Abstract

Fundo

Human cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) pacientes exibem uma alta propensão para desenvolver metástase óssea, resultando em actividade lítica excessiva. O RANK /sistema RANKL /OPG, que desempenha um papel fundamental na remodelação óssea regulando a formação de osteoclastos e atividade, é de potencial interesse neste contexto.

Materiais e Métodos

A transcriptase reversa em cadeia da polimerase reacção, transferência de western, imuno-histoquímica e análise foram utilizados para examinar a expressão de RANKL, RANK, e OPG em linhas de células humanas NSCLC com diferentes potenciais metastáticos, assim como em 52 amostras de NSCLC primária e 75 amostras de metástases ósseas NSCLC. Em doentes com NSCLC primária, a expressão destas proteínas foi correlacionada com os parâmetros clínico. cDNA RANKL recombinante RANKL humana e transfectadas foram adicionados à linha de células paa avaliar a ação do promotor de RANKL durante o processo de metástase

in vitro

e

in vivo

.

resultados

Up-regulada RANKL, RANK, e expressão OPG e aumento da RANKL: razão OPG foram detectados em linhagens de células NSCLC e em tecidos tumorais com metástase óssea e foram correlacionados com maior potencial metastático. O potencial metastático das NSCLC

in vitro

e

in vivo

, incluindo a migração ea capacidade de invasão, foi significativamente reforçada pelo RANKL humana recombinante e a transfecção de cDNA RANKL, e foi alterado após foi adicionado OPG . O aumento da expressão de RANKL e OPG correlacionados com o estágio do tumor, metástase linfonodal e metástases à distância.

Conclusões

A expressão diferencial de RANKL, RANK e OPG está associada com o potencial metastático humano NSCLC de esqueleto, levantando a possibilidade de que a RANK /RANKL sistema /a OPG pode ser um alvo terapêutico para o tratamento de doentes com NSCLC metastáticos

citação:. Peng X, W Guo, Ren t, Lou Z, X Lu , Zhang S, et al. (2013) a expressão diferencial da RANKL /RANK /OPG sistema está associado com metástase óssea in Human Non-Small Cell Lung Cancer. PLoS ONE 8 (3): e58361. doi: 10.1371 /journal.pone.0058361

editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de julho de 2012; Aceito: 06 de fevereiro de 2013; Publicação: 13 de março de 2013

Direitos de autor: © 2013 Peng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (No. 30973020 e 81001193). https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

não-pequenas de câncer de pulmão de células (NSCLC) é o tumor maligno mais comumente diagnosticado e a principal causa de mortes relacionadas ao câncer em populações asiáticas e ocidentais, com mais de 150.000 pessoas esperadas para morrem anualmente desta doença [1] . O esqueleto representa o local mais comum de metástases tumorais. Cerca de 9% a 30% dos pacientes com cancro do pulmão desenvolvem metástases ósseas, que levam a uma morbilidade significativa da compressão da medula espinal, as fracturas patológicas, e da dor intratável [2], [3]. Apesar da alta taxa de metástase, os mecanismos moleculares subjacentes que regulam a capacidade das células de câncer de pulmão a proliferar e invadir continuam a ser mal compreendido, e as modalidades de tratamento bem sucedidos são ainda imperceptíveis.

Para desenvolver tratamentos eficazes para a metástase óssea, é necessários para esclarecer os mecanismos moleculares subjacentes alterações induzidas pelo tumor no microambiente ósseo. Normalmente, existe um equilíbrio intimamente coordenada na qual mediada pelos osteoclastos de reabsorção óssea e a formação óssea mediada por osteoblastos neutralizar e contribuem para a remodelação da estrutura óssea constante [4]. Quando o câncer de pulmão metástase para os ossos, rompimento desse equilíbrio pode levar ao aumento da reabsorção óssea, resultando em atividade osteolítica excessiva e doença esquelética consequente [5].

