Abstract
adenocarcinoma ductal do pâncreas é o rank 4 para o paciente ‘morte por doença maligna nos países ocidentais, sem tratamento satisfatório. Nós re-examinado com mais precisão as histonas desacetilases (
HDAC
) e Sirtuin (
SIRT
) padrões de expressão genética no cancro do pâncreas com tumores mais pancreáticas e tecidos normais. Também examinedthe possível relação entre
HDAC
níveis de expressão de genes e evolução da doença a longo prazo. Além disso, nós avaliamos usando um
in vitro
sistema modelo da linha de células de tumor pancreático humano se HDAC7 knockdown pode afetar o comportamento das células. Foram analisados 29 adenocarcinoma do pâncreas (PA), 9 pancreatite crônica (CP), 8 pâncreas benigna (BP) e 11 tecidos pancreáticos normais. No que diz respeito adenocarcinoma do pâncreas, fomos capazes de coletar biópsias na periferia do tumor. Para avaliar o possível envolvimento de HDAC7 na capacidade de proliferação celular, que têm gerado humano Panc-1 tumor recombinante que underexpressed ou HDAC7 overexpressed. A expressão de
HDAC1,2,3,4,7 e Nur77
aumentou em amostras de PA em níveis significativamente mais elevados do que os observados no grupo CP (
p
= 0,0160; 0,0114; 0,0227; 0,0440; 0,0136; 0,0004, respectivamente). A expressão de HDAC7, foi significativamente maior no PA comparada com amostras de tecido BP (
p
= 0,05). Os níveis médios de transcrição de mRNA de PA para
HDAC7
e
HDAC2
foram superiores quando comparados com os seus congéneres biópsias tomadas na periferia do tumor (
p
= 0,0346, 0,0053, respectivamente) . Além disso, os dados obtidos através de microscopia confocal e um método quantitativo de imunofluorescência apoiam fortemente a superexpressão HDAC7 em espécimes cirúrgicos PA. O número de mortes e recorrências no final do acompanhamento foram significativamente maiores em pacientes com superexpressão de
HDAC7
. Curiosamente, a taxa de crescimento foi significativamente reduzida no caso da célula transportando construto shRNA segmentação gene que codifica HDAC7 quando comparadas com as células tumorais parentais Panc-1 (p = 0,0015) durante 48 h e 96 h (p = 0,0021). Este estudo apoiam fortemente a noção de que HDAC7play um papel na progressão do adenocarcinoma do pâncreas
Citation:. Ouaïssi M, Silvy F, Loncle C, Ferraz da Silva D, Martins Abreu C, Martinez E, et al. (2014) Além disso Caracterização de
HDAC Comprar e
a expressão do gene SIRT
Padrões em cancro do pâncreas e sua relação com a doença Resultado. PLoS ONE 9 (10): e108520. doi: 10.1371 /journal.pone.0108520
editor: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Center Ciência, China
Recebido: 17 Março, 2014; Aceito: 24 de junho de 2014; Publicação: 02 de outubro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Ouaïssi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Os dados clínicos são agrupadas em: SIRIC- site Integrado de Recherche en cancerologie, programa intitulado: As estratégias alternativas em terapias contra o câncer de pâncreas. Os pedidos podem ser enviados para o chefe do departamento, Dominique Lombardo (Tel +33 (0) 491 324 402)
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo financiamento institucional de INSERM (Paris, França) ea Aix -Marselha Université (Marselha, França) e por uma concessão Inca-DGSO-INSERM 6038 de Sites de Recherche Integrada sur le Câncer (SIRIC). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
