frequente em NSCLC humana, que pode ter uma relação potencial para a metástase do NSCLC.

(A) Expressão por coloração imuno-histoquímica. forte expressão positiva DKK1 no cancro do pulmão que mostra a coloração principalmente no citoplasma das células tumorais (ampliação de × 100). câncer pulmonar positiva DKK1 representante fraco com partículas amarelo pálido em células tumorais (ampliação de 100 ×). células de câncer de pulmão negativo DKK1 mostrando quase nenhuma mancha apreciável de células tumorais (ampliação de 100 ×). tecido pulmonar normal sem coloração. (B) Expressão de ARNm em tecidos de DKK1 NSCLC e tecidos pulmonares normais correspondentes. (C) A expressão da proteína de DKK1 em tecidos NSCLC e tecidos pulmonares normais correspondentes. N, tecido normal; T, o tecido do tumor. expressões positivas de DKK1 foram acompanhados principalmente com metástases em linfonodos.

Parâmetros

n

expressão DKK1

χ

2

P

value

Positive(%)

Negative(%)

Age(years) 606439(60.9%)25(39.1%)0.5780.2940 ≥603826 (68,4%) 12 (31,6%) GenderMale8151 (63,0%) 30 (37,0%) 0.0990.4820 Female2114 (66,7%) 7 (33,3%) DifferentiationWell3221 (65,6%) 11 (34,4%) 0.0640.8003

*

Moderate4327 (62,8%) 16 (37,2%) Poor2717 (63,0%) 10 (37,0%) TT1117 (63,6%) 4 (36,4%) 0.12130.7276

**

T23623(63.9%)13(36.1%)T31824(66.7%)12(33.3%)T41911(57.9%)8(42.1%)N(Metastasis)Positive(N1+N2)5447(87.0%)7(13.0%)26.9760.0000 Negativo (N0) 4818 (37,5%) 30 (62,5%) Tabela 1. Correlação entre DKK1 e vários parâmetros clínico

*

Bem grupo vs. moderada;

**

T3 vs. T4.

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A seguir, observada a expressão de DKK1 em tecidos NSCLC cirurgicamente ressecados e tecidos normais correspondentes. Entre os 10 casos de NSCLC, 7 mostraram expressão significativamente regulada positivamente de ARNm de DKK1 no tecido de cancro em comparação com o tecido normal (Figura 2B) correspondente. resultados de Western blot mostrou a mesma tendência em nível de proteína DKK1 (Figura 2C).

Efeito da DKK1 superexpressão sobre migração e invasão em 95C

Para testar o papel biológico de DKK1 na célula NSCLC, nós examinou a consequência da superexpressão de DKK1 na migração celular e capacidade de invasão na linha de células 95C, que realmente tem um nível muito baixo de DKK1 endógeno. Eucariótica vector de expressão pCMV-Tag-2b-DKK1 foi construída para sobre-expressar o gene DKK1. Um aumento significativo nos níveis de ambas as proteínas de DKK1 e ARNm foi observada em linha de células de 95C transfectadas com pCMV-Tag-2b-DKK1 em comparação com o controlo em branco e o controlo negativo (Figura 3 A). Subsequentemente, ensaio MTT revelaram que a sobreexpressão de DKK1 não alterou a capacidade de proliferação de células (dados não apresentados). No entanto, a capacidade de migração foi promovida na cicatrização de feridas de ensaio (Figura 3 B e C). câmara de Boyden foi utilizado para testar a capacidade de invasão, célula 95C foram transfectadas com qualquer dos grupos de controlo em branco pCMV-Tag-2b-DKK1 ou pCMV-Tag-2b, e foi adicionado o reagente de transfecção sem plasmídeo. Após transfecção 18 horas, as células foram re-semeadas em cima da peça inserta. As células que invadiram através da barreira e alcançou o outro lado da câmara de inserção foram registados após 48h de incubação. Resultados da câmara de Boyden mostrou que as células que passaram através da membrana no grupo pCMV-Tag-2b-DKK1 foi maior do que os outros dois grupos (Figura 3 D). Estas observações indicam que a superexpressão de DKK1 podem promover significativamente a capacidade de invasão das células 95C (Figura 3. E).