Relatórios recentes trouxeram à luz um novo sistema receptor-ligante pertencente para o factor de necrose tumoral (TNF) superfamília: o activador do receptor do factor nuclear (NF) -KB (RANK), o seu ligando (RANKL), e a proteína osteoprotegrin (OPG) [6], [7]. RANKL, uma proteína ligada à membrana expresso principalmente sobre a superfície dos osteoblastos e células do estroma da medula óssea, se liga a RANK na superfície de precursores de osteoclastos, estimular a sua diferenciação em osteoclastos maduros [8] – [10]. OPG, um receptor de engodo de RANKL que é também produzido por células de osteoblasto /estroma, pode evitar a destruição óssea, bloqueando a ligação entre a RANKL e Rank, inibindo assim a diferenciação e activação de osteoclastos [6], [11]. A desregulação do sistema de RANKL /RANK /OPG foi detectado em vários tumores, tais como cancro da mama [12], [13], o cancro da próstata [14], tumores ósseos malignos (por exemplo, mieloma múltiplo, tumores de células gigantes ósseo, e condroblastoma) [15] – [17], carcinoma de células escamosas [18], e doença de Hodgkin [19]. Estudos anteriores demonstraram que a RANKL é necessário para o desenvolvimento de lesões osteolíticas no osso [20]. Além disso, através do bloqueio da interacção de RANKL-RANK, lesões osteolíticas foram inibidos com sucesso em vários tipos de cancro, incluindo do mieloma múltiplo e o cancro da próstata [21] – [23].

No cancro do pulmão, o RANKL /sistema RANK /OPG foi detectada tanto na presença como na ausência de metástases ósseas. elevados níveis séricos de RANKL solúvel e OPG foram relatados em pacientes com câncer de pulmão com metástases ósseas [24]. Recentemente, foi relatado que a RANKL também provoca a migração de células tumorais humanas que expressam RANK [25]. Além disso, RANK-Fc, uma proteína quimérica que inibe a interacção de RANK-RANKL, foi comprovado resistir a osteoclastogénese [26]. Por conseguinte, os autores sugerem que a expressão de RANKL /RANK /OPG pode estar correlacionada com a progressão NSCLC. Neste estudo, a expressão de RANKL, RANK, e OPG foram examinados em várias linhas celulares de cancro do pulmão humano com diferentes potenciais metastáticos. ADNc de RANKL recombinante RANKL humana transfectada e foram adicionados a uma linha de células NSCLC para avaliar a acção promotora de RANKL no processo de metástase. A análise imuno-histoquímica foi levada a cabo para avaliar a expressão de RANKL, RANK, e OPG em tumores NSCLC primários, bem como em tecidos ósseos metastáticos de NSCLC. Expressão destas proteínas foi correlacionada com os parâmetros clínico de NSCLC primária.

Materiais e Métodos

Os pacientes

O presente estudo investigou amostras de biópsia cirúrgica de 127 pacientes com NSCLC, incluindo 52 casos de NSCLC recém-diagnosticados e 75 casos de metástase óssea do NSCLC. Todos os pacientes foram tratados no Hospital Popular Universidade de Pequim e recebeu nenhuma terapia no momento da coleta da amostra. dados clínicos detalhados em relação a esses pacientes é apresentado na Tabela 1. Pacientes O NSCLC foram encenadas de acordo com a classificação da American Thoracic Society TNM, e classificados histologicamente como quer bem, moderado ou pouco diferenciado. O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Boards, do Hospital Peking University Pessoas. As comissões de ética aprovou este procedimento. O consentimento informado para o uso experimental de espécimes cirúrgicos foi obtido de todos os pacientes em forma escrita de acordo com as diretrizes éticas do hospital.

cultura de células e reagentes

linhas celulares de cancro do pulmão humano PG- BE1, PG-LH7 e PAA foram adquiridos no Instituto de Patologia, Universidade de Pequim Saúde Science Center (Pequim, China). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco, NY, EUA) suplementado com soro fetal bovino a 10% (FBS; Gibco). As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2. RANKL proteína humana recombinante e OPG foram adquiridos de Prospec Biotechnology Inc. (Prospec, Ness-Ziona, Israel, Cat No: CYT-334 e CYT-633). Anticorpos produzidos contra RANK, RANKL e OPG foram adquiridos da Abcam Inc. (Abcam, MA, EUA, Cat No: ab12008, ab9957 e ab73400). β-actina anticorpo foi adquirido a partir de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, EUA, Cat No: sc-130065).

