Abstract

Vários tipos de metilação de histonas têm sido associados com a progressão do câncer. Dependendo do local de metilação em proteínas histona, os seus efeitos sobre a transcrição são diferentes. DPY30 é um membro comum de complexos H3K4 metiltransferase SET1 /MLL histonas. No entanto, a sua expressão e papéis em câncer gástrico foram mal caracterizadas. Para determinar se DPY30 tem papéis fisiopatológicos em câncer gástrico, foram examinados a sua expressão e papéis. A imuno-histoquímica e PCR em tempo real mostraram a sobre-regulação da expressão DPY30 em algumas linhas celulares de cancro gástrico e tecidos dos pacientes. A sua knockdown por siRNA diminuiu a proliferação, a migração e a invasão de células de cancro gástrico, enquanto que a sua sobre-expressão mostraram os efeitos opostos. Estes resultados indicam que DPY30 tem um papel crítico na proliferação, migração e invasão das células cancerosas gástricas, e sugerir DPY30 pode ser um alvo terapêutico no cancro gástrico

Citation:. Lee YJ, Han ME, Baek SJ, Kim SY, Oh SO (2015) Papéis de DPY30 na proliferação e na motilidade das células cancerosas gástricas. PLoS ONE 10 (7): e0131863. doi: 10.1371 /journal.pone.0131863

editor: Aamir Ahmad, Escola de Medicina da Universidade Estadual Wayne, United States |

Recebido: 03 de março de 2015; Aceito: 08 de junho de 2015; Publicação: 06 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Lee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Bio Programa Medical Technology Development (# 2012M3A9C6050213, OSO) e Fundação Ciência Básica Research (# 2012R1A1A3010521, HME), da Fundação Nacional de Pesquisa (NRF), financiado pelo governo coreano (MEST), e por uma concessão do R Programa D para Controle do câncer, Ministério da Saúde, Bem-Estar e Assuntos da família, República da Coreia (# 0920050, OSO). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as modificações covalentes de caudas de histonas, tais como, acetilação, fosforilação, ubiquitinação, e metilação, modular a estrutura da cromatina e têm um papel central na regulação da progressão do ciclo celular, a transcrição de genes, a reparação do ADN, o desenvolvimento embrionário, e diferenciação celular [1, 2]. Embora o aumento da acetilação de histona está geralmente associada com a activação da transcrição, a metilação de histona correlaciona-se com a activação da transcrição e a repressão. Por exemplo, a metilação da histona H3 em lisina 9, 20, ou 27 resíduos (H3K9, H3K20 ou H3K27) está envolvida no silenciamento de genes de transcrição, mas, por outro lado, a metilação em H3K4, H3K36, ou H3K79 está associada a cromatina aberta e activa a transcrição de genes [3].

em mamíferos, mono-, di-, e tri-metilação de H3K4 (H3K4me1, H3K4me2, e H3K4me3) são realizadas por complexos familiares /MLL seis SET1 distinta (SET1A, SET1B , MLL1, MLL2, MLL3 e MLL4) [4, 5]. Estes metiltransferases H3K4 (H3K4MT) contêm diferentes subunidades catalíticas, e as atividades de todos os complexos da família seis são controladas por componentes do núcleo multi-subunidades comuns, que incluem WDR5, RBBP5, ASH2L e DPY30, e também são referidos como WRADs. [6-9]. A perda de qualquer subunidade de Wrad resultados complexos em reduzida metilação H3K4. WDR5 e RBBP5 são cruciais para todos os três tipos de metilação H3K4 (H3K4me1, H3K4me2 e H3K4me3), enquanto ASH2L e DPY30 são necessários principalmente para H3K4me3 [6, 8, 10, 11].

DPY30 é um membro de todas SET1 /complexos MLL humanos, e é necessário para a atividade plena SET1 /MLL metiltransferase [10, 12]. DPY30 tem sido implicado no potencial de diferenciação das células estaminais embrionárias (CES) ao longo da linhagem neuronal [10] e é essencial para a diferenciação adequada e proliferação de células progenitoras hematopoiéticas [12]. Além disso, o esgotamento dos DPY30 faz com que as células a entrar em um estado de senescência-like e upregulate p16 (CDKN2A) e p15 (CDKN2B), que estão diretamente envolvidos na senescência [13].