ductal adenocarcinoma do pâncreas é o rank 4 para o paciente a morte “de doença maligna nos países ocidentais [1]. A agressividade desse tipo de câncer é demonstrado por uma taxa de mortalidade relacionada à doença se aproxima muito a incidência [2]. difusão câncer e metástase conta por aproximadamente 90% de todas as mortes relacionadas ao câncer [2]. Metástase segue uma de várias etapas de processos complexos em que o tecido saudável vizinho é invadido por células de tumor primário, que o acesso à circulação sistémica e, finalmente, proliferam em locais distantes em tumores secundários macroscópicos através da perivascular e /ou tecido perilinfática [3]. No caso de cancro do pâncreas, a maioria dos pacientes que já têm metástases no momento do diagnóstico. Uma série de investigações concentraram-se na identificação de possíveis marcadores que podem permitir o diagnóstico precoce de câncer de pâncreas. Os eventos específicos que promovem a tumorigénese e progressão do cancro está associada a modificações moleculares complexas, tais como a metilação do DNA, a acetilação de histona, fosforilação, ubiquitinação e ribosilação de ADP. Atualmente, resultados da investigação fundamental sublinhar a importância de acetilação e desacetilação ao nível não só histonas lisina resíduos, mas também outros factores celulares que são supostamente para interferir com a regulação da expressão gênica. De facto, a constante de sate-acetilação de histonas de núcleo é controlada pelas acções opostas actetyltransferases histonas (HATs) e histona desacetilases (HDACs) cujas actividades são correlacionados com a activação de genes e a repressão do gene ou [4] silenciamento. Conhecimento crescente sobre as HDACs indica que eles são reguladores de crescimento, diferenciação e morte celular (apoptose). A disfunção de repressão da transcrição mediada por HDAC pode levar a carcinogénese. Com efeito, a modulação dos níveis de genes que codificam as HDACs (expressão sob-sobre- e /ou) de expressão foi avaliado para diferentes tipos de cancro [5], [6], [7], [8]. A caracterização de genes-chave que desempenham um papel no desenvolvimento do tumor pancreático pode não só permitem descobrir novos biomarcadores, que se tornará o foco de interesse de pesquisa intensiva, mas também vai lançar luz sobre os produtos dos genes potenciais a serem explorados para a concepção de meios seletivos para interferir com a progressão do tumor. Estudos recentes demonstraram [9], [10] que HDAC2 foi sobre-expresso em amostras de tecido de adenocarcinoma do pâncreas. A fim de fornecer uma visão sobre o comportamento biológico do câncer de pâncreas e identificar novos biomarcadores potenciais, temos nos últimos anos iniciou um estudo com o objetivo de examinar os níveis de
HDAC Comprar e
genes SIRT
expressão em um conjunto de cirurgicamente ressecado tecidos pancreáticos, incluindo 11 amostras de adenocarcinoma do pâncreas e um tecido pâncreas normal. Apesar de relativamente pequeno número de amostras examinadas, encontramos aumento da expressão de HDAC7, um deacetilase classe IIa, em 9 de cada 11 amostras [11], [12]. No entanto, embora tenhamos usado um pâncreas normal, como o calibrador para medir a expressão do gene e outras amostras em estreita proximidade ou longe do tumor como controles, pensamos que novas investigações usando um número maior de tecidos pancreáticos normais e amostras de tumor são necessários para re-examinar mais precisamente o
HDAC Comprar e
sIRTS
padrões de expressão gênica em câncer pancreático. Além disso, foram feitas tentativas para analisar a possível relação entre a expressão do gene HDAC ea evolução da doença. Também avaliamos usando um
in vitro
sistema modelo da linha de células de tumor pancreático humano se HDAC7 knockdown pode afetar o comportamento das células.