Animais

Seis semanas de idade imunodeficientes combinados graves masculino ( SCID) pesando 20-25 g foram utilizados para este estudo. O estudo animal foi aprovado pelos Institutional Review Boards, do Hospital Peking University Pessoas. Os animais foram obtidos a partir do Centro de Pesquisa Modelo Animal da Universidade de Pequim Centro de Ciências da Saúde, alojados em condições livres de patógenos, de acordo com as diretrizes do NIH, usando um protocolo de animais aprovado pelo Comitê Animal Care e Use na faculdade.

RT-PCR quantitativo e em tempo real, PCR

O ARN total foi extraído a partir do PG-BE1, PG-LH7, e células PAA por um método de um único passo usando o reagente TRIzol (Invitrogen, La Jolla, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante, e o RNA foi subsequentemente transcrito de forma inversa em ADN complementar. Os iniciadores específicos utilizados para a amplificação de DNA encontram-se resumidos na Tabela 2. O produto de PCR amplificado foi fraccionado através de electroforese em gel de agarose a 1,5%, fotografados sob luz ultravioleta, e analisados ​​por densitometria. Quantitative PCR em tempo real foi realizada em um Prism7300 Sistema de Detecção de Sequência ABI (Applied Biosystems, Beverly, MA, EUA), utilizando um kit de A6001 GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, EUA). O perfil térmico era de 95 ° C durante 15 min, seguido de 40 ciclos de 95 ° C durante 15 s e 58 ° C durante 30 s. A expressão de ARNm de RANKL /RANK /OPG foi analisado utilizando o 2

– o método (ΔΔCt) (linha de células de PAA como um calibrador) com base em valores de Ct para ambos os genes-alvo e de referência. A quantidade de cada transcrito foi normalizado contra uma quantidade conhecida da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH) e β-actina. Cada experiência foi realizada em triplicado. Os resultados da análise por PCR em tempo real são dadas como média ± o erro padrão da média (SEM). parcelas de dissociação térmicas foram examinados para curvas de fusão bifásicos, que indica se dimeros de iniciadores ou outros produtos não específicos podem estar contribuindo para o sinal de amplificação.

análise de Western blot

análise de Western blot foi realizados como previamente descrito [27]. Resumidamente, as proteínas foram separadas num gel desnaturante de poliacrilamida a 10% e transferidas para uma membrana de PVDF. imunoblots individuais foram realizados com anticorpos primários criados contra RANK (1:500), RANKL (1:1000), OPG (1:500), e β-actina (1:1000). As membranas foram bloqueadas em TBS-T contendo 5% de leite seco sem gordura, e em seguida incubadas durante a noite com anticorpo primário. Em seguida, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano (Santa Cruz, CA, EUA) durante 1 h. reagente ECL (GE Healthcare, New Jersey, EUA) foi utilizado para detecção da proteína. Cada experimento foi realizado em triplicado.

Imunohistoquímica

reagiram secções de parafina com policlonais de coelho anticorpos anti-RANKL (1:500 diluição), anticorpos anti-RANK rato policlonais (1:200 diluição) ou anticorpos anti-OPG de coelho (1:100 diluição), tal como descrito anteriormente [27]. Secções coradas com coelho não imune ou soro de ratinho (diluição 1:200) em solução salina tamponada com fosfato (PBS) em vez de anticorpo primário serviram como controlos negativos. Para avaliar a RANKL, RANK, e coloração OPG, as células cancerosas que apresentam coloração positiva nas membranas celulares e no citoplasma foram contados em pelo menos 10 campos representativos (400 × ampliação) e foi calculada a porcentagem média das células cancerosas positivas. Casos em que a proporção de células cancerosas positivas foi ≥50% foram definidos como positivo, e aqueles contendo células cancerosas positivas 50% foram definidos como negativos. A imunocoloração foi avaliada por dois patologistas independentes cegos para características clínicas e resultados.