(A) RT-PCR e análise por Western blot da expressão de DKK1. nível de DKK1 na célula 95C transfectadas com pCMV-Tag-2b-DKK1 é significativamente mais elevada do que em pCMV-Tag-2b e grupo de controlo em branco. (B) As células 95C feridos e curativas. (C) A medição da distância de migração (*

P Art 0,05). (D) A capacidade invasão de 95C transfectadas com pCMV-Tag-2b-DKK1 foi significativamente reforçada. (E) O número de células que migram através dos filtros de Matrigel-revestido foi analisada estatística. Os ensaios foram feitos em poços em triplicado (*

P

0,01).

Knockdown de DKK1 endógeno, através de siRNA diminuiu migração e invasão em LTEP-A-2

Foram analisados ​​os efeitos da DKK1 knockdown sobre migração e invasão in-a LTEP-2 linha celular . Para determinar a eficácia do knockdown shRNA, o nível DKK1expression em linhas-A-2 LTEP de células foi examinada por tanto por RT-PCR e Western blot. O siRNA específico reduzido eficazmente a expressão endógena de DKK1 nas células que foram transfectadas com pSilencer-DKK1 em comparação com as células que foram transfectadas com vector pSilencer-NC (Figura 4 A).

(A) RT- PCR e análise Western blot da expressão DKK1. nível DKK1 in-a LTEP-2 de células transfectadas com pSilencer-DKK1 é significativamente menor do que no grupo controle em branco pSilencer-NC e. (B) As células feridos e curativas LTEP-a-2. (C) A medição da distância de migração (*

P Art 0,05). (D) A capacidade de invasão LTEP-A-2 transfectadas com pSilencer-DKK1 foi significativamente reprimido. (E) O número de células que migram através dos filtros de Matrigel-revestido foi analisada estatística. Os ensaios foram feitos em poços em triplicado (*

P

0,01).

knockdown de DKK1 endógena por siARN não afectou LTEP-A-2 proliferação (dados não mostrados), mas reprimida significativamente a capacidade de migração no ensaio de cicatrização de feridas. A taxa de migração de células pSilencer-DKK1 na cicatrização de feridas era significativamente inferior 48 h após a transfecção do que a do grupo de controlo em branco (Figura 4 B, C) e pSilencer-NC. Quando cultivadas em câmara de Boyden, o número de células que migraram através dos filtros porosos de Matrigel-revestidos foi significativamente reduzida em células de knockdown pSilencer-DKK1 DKK1 em comparação com pSilencer-NC e grupo de controlo em branco (Figura 4. D, E).

a sobre-expressão de DKK1 expressão alterada de genes associados

para explorar o mecanismo de DKK1 na progressão do cancro do pulmão, PCR em tempo real foi efectuada para detectar o efeito de sobre-expressão de DKK1 na expressão de genes envolvidos na carcinogénese relativos. A sobre-expressão de DKK1 não alterou a expressão de proteínas relacionadas com o ciclo celular e proteínas relacionadas cyclinD1 apoptose Bcl-2 e da caixa. Akt-1 associado a via de sinalização foi minimamente regulada na célula 95C transfectadas com pCMV-Tag2b-DKK1. A expressão de MMP2 e VEGFC na célula 95C transfectadas com pCMV-Tag2b-DKK1 foi aumentado 7,78 vezes e 2,13 vezes em comparação com o controle 95C células respectivamente (Tabela S2).