Materiais e Métodos
população Assunto
De maio de 2007 a agosto de 2012, 29 de adenocarcinoma do pâncreas (PA), 9 pancreatite crônica (CP), 8 tumores pancreáticos benignos incluindo cystadenoma serosa (SC) n = 2, cystadenoma mucinoso (n = 2), IMPN benigna ( n = 2), cisto benigno (cisto retencional, n = 1) e pâncreas tumor endócrino (n = 1), foram tomadas a cargo no departamento de Cirurgia la Timone Hospital (Marselha, França). Todos os pacientes foram submetidos torácica com contraste e tomografia computadorizada abdominal, ultra-sonografia abdominal, ressonância magnética e exames de sangue. PA não tinha tratamento pré-operatório antes da cirurgia. Vinte e dois pancreaticoduodenectomies (PD), e 7 pancreatectomies esquerda foram conduzidos com adenocarcinoma do pâncreas, respectivamente. Dois procedimentos PD, 4SP e 3 Frey [13] foram realizadas para CP. Quatro PD, 2 SP e 2 pancreatectomies medial foram realizadas para lesões benignas. Quatro pancreáticas (NP) biópsias normais foram obtidos durante o transplante hepático na hepatectomia doador, 7others foram obtidos durante a cirurgia susmesocolic quando gastrectomia radical necessária pancreatectomia esquerda: 3 ampulloma (AP1-3), 2 colangiocarcinoma do ducto biliar principais (BD1-2) , um gastrinoma do duodeno (G), 1 Normal amostras de tecidos adjacentes após a ressecção gástrico para o adenocarcinoma gástrico. Além disso, 11 amostras de tecidos de controlo feita na periferia dos espécimes cirúrgicos de diferentes pacientes com PA foram também incluídos neste estudo. Os dados foram coletados prospectivamente e um questionário padronizado foi concluído no momento do acompanhamento e da avaliação do estudo. Antes da cirurgia, todos os pacientes assinaram um termo de consentimento informado que tinha sido aprovado pelo comitê de ética local. Comité de Protecção do povo do Sul do Mediterrâneo II, aprovado pela Portaria de 31 de Maio de 2012, constituído de acordo com a ordem do director-geral da Agência de Saúde Região Provence Alpes Côte d’Azur de 13 de Junho de 2012, composto por: L. Boyer, V. PRADEL, B. Dussol, C. SICHEL, M. Caillol, F. VINCENT, G. NAURAYE, JP. VIDAL, O. Schweitzer, J. ACCIARO, discutido em plenário o armazenamento de arquivos declaração e preparação para elementos científicos do corpo humano identificado pelo Ministério do Ensino Superior e da Investigação, com a referência DC-2013-1857 e cujo diretor científico é o Sr. Dominique LOMBARDO, deu um conselho perito favorável (Arquivos de S1, S2).
Cirurgia
Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados por três cirurgiões pancreáticas experientes (BS, YPLT, IS, MO). cirurgiões seniores experientes realizado todas as ressecções cabeça do pâncreas. DP foi realizada utilizando um piloro preservando ou procedimento de Whipple, e um Pancreaticojejunostomia extremidade-a-extremidade (PJA) foi construído com uma anastomose de uma única camada de interrupção da cirurgia 5-0 PDS (Ethicon), suturas absorvíveis. Escolha da técnica cirúrgica foi decidido per-operatório obrigado a decisão do cirurgião. abordagem anterior SMA foi então usado rotineiramente desde o ano de 2001 para padronizar a radicalidade da ressecção no local da margem retroperitoneal. linfadenectomia padrão foi realizada antes do ano 2001 e estendida linfadenectomia desde aquela época [14]. exames por congelação na linha de secção trans pâncreas, foi realizada em todos os casos e não foi invadido por todas PA. linfadenectomia padrão foi levada a cabo ao longo do ligamento hepatoduodenal e a artéria hepática comum [15]. Todas as ressecções foram realizadas através de laparotomia. No caso de pancreatectomia esquerda: a técnica de pancreatectomia distal começando com divisão do pescoço pancreático antes do controle de vasos esplênicos foi utilizado [16]. divisão pescoço precoce permite o controle vascular mais seguro. Para pancreatectomia distal, seção principal do pescoço e vasos esplênicos ligadura, combinada com a divisão de gastro-epiplóica esquerda e vasos gástricos curtos, precede a mobilização de uma amostra de desvascularização, diminui o sangramento operatório e parece mais adequado do ponto de vista carcinologic. Após cirurgia pacientes receberam quimioterapia adjuvante em função do seu estado de desempenho, e à discrição do oncologista. Dois drenos moles (Peters) ou seção de pâncreas deixou para a pancreatectomia esquerda foram rotineiramente colocado perto da anastomose pancreaticojejunal. O tempo operatório foi registrado. Na ausência de uma fístula, drenos foram retirados após 7 dias.