análise de imagem assistida por computador da imuno-histoquímica

A marcação de todos os anticorpos foi analisada quantitativamente utilizando um sistema de análise de imagem assistida por computador . Resumidamente, as imagens de secções coradas foram capturadas com uma câmera digital Leica e processados ​​usando o Image Pro Plus análise de software (versão 6.0; Media Cybernetics, Rockville, MD, EUA). O limiar foi estabelecido através da determinação da coloração positiva das secções de controlo e foi utilizado para analisar automaticamente todas as imagens gravadas de todas as amostras que foram coradas na mesma sessão sob condições idênticas. A área das regiões imunocoradas foi calculado automaticamente pelo software em cada campo microscópico. contagens de pixel do produto de imunorreacção foram calculados automaticamente e foram dadas como a densidade total da imunocoloração integrada sobre uma determinada área das secções. Isto reflecte a quantidade relativa de proteínas detectadas pelos anticorpos nas secções de tumores. A proporção de RANKL /OPG foi calculado a partir densidades imunocoloração integrados de RANKL e OPG em cada grupo

cDNA RANKL transfecção

Full-length cDNA RANKL humana. (RefSeq: NM_033012.2) foi inserido no vector eucariótico pCMV6-XL5 (adquirido a partir de OriGene Technologies, Inc., Cat no: SC305532). células PAA foram transfectadas com o plasmídeo recombinante ou vector sozinho (transfectantes simulados) utilizando o reagente Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA, EUA) como descrito pelo fabricante, e cultivadas em RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% e 500 ug /ml de G418 (Amresco, OH, EUA). transfectantes RANKL estáveis ​​(chamados PAA-RANKL) e transfectantes trocistas (chamado PAA-simulada) foram criados e mantidos em RPMI1640 suplementado com 10% FBS e 250 ug /ml de G418.

In vitro

migração e invasão ensaios

ensaios de migração e invasão foram realizados por inoculação de 3 × 10

5 células em 200 ul RPMI1640 em cima de inserções de cultura de células Transwell contendo uma membrana de polietileno tereftalato de pré-revestidas com ou sem Matrigel ( inserções de 24 poços, 8,0 uM de tamanho de poro; Coster, Corning Inc., Corning, NY, EUA). A câmara inferior foi cheia com 0,8 ml de RPMI 1640, com ou sem a RANKL humana recombinante adicionada e com ou sem a OPG recombinante humana. Após incubação durante 24 h, as células não-migração foram raspadas e as membranas foram fixados e corados usando o kit corante Diff-Quik (Sysmex Co., Hyogo, Japão). As células que migraram através das membranas foram quantificados por determinação do número de células em três campos visuais escolhidos aleatoriamente em 200 × ampliação.

implantação Tibial de células de câncer de pulmão

Um modelo de injeção intratibial murino de metástases ósseas foi usada para criar lesões ósseas neste estudo [28] – [30]. As células do cancro do pulmão (5 × 10

5 células) foram suspensos em 10 ul de 1% PBS e misturada com 10 ul de matrigel (biociências BD , San Jose, CA) para cada injecção tibial. 20 ul da mistura de células e de matrigel foi injectada na região proximal da tíbia de ratinhos SCID de 6 semanas de idade, tal como publicado anteriormente [29], [31]. Resumidamente, os ratos foram anestesiados utilizando isoflurano (1,5-2%) e de oxigénio. A pele que recobre foi preparado de forma estéril com 70% de etanol e betadine. Uma incisão longitudinal de 3 mm foi feito sobre o ligamento patelar com uma lâmina de bisturi número 12, e depois de uma incisão longitudinal de 2 mm foi feito ao longo da borda medial do ligamento patelar ao planalto tibial. Uma agulha de calibre 26 de 1/2 foi introduzido através do planalto tibial proximal e 20 uL de células de cancro do pulmão e mistura Matrigel foi injectada na cavidade medular. A ferida foi fechada com um único 5-0 Vicryl (Ethicon Inc.).