O câncer gástrico é um dos principais causas de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [14]. Apesar de recentes avanços diagnósticos e terapêuticos fornecer excelente sobrevida para pacientes com câncer gástrico precoce, a doença é geralmente diagnosticado numa fase tardia, quando o prognóstico é pobre [15]. carcinogênese gástrica envolve as acumulações progressivas de várias alterações genéticas e epigenéticas, que levam a ganho de função de oncogenes e perda de função por genes supressores de tumores. Além disso, uma vez que a transcrição de genes baseia-se fortemente na estrutura da cromatina, alteradas ou anormal metilação das histonas foi tipicamente associados com a progressão do tumor e o prognóstico no cancro [16], e, embora o estado de metilação das histonas tem sido bem descrito em muitos tipos de cancro, este aspecto Ainda não está claro no câncer gástrico [16, 17].

neste estudo, para determinar se DPY30 tem papéis fisiopatológicos em câncer gástrico, a sua expressão e papéis foram examinados.

Materiais e Métodos

cultura de células e siRNA transfecção

as linhas celulares derivadas de cancro gástrico, SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638, e NCI-N87 foram adquiridos a partir da Coreia Linha Cell Bank (Seul). A linha de células epiteliais gástricas, HFE145 foram dotados de Professor Hassan Ashktorab (Universidade Howard). As linhas celulares de cancro gástrico foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de CO a 5%

2/95% de ar em meio RPMI 1640 suplementado com HEPES 25 mM, 10% de soro fetal de bovino (FBS) (GE Healthcare Life Science, Sul Logan , UT, EUA) e 100 ug /ml de penicilina /estreptomicina (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA). DMEM (GE Healthcare Life Science) meio suplementado com FBS a 10% e 100 ug /ml de penicilina /estreptomicina foi usada para HFE145 cultura. As células foram transfectadas com pequeno ARN interferente (siRNA) ou mexidos (SCR) utilizando siRNA DhamaFECT reagente 1 ou 3 (Thermo Scientific, Lafayette, CO, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. sequências de siRNA foram como se segue: DPY30 duplex siARN (ORF) (Bioneer, Daejeon, Coreia do Sul), 5′-CAC UCU GAG CUC UAC GGU A (dTdT) -3 ‘, 5’-CUC UGA GUA CGG CAC UCU A (dTdT) -3 ‘, 5’CUC ACU UAU UCU AGG UAC U (dTdT) -3′; DPY30 siRNA duplex (3′-UTR) (Bioneer); 5’-CCG GAC AAC AGA ACC UAU UUU UGG A (dTdT) -3 ‘, 5′-GAG GCA GCU UUA AUU GCC agosto AUC A (dTdT) -3’; WDR5 siRNA duplex (Bioneer), 5’GUC CUU GUG AAG CUC GUC U (dTdT) -3 ‘, 5’GUC GUG AUC UCA ACA GCU U (dTdT) -3′, 5’-CAG AUU CUA ACC UUC UUG L (dTdT) -3 ‘; RBBP5 siRNA duplex (Bioneer), 5’-GUG UGA AAA GGG CUC AGU A (dTdT) -3 ‘, 5′-CAG AUU CUC AGG AUC UUG U (dTdT) -3′, 5’-GUG GUU GAG AUU AGU AGA L (dTdT) -3 ‘; ASH2L siRNA duplex (Bioneer), 5’-GUA UGA ACG GGU UUU GUU A (dTdT) -3 ‘, 5′-CUG AGA ACA CCU GAA AUC A (dTdT) -3’, 5’GUC UAC CUU UCA UGA CCA Um (dTdT) -3 ‘; mexidos (SCR) siRNA (Thermo Scientific), 5’-GAU CCG CAA AAG AGC GAA A (dTdT) -3 ‘.