Discussão

a família de proteínas DKK humano é composto de DKK1, DKK-2, DKK-3, DKK-4 e uma proteína relacionada com DKK3 único, denominado empapado [17]. DKK1, que codifica uma proteína segregada, é um antagonista de sinalização /β-catenina Wnt que está envolvido em progressão tumoral [13,18-22]. DKK1 é expresso em numerosos cancros humanos; pode desempenhar diversas funções biológicas em células tumorais, dependendo do tipo de célula envolvida. DKK1 é regulada positivamente em alguns tipos de tumores humanos, incluindo NSCLC, carcinoma hepatocelular, cancro pancreático [12,14,19,23]. Parecia que o DKK1 pode desempenhar papéis cruciais durante a progressão destes tipos de tumores, mas os efeitos biológicos de DKK1 em NSCLC não foram clarificados. Neste estudo, confirmou-se que o DKK1 é expressa num painel de linhas celulares de NSCLC. Immunoflouresence mostrou que o DKK1 expressão localização subcelular foi distribuída principalmente no citoplasma das células NSCLC. O estudo IHC de expressão DKK1 em 102 NSCLC espécimes secções revelou que a expressão positiva de DKK1 está correlacionada com metástases dos gânglios linfáticos; que poderia ser um preditor de metástase do câncer. Em relação ao prognóstico, expressão positiva da proteína DKK1 correlacionada com uma sobrevivência de 5 anos sombrio. DKK1 é regulada positivamente em tecidos NSCLC em comparação com os tecidos normais correspondentes. Por isso, é possível que o DKK1 está envolvida na progressão de NSCLC.

DKK1 é uma proteína segregada que contém uma sequência de péptido de sinal e dois domínios e funções ricos em cisteína como um regulador negativo da sinalização de Wnt [6, 7]. Além disso, DKK1 foi relatado para ser um alvo a jusante do fator β-catenina /de células T e participa de um ciclo de feedback negativo na sinalização Wnt em células cancerígenas do cólon [24,25]. Os estudos têm indicado que a superexpressão de DKK1 foi associada com mau prognóstico [14,19,21], embora pouco se sabe sobre a função de DKK1 em NSCLC. Para estudar ainda os efeitos biológicos de DKK1 em ivtro, em primeiro lugar, verificou-se que a sobre-expressão de DKK1 promove a migração e invasão na linha de células NSCLC humana 95C. Enquanto isso, a sobre-expressão de DKK1 regulada positivamente a expressão de proteínas relacionadas com metástases, mas o mecanismo detalhado precisam ser mais estudo. Além disso, usando a expressão eucariótica de DKK1 shRNA, mostrámos que knockdown de DKK1 suprime a migração e invasão da linha de células NSCLC resultados LTEP-A-2.O indicam que o DKK1 pode ter um papel positivo na progressão do NSCLC, mas o mecanismo envolvido na invasão precisa de estudar ainda mais.

No entanto, alguns estudos têm relatado que DKK1 suprime o crescimento ea migração celular [16,26], que sugere que pode haver outros papéis de DKK1 na sinalização /β-catenina Wnt. DKK1 pode desempenhar diversas funções biológicas em diferentes tipos de células cancerosas. Uma análise retrospectiva de expressão DKK1 mostrou que DKK1 foi alterada durante CaP progressão [27]. Até o momento, poucos estudos têm sido relatados sobre os papéis de DKK1 em NSCLC, principalmente focando os valores diagnóstico e prognóstico [12,21,28-30]. O papel do DKK1 em NSCLC, o seu mecanismo de funcionamento e aspectos clínicos são necessários mais estudos.

Em resumo, embora a função detalhada de DKK1 na progressão NSCLC não está bem esclarecida, os nossos resultados sugerem que os potenciais papéis de DKK1 na promoção da migração e crescimento invasivo em linhas celulares de NSCLC, e que poderia servir como um novo alvo terapêutico para NSCLC.

Informações de Apoio

Figura S1.

curva de sobrevivência livre de doença classificada de acordo com a expressão DKK1 para todos os pacientes por métodos desenhados de Kaplan-Meier.

doi: 10.1371 /journal.pone.0084944.s001

(TIF)

Tabela S1.

sequência de iniciadores utilizados para a PCR em tempo real.

doi: 10.1371 /journal.pone.0084944.s002

(DOC)

Tabela S2. expressão

diferencial de genes em 95C transfectadas com pCMV-Tag2b-DKK1 em relação a 95C transfectadas com pCMV-Tag2b.

doi: 10.1371 /journal.pone.0084944.s003

(DOC)