grupos de estudo animal

Neste estudo, cinquenta ratos SCID macho foram submetidos ao implante tibial com células de câncer de pulmão e foram igualmente divididos em cinco grupos de estudo. Grupo I (PAA) os animais receberam injeção intratibial de células PAA sozinho. Grupo II (PAA-Mock) tíbias recebeu células PC-3 que foram transfectadas com um vector vazio de controlo para a transfecção. Grupo III (PAA-RANKL) os animais receberam células de PAA que foram transfectadas com um vector sobre a expressão de ADNc de RANKL. Tíbias no Grupo IV (PAA-RANKL + OPG) foram implantados com células e animais PAA-RANKL foram tratados posteriormente com OPG. OPG foi usado numa dose de 10 mg /kg dissolvidos em 100 ul de tampão de fosfato salino (PBS) e foi injectada por via subcutânea três vezes por semana a partir do dia do implante da tíbia de células cancerosas e continuou durante um total de 8 semanas. Grupo V (PAA-RANKL + PBS) tíbias foram implantados com células PAA-RANKL e os ratinhos foram tratados com 100 ul de PBS, que também foi injectado por via subcutânea três vezes por semana durante 8 semanas.

preparação do radiofármaco

a concentração de fluoreto foi produzido usando O-18 água e prótons bombardeio usando um ciclotron RDS (CTI). ion

18F-flúor foi produzido em atividades específicas de aproximadamente 1000 Ci /mmol e

18F-FDG foi sintetizado em actividades específicas de cerca de 5000 mCi /mmol tal como publicado anteriormente [30].

Micro PET /CT protocolo de imagiologia

Animals nos subgrupos de imagem foram submetidos a tomografia por emissão de positrões (PET) e micro tomografia computadorizada em 8 semanas a instituição do autor de acordo com um protocolo previamente publicado [30]. Resumidamente, os ratinhos foram anestesiados com isoflurano (1,5-2%) e oxigénio em câmaras de indução. Os ratos foram então injectados directamente com aproximadamente 250 uCi de

18F-FDG através da veia da cauda utilizando uma agulha de calibre 27 de rosca para um cateter de polietileno. Os animais foram administrados a manutenção da anestesia com isoflurano a 2% no sistema de leito isolamento durante o período de absorção do radiofármaco. Bexigas foram expressos manualmente 5 min antes da imagem e os animais foram posicionados em um sistema de cama multimodalidade portátil constituído por uma câmara de acrílico com portas de anestesia e cresceu plataforma. scans de corpo inteiro foram realizadas com um tempo de aquisição de 10 minutos, utilizando um sistema MicroPET® FOCUS 220 (CTI Concorde Microsystems LLC). Imediatamente depois, um estudo micro CT sem contraste com sistema de imagem microCAT® II (IMTEK Inc.) foi utilizado para digitalizar os animais com um tempo de aquisição de 10 minutos. digitalizar imagens de PET foram reconstruídos usando projeção de filtro de volta. imagens MicroPET e microCAT® foram incorporadas para análise para uso com software AMIDE®.

A análise quantitativa de micro PET /CT de dados

PET e os dados de tomografia computadorizada foi analisada e quantificada por AMIDE® ( Uma imagem Medical Data Examiner) versão 0.7.154 conforme publicado anteriormente [30].

absorção de FDG-18F correlaciona-se com o metabolismo da glucose celular e foi utilizado em imagiologia micro PET para a detecção e monitorização longitudinal da carga do tumor. Resumidamente, as regiões de interesse (ROI) foram elaboradas usando uma ferramenta de ROI sobre planaltos tibiais bilaterais que eram tridimensionalmente reconstruído para confinar todas as absorções de sinais perceptíveis. Usando caixas de ROI do mesmo tamanho, ferramentas de análise de dados foram utilizados para calcular máxima e média intensidade do sinal em ambos os tumores implantados tíbias e as tíbias uninjected contralateral. A tíbia contralateral foi utilizado como um controlo interno para cada animal. Para quantificar o tamanho do tumor, iso-contorno ROI 3D foi desenhado na tíbia tumor utilizando o máximo de intensidade de sinal de FDG na tíbia contralateral como o limiar, e o volume do sinal de FDG (mm

3) Calculou-se então nas tíbias Tumor implantado. imagens Micro CT foram usadas para identificar e quantificar lesões ósseas.

medições carga tumoral

Os animais foram sacrificados após o micro PET /TC em 8 semanas, e seus tumores na pata traseira foram colhidas para soft medição -tissue. A carga de tumor de tecidos moles foi calculada usando a fórmula como publicado anteriormente [29], [32].