As amostras de tecido
Todos os espécimes cirúrgicos foram revisadas por um patologista sênior. Clínica e patológica estadiamento (Tabela S1) foram reavaliados de acordo ao Comité Misto americana sobre o Câncer de estadiamento TNM de câncer pancreático relativa PA. Os tumores tinham sido congeladas em ARN posterior e de azoto líquido durante 15 segundos e imediatamente armazenados a -80 ° C. características tumores foram registrados em todos os pacientes (Tabela S1). Isto incluiu a sua localização, o tamanho mediano no diagnóstico, estadiamento UICC, a extensão da doença neoplásica no momento do diagnóstico, o número de locais de metástases quando presente e do estado nodal. Todos os espécimes foram classificados de acordo com as regras de classificação do 6
ª edição (2002) da American Joint Committee on Cancer Staging Manuel (AJCC) [17]. A radicalidade da ressecção foi graduada de acordo com a R-classificação da União Internacional contra o Câncer (R0: nenhum tumor residual, R1: tumor microscópico residual, R2: tumor residual macroscópica
in situ
) [18]. A margem retroperitoneal foi graduada R1 se o tumor microscópico residual foi identificado dentro de 1 mm da linha de secção trans [19]. Desde o ano de 2002, o exame patológico da peça cirúrgica foi padronizado de acordo com a Luttges
et al.
Protocolo [20], usando rotina de marcação da linha de secção trans retroperitoneal tinta. Em casos de ressecção vascular, o segmento vascular completo foi incorporado e ambas as extremidades foram examinados separadamente, como margens de ressecção adicionais.
Tratamento de Tecidos e imunofluorescência histológica Estudo
Os espécimes de tecido (21 Pa e 6 amostras NP ) foram rotineiramente fixadas em formol a 10%, embebidos em parafina e novo corte em secções de 5 mm imediatamente armazenados a 4 ° C ou manchados com hematoxilina-Floxina-açafrão (HPS).
Reagentes e mAbs
no caso de análise de mancha de Western, um anticorpo monoclonal de ratinho anti-actina e anticorpo marcado com POD anti-rato {a partir de Sigma (St. Louis, MO)}, foram usadas. Um anticorpo policlonal de coelho anti-HDAC7 foi de Euromedex (Souffelweyersheim, França), anticorpo anti-coelho marcado com POD foi a partir de Cell Signaling (Beverly, MA). DMEM meio de cultura celular, penicilina, estreptomicina, tripsina-EDTA, higromicina B e neomicina foram de Invitrogen (Carlsbad, nm) para conduzir a imunocoloração, anticorpo monoclonal de murganho (Acm) anti-HDAC7 (20 ug /mL, Sigma-Aldrich, França ), e foi utilizado um anticorpo de coelho anti-Nur77 (Ab) (5 ug /mL, Thermo Scientific, CergyPontoise, França). A biotina conjugada com F (ab ‘) 2 de anticorpos de cabra para IgG de ratinho (Beckman Coulter, Roissy CDG, França) ou de cabra conjugado com biotina anti-IgG de coelho (Sigma-Aldrich) para HDAC7 e Nur77 imunocoloração, respectivamente, foram utilizados.
imunofluorescência
fixado em formol e cortes de tecido embebidos em parafina (5 mm) foram desparafinados e tratada com uma solução de recuperação antigênica. As secções de tecido foram incubadas 2 h a temperatura ambiente (TA) com anti-HDAC7 ou anti-Nur77 e lavadas em PBS. As secções foram então lavadas em PBS e incubadas 1 h à RT com diluição 1:50 de F conjugado com biotina (ab ‘) 2 de anticorpos de cabra para IgG de ratinho ou IgG de cabra anti-coelho conjugado com biotina para HDAC7 e Nur77 imunocoloração respectivamente. As secções foram lavadas em PBS, tratou-se 1 h à RT com diluição 1:50 de estreptavidina-fluoresceína (Beckman Coulter). Todas as secções foram montadas em meio de montagem permanente aquosa Dako.
As secções foram observadas por meio de um Zeiss Axiovert 200 M microscópio invertido com 20 objectivo e um microscópio confocal de varrimento de laser (CLSM) (Leica TCS SP5) com um 60 objectivo. Um laser de argônio com uma excitação de 488 nm foi usada para ativar a fluorescência verde.
Imagem de Processamento
As imagens foram processadas como descrito anteriormente [11]. Para cada anticorpo primário, a coloração foi calculada como a razão entre a fluorescência total da área (fluorescência específica total) e a superfície desta área (média de fluorescência específica, MSF). foram calculados os valores médios de seis áreas manchadas para cada biópsia.