DPY30 superexpressão

O cDNA DPY30 foi clonado pLenti6.3 vector -V5 /DEST (lentiviral vector de destino) usando o

in vivo

baseada em recombinação sistema de clonagem gateway (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). O Dador de Vector (pDONR221) portador da sequência de cDNA de DPY30 foi adquirido da Ultimate ORF Clones (Invitrogen), e recombinado com o contra-seleccionável

ccdB

gene de pLenti6.3-V5 /DEST usando LR mistura enzimática clonase (Invitrogen). O pLenti6.3 vector vazio /V5-DEST foi utilizado como um controlo simulado. lentivírus recombinantes foram produzidos em células 293FT, e utilizado para infectar células SNU216 e SNU638, de acordo com as instruções do fabricante (ViraPower Lentivirus Expression System; Invitrogen). DPY30-superexpressão células estáveis ​​foram estabelecidas pela seleção com blasticidina (7,5 ug /ml) (Invitrogen).

Para os ensaios de resgate, nós modificamos, seguido um protocolo de “interferência RNAi usando coleção Precision Lenti ORF ‘ (https://dharmacon.gelifesciences.com/uploadedFiles/Resources/precision-lentiorfs-rnai-rescue-appnote.pdf). Resumidamente, as células foram infectadas com lentivírus recombinantes (pLenti6.3-V5 /DEST ou construções DPY30-over). 24 horas após a transdução, os meios contendo vírus foram removidos e substituídos com meio de cultura completo. No dia seguinte, blasticidina foi adicionado a uma concentração de 7,5 ug /ml. As células foram mantidas sob selecção durante seis dias, substituindo médio ou passaging cada 2-3 dias conforme a necessidade. As populações seleccionadas de células de controlo ou células que expressam DPY30 foram usadas para experiências de transfecção utilizando DPY30 siRNA alvejando a grelha de leitura aberta (ORF) ou na região 3 ‘não traduzida (UTR).

-PCR em tempo real

As amostras de tecidos foram obtidos de 23 pacientes primários coreanos não relacionados gástricas cancerosas que foram submetidos à ressecção cirúrgica no Hospital da Universidade de Pusan ​​Nacional e Pusan ​​Hospital Nacional Yangsan University e forneceram consentimento informado. O estudo foi aprovado pelo National University Hospital-Institutional Review Board Pusan ​​(PNUH-IRB) e da National University Yangsan Hospital-Institutional Review Board Pusan ​​(PNUYH-IRB). O ARN total a partir de tecidos e células foram extraídos utilizando o reagente Trizol (Invitrogen) ou um RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, EUA), de acordo com as instruções dos fabricantes. Quantitative PCR quantitativo em tempo real (real-time PCR) foi utilizada para verificar os níveis de ARNm DPY30. Os cDNAs foram sintetizados com transcriptase reversa de MMLV (Promega, Madison, WI, EUA), iniciadores de dNTP, e o oligo-dT. As sequências dos iniciadores utilizados foram os seguintes: DPY30, 5′-AAC GCA GGT TGC AGA AAA TCC T-3 ‘e 5′-TCT GAT CCA GGT AGG CAC GAG -3′; WDR5, 5′-TGT TAC TGG TGG GAA GTG GA -3 e 5’-CTG TTG GGT GAC AAG CTG TT-3 ‘; RBBP5, 5’- AGT GCA CAC ATC CAT CCA GT-3 ‘e 5′-TCA CAG TCG CCT GAA AGA AC-3′; ASH2L, 5’- TAC AAG AGC TGC ACG GTT TC -3 ‘e 5′-CCA GCC CAT GTC ACT CAT AG -3′; GAPDH, 5’-TGG GCC AGG AAA TCA CAT CC-3 ‘e 5′-CTC AGC CCG AGT GGA AAT GG -3’. PCR em tempo real foi realizado utilizando um sistema de tempo real de PCR LightCycler ™ 96 (Roche, Nutley, NJ) e FastStart DNA Essencial verde mestre (Roche), de acordo com as instruções do fabricante. GAPDH foi usada como um controlo interno.