A análise estatística

Os dados de análise de imagem de secções são expressos como média ± o erro padrão da da média (EPM) de cada grupo. As análises estatísticas foram realizadas utilizando

t

-teste e análise de variância (ANOVA), com

p

-Valores 0,05 considerado estatisticamente significativo. teste do qui-quadrado de Pearson foi utilizado para determinar a correlação entre a expressão /OPG RANKL RANK /e os parâmetros clínico. Todos os dados foram analisados ​​utilizando o software SPSS 15.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, EUA).

Resultados

expressão de RANKL, RANK e OPG em linhas de células de câncer de pulmão humanos

primeiro, determinamos o potencial metastático de PG-BE1, PG-LH7, e as células PAA. células PG-BE1 penetrou mais fortemente do filtro do que as outras linhas de células, e o número de células migradas PAA foi mínima (

P

0,05; Figura 1A, B). Além disso, o nível de ARNm de metaloproteinase-9 da matriz (MMP9) observado através de análise de RT-PCR foi semelhante ao observado com o nível Transwell insere (

P

0,05; Figura 1C). Todos acima indicaram que estas três linhas celulares tinham diferentes potenciais metastáticos. Em seguida, a expressão de RANKL, RANK, e OPG foi avaliada em todas as três linhas de células em níveis de transcrição e de proteínas utilizando quantitativa PCR em tempo real e Western blotting. Todas as três linhas de células NSCLC apresentaram diferentes níveis de RANKL, RANK, e expressão OPG. Das três linhas de células, as células PG-BE1 (que teve o maior potencial metastático) demonstraram a expressão mais forte de RANKL, RANK e OPG (

p Art 0,05 vs. outras linhas celulares; Figuras 2 e 3 ). células PAA, que eram o menos invasivo, apresentava apenas RANKL mínima, RANK, e coloração OPG. Imunocitoquímica confirmou a expressão de RANKL, RANK e OPG observada com quantitativa PCR em tempo real e Western blotting. Além disso, um número significativamente maior de RANKL: taxa de densidade de OPG foi observada nas células com elevado potencial metastático (

P

0,05; Figuras 2D e 3D)

O potencial metastático de três NSCLC. linhas de células foi determinada utilizando um primeiro ensaio in vitro de migração em (a, B). MMP9 expressão diferencial em três linhas de células NSCLC foi ainda analisada por RT-PCR (C). Os resultados são expressos como a média ± o erro padrão da média (SEM) de três experiências separadas. **

p Art 0,05 para PG-BE1 contra PG-LH7. *

p

. 0,05 para PG-LH7 contra PAA

RT-PCR foi realizada para detectar RANKL, RANK, e os níveis de mRNA OPG em PG-BE1, PG-LH7 e células de PAA (A). Quantitative real-time PCR revelou a expressão relativa de RANKL, RANK, e ARNm de OPG em três linhas celulares de NSCLC utilizando a 2

– (ΔΔCt) método (linha de células de PAA como um calibrador). GAPDH e β-actina foram usadas como referência interna (B, C). Em seguida, a razão de RANKL: Expressão de ARNm de OPG em três linhas de células NSCLC foi calculada com base nos valores Ct para tanto do gene alvo e a referência (D). Barras representam a média ± o erro padrão da média (SEM) de três experiências diferentes. **

p Art 0,05 para PG-BE1 contra PG-LH7. *

p

. 0,05 para PG-LH7 contra PAA

análise de Western blot foi realizada para detectar RANKL, RANK, e os níveis de proteína OPG em PG-BE1, PG-LH7 e células PAA. intensidades de bandas foram normalizados para a p-actina (A-C). Em seguida, a razão de RANKL: a expressão da proteína de OPG foi calculada em três linhas celulares de NSCLC (D). Barras representam a média ± o erro padrão da média (SEM) de três experiências diferentes. **

p Art 0,05 para PG-BE1 contra PG-LH7. *

p Art 0,05 para PG-LH7 contra PAA

recombinante RANKL estimulou a migração PAA e invasão

In vitro

Com o. mais baixo potencial metastático e a expressão menos RANKL, o baixo número de células migradas foi PAA aumentou de três vezes na presença de RANKL humana recombinante (