Acompanhamento
seguimento pós-operatório inclui clínica, bioquímica e avaliação radiológica cada 3 meses durante o primeiro ano pós-operatório, em seguida, a cada 6 meses até um atraso pós-operatório de 5 anos e depois anualmente até 10 anos de follow-up. Nenhum paciente foi perdido de seguimento. Os pacientes sobreviventes foram avaliados para a recorrência da doença e do local de recorrência. informações de acompanhamento foi obtido a partir de registros médicos e consulta dos pacientes diretos. Acompanhamento foi continuada para todos os pacientes nesta coorte até junho de 2013, sem incluir novos pacientes. A longo prazo de seguimento estava disponível para todos os pacientes. O tempo médio de acompanhamento foi de 16 meses (mediana: 18 meses, intervalo: 2-53). O tempo de sobrevida foi calculado a partir da data da operação até a data da morte ou a data que o presente estudo foi terminado.
O crescimento celular e proliferação
Panc-1 células (ATCC, CRL-1469) originado a partir de carcinoma pancreático humano foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de FCS, 1% de penicilina (100 U /ml), 1% de estreptomicina (100 ug /ml) e glutamina (1 mM). As células foram semeadas a 4000 células
por poço numa placa de crescimento e de células de 96 poços foi avaliado em 24, 48, 72 e 96 h por 3- (4,5-dimethythiazol-2-il) -2 , 5-difenil (MTT). Os resultados são apresentados como média ± DP (n = 8) e são representativos de pelo menos 3 experiências independentes.
Células transfecção
O silenciamento do gene HDAC7 foi realizada por transfecção estável de células Panc-1 com SureSilencing shRNA plasmídeo para HDAC7 Humana (Qiagen, Courtaboeuf, França), que confere resistência à higromicina para células transfectadas. A sobre-expressão de HDAC7 foi realizada por transfecção estável com plasmídeo pCDNA3-HDAC7-Flag (plasmídeo Addgene 13824; Eric Verdin, os Institutos J. David Gladstone, San Francisco, CA, [21]), que confere resistência à neomicina para células transfectadas. Panc-1 em células de 50-80% de confluência foram transfectados com lipofectamina LTX com Reagente Reagente PLUS (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Após 6 horas de incubação a 37 ° C em 5% de CO2, o meio de transfecção foi substituído por meio DMEM completo durante 48 h e, em seguida, com meio fresco contendo 300 ug /ml de higromicina B (plasmídeo shRNA) ou 2 mg /mL de neomicina (pCADN3 -HDAC7-Flag plasmídeo). Após 1-2weeks, em meio selectivo foi realizada uma diluição limite. clones selecionados foram encaminhados para clones como SH ou celulares pFLAG, respectivamente. transfecções de controlo foram realizadas usando o vector pCDNA3 ou shRNA CTL vector vazio.
de SDS-PAGE e Western Blotting
As células foram lavadas três vezes com PBS arrefecido em gelo, recolhidas e sedimentadas por centrifugação. Os sedimentos foram lavados duas vezes e lisadas a 4 ° C em 0,1 ml de tampão de lise {50 mM Tris /HCl pH 7,5, 100 mM de NaCl, 0,5% de Triton X-100, EDTA a 1 mM, os inibidores de protease (Completo TM, Roche Diagnostics)} . Os homogenatos foram incubadas durante 30 min a 4 ° C e clarificada por centrifugação a 10 000 g durante 30 min a 4 ° C e congelou-se a -20 ° C. Uma alíquota foi guardado para determinação da proteína usando o Kit de ácido bicinconínico (Sigma, St. Louis). Quantidades iguais de lisados celulares (100 ug) em tampão redutor de SDS foram resolvidos em géis de gradiente de 8-16% de Tris-glicina poliacrilamida (Pierce). Após a migração electroforética, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose e processadas para imunotransferência utilizando anticorpos primários e secundários apropriados. Após lavagens, as membranas foram reveladas por quimiluminescência (Roche diagnóstico, Meylan, França).