A imuno-histoquímica

coloração imuno-histoquímica com o anticorpo de coelho anti-humano DPY30 policlonal (Sigma-Aldrich) foi realizada numa matriz de tecido de cancro gástrico (n = 59) adquirido de SUPER BIO CHIPS (Seul) ou em seções 4 mícrons de espécimes embebidos em parafina. Resumidamente, após desparafinização e re-hidratação, as lâminas foram tratadas com peróxido de hidrogénio a 0,3% durante 30 minutos para inibir a actividade da peroxidase endógena, e bloqueadas com 10% de soro normal de burro (NDS) e 1% de BSA em 1 × solução salina tamponada com fosfato (PBS). As lâminas foram então incubadas durante a noite a 4 ° C em tampão de bloqueio contendo um anticorpo de coelho anti-humano DPY30 primário (1:80, Sigma-Aldrich). O anticorpo secundário (conjugado com HRP) de ligação foi realizado com uma diluição de 1: 200 em tampão de bloqueio durante 2 horas à TA. A detecção foi realizada com HRP (Vector Laboratories), e as lâminas foram contrastadas, tratando-as durante 1 min com tampão de coloração de hematoxilina (Sigma-Aldrich).

proliferação celular ensaio

Um dia após a transfecção de células com siRNA, o meio foi substituído com meio com FBS a 1%, e, quatro dias mais tarde, foram adicionados 10 ul de Ez-Cytox (ITSBIO, Seul) e incubou-se durante 0,5 a 2 horas. A fim de verificar o efeito da sobreexpressão DPY30 na proliferação de células, as células foram semeadas em meio com FBS a 10%, e depois de três dias de cultura, foram adicionados 10 ul de Ez-Cytox (ITSBIO) e incubou-se durante 0,5 a 2 horas. viabilidades celulares foram determinadas medindo a absorvância a 450 nm usando VICTOR3 vários leitores (PerkinElmer, MA, EUA).

Boyden câmara de ensaio

A modificado Boyden transpoço câmara (Neuro Probe, Gaithersburg, MD, EUA) foi utilizado. A câmara inferior foi preenchida com 50 ul de meio RPMI contendo 10% de FBS. Para examinar os efeitos de DPY30 conhecido para baixo, SNU1 e SNU16 (células não aderentes) foram transfectadas com o ARNsi de ORF-direccionamento. Um dia após a transfecção, as células foram lavadas, suspensas a uma densidade de 5 x 10

5 células /ml em 50? L de meio RPMI suplementado com FBS a 0,5%, e semearam-se para dentro da câmara superior. Para eliminar os efeitos de proliferação, adicionou-se mitomicina C (0,01 ug /ml, Sigma-Aldrich). As células foram então incubadas durante 24 horas a 37 ° C com 5% de CO2. O número de células que migraram foi avaliada por contagem de células poços de fundo. Para examinar os efeitos da sobre-expressão DPY30, as células estáveis ​​(células aderentes; SNU216 e SNU638) foram usadas. As células (mock e DPY30-over) foram tratadas com tripsina, e semeadas a uma densidade de 1 x 10

5 células /mL. Para eliminar os efeitos de proliferação, adicionou-se mitomicina C. As células foram deixadas migrar durante quatro horas, as membranas foram fixadas e coradas com Diff-Quik solução (Sysmex, Kobe, Japão) e lavou-se com água destilada. o número de células em 10 campos escolhidos aleatoriamente foram contadas utilizando um microscópio de luz. As experiências foram realizadas em triplicado.

Matrigel ensaio de invasão

As habilidades invasivos de células cancerosas foram avaliados através de 8 mícrons porosas inserções câmara BioCoat Matrigel (BD Bioscience, San Jose, CA, EUA). Um dia após a transfecção com o SCR ou DPY30 siRNA, as células foram tripsinizadas, e suspensas a uma densidade de 5 x 10

4 células /ml em 500 ul de meio RPMI suplementado com FBS a 0,5% e mitomicina C (0,01 ug /ml, Sigma -Aldrich). As células foram então adicionados às pastilhas da câmara e colocados em poços cheios com 0,7 ml de meio suplementado com 10% de FBS como quimioatractor. Após incubação durante 24 ou 48 horas, não-invasoras células no topo da membrana foram removidas por raspagem, e células invasivas sobre a parte inferior da membrana foram fixadas e coradas com Diff-Quik solução (Sysmex). o número de células em 10 campos escolhidos aleatoriamente foram contadas utilizando um microscópio de luz. As experiências foram realizadas em triplicado e, pelo menos, 5 campos foram contadas por experiência.