P

0,05). Este efeito foi bloqueado pela adição de OPG humana recombinante de um modo dependente da dose (Figura 4B). invasão também estimulou um aumento de duas vezes quando RANKL recombinante foi adicionado às células PAA. Da mesma forma, a OPG produzida uma redução dependente da dose na invasão de células de PAA. Estes resultados indicaram que o sistema RANKL /RANK /OPG era funcional em células de câncer de pulmão.

análise de Western blot demonstraram maior expressão da proteína RANKL em células PAA-RANKL em comparação com células PAA e PAA-Mock (A). RANKL recombinante estimulou a migração de células PAA, e o efeito da administração de RANKL foi bloqueada por adição de OPG para o meio de cultura de uma forma dependente da dose. *

P

0,05 para 300 ng /ml de RANKL recombinante versus o controlo e amostras de 200 ng /mL de OPG-tratada (B). O aumento da migração de células de PAA-RANKL in vitro foi demonstrado, e pode ser bloqueada pela adição de OPG para o meio de cultura. *

p Art 0,05 para PAA-RANKL contra o PAA, o PAA-Mock e 200 amostras ng /ml tratados com OPG (C). Os resultados são apresentados como a média ± o erro padrão da média (SEM) de ensaios em triplicado.

cDNA RANKL transfecção estimulou a migração PAA e invasão

in vitro

e

vivo

para melhor elucidar as funções biológicas do sistema RANKL /RANK /OPG em NSCLC, foi utilizada a técnica de transfecção para regular especificamente a expressão do gene em células RANKL PAA. Paa células foram transfectadas com ADN de plasmídeo que codifica o gene de comprimento completo de RANKL. Após o rastreio de G418 durante várias semanas, a linha celular transfectante estável PAA-RANKL foi estabelecida. expressão RANKL foi significativamente regulada para cima nesta linha de células em comparação com a linha PAA original ea transfectante simulada com pCMV6-XL5 vetor (PAA-Mock) (

p Art 0,05; Figura 4A).

em seguida, investigámos o efeito da sobre-regulação da expressão de RANKL sobre o comportamento metastático de células tumorais por ensaio Transwell. O número de células que migraram foi mais de duas vezes superior em células de PAA-RANKL do que em células de PAA e PAA-Mock; o número de células invadidas foi também duas vezes maior. Ambos estes efeitos foram bloqueados pela adição de OPG para o meio de cultura de um modo dependente da dose (Figura 4C).

Para investigar ainda mais o papel de RANKL em NSCLC in vivo, foi estabelecido modelo de xenoenxerto de murganhos por injecção intratibial Paa de células ou células PAA-RANKL nos ratinhos SCID. Após 8 semanas, observou-se que o volume de tumor derivado de células de PAA-RANKL foi significativamente maior do que o derivado a partir de células de PAA (Tabela 3). Micro análise de PET também revelou diferença significativa do tamanho da lesão óssea entre o Grupo (PAA) e grupo (PAA-RANKL) (Tabela 3; Figura 5). Além disso, com OPG injectados por via subcutânea três vezes por semana, tanto o volume do tumor e

18F-FDG tamanho da lesão óssea de Grupo (PAA-RANKL + OPG) foi significativamente menor do que Group (PAA-RANKL) e grupo (PAA-RANKL + PBS) (Tabela 3;. Figura 5)

A-Plain radiografia; B-micro CT (corte transversal); C-micro PET /CT sobreposição (corte transversal). radiografia simples e micro PET /CT demonstrou aumento destruição óssea (setas brancas) e

18F-FDG no grupo (PAA-RANKL) e grupo (PAA-RANKL + PBS) a 8 semanas após a injecção intratibial de células tumorais, Considerando que o aumento foi inibida no grupo (PAA-RANKL + OPG).

em conjunto, estes dados acima demonstram que o sistema RANKL /RANK /OPG desempenha um papel crucial em metástases ósseas de NSCLC in vivo. Estes resultados são consistentes com os estudos in vitro e os dados clínico-patológicas.