isolamento do RNA e transcrição reversa
Os tecidos (≈30 mg) foram interrompidas em 600 ul de tampão RLT Plus ( Qiagen) utilizando um recipiente de tamanho adaptado para perturbações e homogeneização com um ruptor Tissue. O ARN total foi isolado utilizando o kit de toda a preparação de ADN /ARN Mini (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. A concentração de RNA foi determinada pela absorção e RNA integridade foi verificada em RNA Nano fritas (Agilent, Santa Clara, CA). reacções de transcrição inversa (RT) foi realizada em 1 ug de ARN total utilizando o kit IMPROM-II (Promega, Madison, WI) de acordo com as instruções do fabricante. células T ele foram colhidas e os sedimentos de purificação de ARN foram processadas imediatamente em tampão de lise RLT (Qiagen). O ARN total foi isolado utilizando o kit RNeasy Mini (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de RNA foram tratadas com DNase I (estojo livre de ADN, Ambion Inc., Austin, Texas) para remover os vestígios de ADN genómico contaminante. A transcrição reversa (RT) as reacções foram realizadas em 1 ug de ARN total, utilizando hexâmeros aleatórios e transcriptase inversa M-MLV (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.
-PCR em tempo real quantitativa (Q-PCR RT)
Q
reacções de RT-PCR foram realizadas em triplicado em duas preparações independentes de ARN a partir de clones celulares usando o LightCycler480 SYBR Green I mistura de PCR e o equipamento de PCR em tempo real LightCycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemanha), como descrito anteriormente [12]. Os iniciadores estão resumidos na Tabela S2. Os iniciadores foram concebidos para amplificar um fragmento de 200 pb aproximadamente, na sequência de codificação de 11 genes pertencentes às famílias de HDAC /SIR. O gene 28S RN foi escolhida como controlo. A análise comparativa dos valores de Passagem de Ct (média de
Cp
) do 4 NP e os 7 biópsias pancreáticas normais para o conjunto de HDAC e SIRT, bem como genes Nur77 revelou que eles eram de valores semelhantes sem estatisticamente diferença significativa (Figura 1, Tabela S3). Portanto, as 11 amostras de biópsias foram concebidos como um grupo controle (GC) e sua média
valores Cp Compra de todos os genes foram determinadas e usado como calibrador. A
-ΔΔCt método 2 foi utilizado para analisar a expressão do gene relativo [22]. O CT (valores Cp) média foi calculada tanto para o alvo e o gene 28S ea ΔCt (C
t,
alvo
-C
t,
28S
) foi determinado. O GC foi utilizado como calibrador [para o cálculo da ΔΔC
t = (C
t,
alvo
-C
t,
28S
) – (C
t,
alvo CG
-C
t,
28S CG
)] [22]. Para o CG, ΔΔC
t é igual a zero e 2
0 é igual a um, de modo que a mudança vezes na expressão do gene em relação ao GC é igual a um. Avaliação de 2
-ΔΔCt indica a mudança vezes na expressão do gene em relação ao GC.
Média Cp de HDACs, SIRTS e genes Nurr77 e 28S transcrições de amostras de tecidos do grupo de controlo. qPCR foram feitas em triplicado em duas preparações independentes de ADNc a partir de tecidos do pâncreas, tal como descrito na secção Materiais e Métodos. A média Cp valores Ct (média de Cp) foram determinados para as amostras seguintes: NP-1 a 4, pâncreas normal; BD-1 e 2, amostras normais do pâncreas de pacientes portadores de tumores do ducto biliar. AP-1 a 3: tecidos normais adjacentes amostras ampulloma; G-A: amostras de tecidos normais adjacentes após a ressecção gástrica para o adenocarcinoma gástrico; Gastrinoma: tecidos normais adjacentes amostras para gastrinoma do duodeno
A análise estatística
A análise estatística foi realizada utilizando Graph Pad 5 software.. Os dados são expressos como média ± o desvio padrão ou mediana com intervalo interquartil. As diferenças entre os dois grupos foram analisados utilizando o teste ou teste t de Student Mann-Whitney. one-way análise de variância ou Kruskal-Wallis foi realizado para comparar mais de dois grupos.
Para comparar para as variáveis categóricas, exato foi utilizado o teste do qui-quadrado ou Fisher. método de Kaplan-Meier foi utilizado para estimar global ea sobrevida livre de recidiva. Para todos os testes, um valor de p inferior a 0,05 foi considerado significativo.
Resultados
A expressão de HDAC, SIRT e Nurr77 no controle de pâncreas Painel de tecidos
de 11 normais pâncreas espécimes cirúrgicos foram estudados. Estas amostras de tecidos foram avaliadas quanto HDACs, SIRTS e estado ARNm Nur77 quantitativa por PCR em tempo real. Como mostrado na Figura 1 e Tabela S3) quando se considera o ponto de cruzamento (
Cp
) que define o ponto no qual a fluorescência aumenta apreciavelmente acima da fluorescência do solo volta, os valores observados para cada gene não foram estatisticamente significativamente diferentes (os valores de p variou 0,13-1), sugerindo que os genes-alvo foram expressas com níveis semelhantes nos espécimes cirúrgicos examinados. Isso nos permitiu definir os 11 espécimes cirúrgicos como um grupo controle (GC), portanto, usando os valores médios de sua
Cps
como calibrador.
Comparação de Q RT-PCR análise das HDACs , sIRTS e câncer pancreático Nur77 expressionbetween, pancreatite crónica, tumores benignos e grupo controle
no nosso relatório anterior [12] temos mostrado que HDAC7 é expressa de forma significativa em amostras de tecidos PA. Tendo em conta que apenas foram utilizadas 11 amostras de tecido PA e uma biópsia de pâncreas normal, foi realizada a análise qPCR de
HDACs
,
SIRTS
e
expressão Nur77
em um total de 46 tecidos amostras que compreendem 29 PA. Além disso, 11 normais tecidos pancreáticos biópsias foram usadas como calibrador para definir com mais precisão os níveis de expressão de genes mRNA observáveis entre os tecidos de PA, PB e B. médios
valores Cp
(TC) de
HDAC7
,
Nurr77
,
SIRT1
,
SIRT2
, foram significativamente menores no grupo PA comparado ao GC (
p
= 0,0010; 0,040; 0,0420; 0,0366, respectivamente) (Figura 2). Este resultado demonstrou que
HDAC7
,
Nurr77
,
SIRT1
,
SIRT2
foram significativamente sobre-expressos em amostras de PA do que nas CG.
As amostras foram corridas em triplicado em duas preparações independentes de ADNc a partir de tecidos do pâncreas, tal como descrito na secção Materiais e Métodos. valores de ponto (CP) Crossing. As comparações foram feitas pelo teste de Wilcoxon e as diferenças foram consideradas significativas para p . 0,05
Em seguida, aplicou a 2
-ΔΔCt método para analisar a expressão gênica relativa em amostras de tecido de PA, B e PC [22]. Como mostrado na Figura 3A, a expressão de
HDAC1,2,3,4,7 e Nur77
aumentou em amostras de PA em níveis significativamente mais elevados do que os observados no caso do grupo PC (
p
= 0,0160; 0,0114; 0,0227; 0,0440; 0,0136; 0,0004, respectivamente). Além disso, a expressão de HDAC7, foi significativamente maior no PA em comparação com amostras de tecido B (
P
= 0,05).
(B) SIRT expressão de genes em tecidos de tumor pancreático. As amostras de tecido de pâncreas Adenocarcinoma (PA), Benin Tumor (B) e pancreatite crônica (CP). linha vermelha:. mediana dos níveis de RNA transcrito relativos
análise
Q RT-PCR mostrou a expressão de vários mRNAs SIRTS em tecidos de PA, PB e B (Figura 3B). Embora algumas variações significativas ao nível do
SIRT
s transcrição do gene pode ser evidenciado, os dados não permitem identificar um
variação de expressão de genes SIRT
níveis entre PA, PB e amostras B.
Nós ainda comparou os níveis de expressão do gene em alguns espécimes, onde fomos capazes de coletar biópsias na periferia do tumor. Como mostrado na Figura 4A, amostras PA mostrou estatisticamente maior média de níveis de mRNA de transcrição para
HDAC7
e
HDAC2
quando comparados com os seus congéneres biópsias tomadas na periferia do tumor (
p
= 0,0346, 0,0053, respectivamente). Embora algum grau de variação no
SIRTS
níveis de expressão de gene pode ser evidenciada entre amostras de tecido, essa diferença notável como os observados para
HDAC7
e
HDAC2
podia ser visto. Estes dados suportam a noção de que entre os
HDACs
e
SIRTS
gene examinados,
HDAC7
e
HDAC2 Quais são dois genes com maior potencial para ser marcadores de PA.
pancreáticas tumores de adenocarcinoma (PA), biópsias de tecidos remotos (RB).