A expressão de proteínas de RANKL, RANK e OPG em lesões com NSCLC primários e metástases

Em seguida, utilizamos a imunocoloração para examinar RANKL, RANK , e os níveis de proteína de OPG em amostras de tecidos humanos com NSCLC. De 75 metástases NSCLC para óssea incluídos no estudo, 60 casos (80%) e 54 casos (72%) apresentaram expressão de RANKL e RANK, respectivamente, enquanto que 62 casos (82,7%) apresentaram expressão OPG (Tabela 4). RANKL e coloração com RANK foi observada principalmente na membrana celular e no citoplasma das células cancerosas. tecidos ósseos não neoplásicas mostrou fraca e focal RANKL, RANK, e coloração de OPG, e a intensidade da coloração de todas as três proteínas foi mais forte nas interfaces de células de cancro /osso do que no centro dos ninhos de células de cancro (Figura 6A). Por comparação, em 52 cancros primário apenas 53,8% e 59,6% dos casos expostos e RANKL expressão aparecem, respectivamente, e 63,5% dos casos demonstrou expressão de OPG (

P

0,05; Tabela 4). imunocoloração significativamente mais forte para todas as três proteínas foi observado em metástases ósseas do que em células tumorais no sítio primário. Esta constatação foi confirmada por análise quantitativa da densidade de imunomarcação de proteínas em cada grupo.

imunocitoquímica para RANKL, RANK, e OPG foi realizada em secções de tecido a partir de lesões primárias de NSCLC e metástases ósseas provenientes de NSCLC, eo foram avaliadas as intensidades de coloração (A). Em seguida, a razão de RANKL: densidade imunocoloração OPG foi calculada em NSCLC lesões primárias metástases ósseas e originários de NSCLC (B). Os resultados são expressos como a média ± o erro padrão da média (SEM) de três experiências separadas. *

p Art 0,05

RANKL

Em seguida, para avaliar com mais precisão os resultados de positividade, calculamos:. Rácios OPG por medição da densidade óptica dos tecidos de NSCLC primária e NSCLC metástases ósseas. A análise revelou significativamente maior RANKL:. Rácios OPG em metástases ósseas, em comparação com os tecidos NSCLC primária (Figura 6B)

Correlação de RANKL, RANK, e expressão OPG com os parâmetros clínico de câncer de pulmão

Vários características clínico-patológicas de pacientes com NSCLC primários foram comparados com base nos níveis de RANKL, RANK e OPG de expressão. Como mostrado na Tabela 1, RANKL, expressão de RANK, e OPG foram não associada com a idade, sexo biológico, tabagismo, ou histotipo. No entanto, as correlações claras foram estabelecidas entre RANKL e expressão OPG e estágio do tumor, metástase linfonodal e metástases à distância. Por conseguinte, maior RANKL (78,6%, 71,4% e 88,9%) e OPG expressão (64,3%, 76,2% e 77,8%) foram observadas nos tumores metastáticos mais avançados (

P

0,05; Tabela 1 ). Cerca de três quartos (71,4%) de fase T3 /4 amostras de tumor coradas positivas para RANK, em comparação com 39,5% de amostras de T1 /2 estádio do tumor (

P

0,05; Tabela 1). Não houve associação significativa entre a expressão de RANK e metástases em linfonodos ou metástases à distância. Finalmente, os pacientes com grau histológico pouco diferenciado exibiu muito maior expressão RANKL do que aqueles com grau histológico bem diferenciados (90,9% vs. 43,9%,

p Art 0,05); nenhuma associação significativa foi observada em relação RANK ou OPG.

Discussão

As metástases ósseas que se originam de câncer de pulmão e outros tumores malignos estão associados a complicações ósseas graves, e metástase do câncer pulmonar do osso continua a ser uma fonte significativa de morbidade, com poucas opções de tratamento bem sucedidos. A maioria das metástases NSCLC para osso são tipicamente caracterizados como osteolíticas de acordo com a aparência radiográfica [20], [33], [34]. No osso normal, existe um equilíbrio dinâmico entre a reabsorção óssea regulada pelos osteoclastos e a formação de osso pelos osteoblastos regulada [4].