Patterns e níveis de HDAC7 de expressão e Nur77
Ao usar HDAC7 mAb, a coloração foi negativo ou ligeiramente positivo em casos de controlo (NP), enquanto forte reactividade imunológica positiva foi encontrada em todos os PA (Figura 5A). Para analisar com mais precisão o nível de imunocoloração em amostras de tecidos, seis áreas coradas para cada imagem imunofluorescência foram quantificadas através da medição da intensidade de MSF áreas manchadas. Todos PA apresentaram valores de MSF estatisticamente mais elevadas do que as amostras de controle. A média da intensidade MSF encontrada com mAb para HDAC7 foi aumentado significativamente em PA (média = 173,78 ± 4,46) em comparação com as amostras de controlo (média = 54,31 ± 13,26) (Figura 5B) (
P
= 0,0004) . Análise de seis áreas coradas para cada imagem imunofluorescência medindo a intensidade MSF mostraram que a média dos valores de MSF encontrada com o mAb para Nur77 foi significativamente aumentada em PA (média = 146,50 ± 8,07) em comparação com as amostras de controlo (média = 110,00 ± 4,41 ) (Figura 6) (
P
= 0,0225).
Uma ligeira coloração é encontrado em NP. Na PA, uma coloração mais forte for encontrada no citoplasma e em associação com a membrana plasmática celular. 250x ampliação original. A determinação quantitativa da fluorescência média específica (MSF) (B). Seis áreas em cada caso foram medidos. As medianas das intensidades de MSF obtidos com tecidos PA e NP são representados pelas linhas horizontais e a gama interquartil é representada por caixas. (*
P Art 0,0004)
A coloração moderada é encontrada no citoplasma de NP.. células PA são fortemente coradas no citoplasma e uma coloração moderada foi observada nas membranas plasmáticas de células. 250x ampliação original. A determinação quantitativa da fluorescência média específica (MSF) (B). Seis áreas em cada caso foram medidos. As medianas das intensidades de MSF obtidos com tecidos PA e NP são representados pelas linhas horizontais e a gama interquartil é representada por caixas. (*
P Art 0,0225).
Impacto da
HDAC7, expressão HDAC2 e Nurr77
no resultado do paciente com adenocarcinoma do pâncreas
em seguida, examinaram a possível relação dos níveis de transcrição de gene (
HDAC7
,
HDAC2
e
Nurr77
) eo resultado da doença. Como mostrado nas Figuras 7, 8, 9 e 10, não houve diferença estatisticamente significativa podia ser visto entre os grupos em termos de sobrevida global e livre de doença quando se considera os indivíduos que expressam mais de inferior a 4 vezes o nível de transcrição do gene da linha de base. No entanto, quando analisamos o número de morte e recorrências no final do acompanhamento, número de morte e recorrências foram significativamente maiores em pacientes com superexpressão
HDAC7
(4 vezes o nível basal gene transcrição) (Figura 8) .
geral (linha sólida) e sobrevida livre de doença (linha tracejada)
N:.. nível de linha de base a transcrição em CG
N :. nível de linha de base a transcrição em CG
N:. nível de linha de base a transcrição em CG
Desenvolvimento de linhas de células pancreáticas humanas estáveis sob expressando ou superexpressão HDAC7
Para avaliar o possível envolvimento de HDAC7 na capacidade de proliferação celular, geramos Panc-1 clones celulares recombinantes humanas tumorais utilizando um conjunto de quatro construções shRNA comercialmente disponíveis e um plasmídeo de controlo correspondente. Além disso, o plasmídeo pCDNA3-HDAC7-FLAG foi utilizado para alcançar sobre-expressão da proteína HDAC7. As transfecções foram realizadas utilizando também um vector vazio pCDNA3 como controlo. A transcrição do gene que codifica a HDAC foi analisado por RT-PCR Q.