A análise estatística

Os resultados são expressos como médias ± desvios padrão (DP) de três experiências independentes. Os significados das diferenças foram determinadas usando o Student

t

-teste para observações desemparelhados.

valores P

de 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

A expressão de DPY30 em tecidos com câncer gástrico

Para investigar a expressão DPY30 no cancro gástrico humano, foi realizada imuno-histoquímica usando uma matriz de tecido de câncer gástrico ou arquivo de parafina-embedded secções de tecido. Em tecidos normais gástricas, expressão DPY30 era de difícil detecção (Figura 1A), mas em tecidos de cancro DPY30 proteína foi amplamente sobre-expresso (Fig 1B-1D). Notavelmente, DPY30 foi overexpressed em invadir células cancerosas gástricas (Fig 1B-1D). Além disso, determinou-se os níveis de mRNA de DPY30 em uma linha imortalizada de células epiteliais normais gástrica (HFE145) e seis linhas gástricas derivadas de células de cancro (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 e NCI-N87) utilizando PCR em tempo real. O nível de ARNm de DPY30 foi consideravelmente mais elevada (dobre mudança 5) em SNU1 e SNU16 que em HFE145 células, ao passo que o nível de expressão de DPY30 em SNU216, SNU620 e SNU638 foi semelhante àqueles em HFE145 células e foi menor (dobre mudança 10) no NCI-N87 (Figura 1E). Nós também verificamos os níveis de mRNA de DPY30 em tecidos com câncer gástrico. DPY30 foi altamente expressa em 15 casos (15/23, 65%), em comparação com tecidos normais (Figura 1F). Estes resultados indicam que é altamente expressa DPY30 em alguns tipos de cancro gástrico humano.

(A-D) Coloração imuno-histoquímica demonstrou a sobre-expressão de DPY30 em tecidos de cancro gástrico. Nomeadamente, a sua sobre-expressão era, obviamente, maior em células cancerosas invasoras (B-D) do que na mucosa gástrica normal (A). (E) O nível de mRNA de DPY30 em células de câncer gástrico (SNU1, SNU16, SNU216, SNU620, SNU638 e NCI-N87) e normais gástrica células epiteliais (HFE145) foi determinada por PCR em tempo real utilizando primers específicos para DPY30. GAPDH foi utilizada para normalizar os dados. Os valores mostrados são as médias ± desvios-padrão de três experiências independentes realizadas em triplicado. *,

p Art 0,01 (

t

teste de Student, contra HFE145). (F) A expressão de DPY30 em tecidos de cancro gástrico foi analisada por PCR em tempo real utilizando iniciadores específicos para DPY30. GAPDH foi utilizada para normalizar os dados. Os valores são as médias ± desvios-padrão de três experiências independentes realizadas em triplicado. *,

p Art 0,01; **,

p Art 0,05 (

t

teste de Student, contra normal).

Papéis de DPY30 na proliferação de células cancerosas gástricas

A fim de determinar possíveis papéis de DPY30 em células de cancro gástrico, primeiro knocked-down DPY30 usando o ORF de direccionamento DPY30 siRNA e monitorizada a sua eficiência knockdown por PCR em tempo real (Figura 2A). A ORF de direccionamento DPY30 ARNsi (100 nM) diminuiu o nível de ARNm de DPY30 em HFE145, SNU1, SNU16, SNU216, e SNU638 células, em comparação com ARNsi mexidos (SCR) de 78%, 89%, 79%, 76%, e 88%, respectivamente. Cinco dias após a transfecção de células com o siRNA SCR ou ORF de direccionamento, realizamos ensaios de proliferação. Knockdown de DPY30 inibiu as proliferações de HFE145, SNU1 e SNU16, em comparação com SCR de 31%, 69% e 71% respectivamente, enquanto que o knockdown não afetou as proliferações de SNU216 e SNU638 (Figura 2B), em que o nível de expressão DPY30 foi baixa (Fig 1E). Em seguida, nós produzimos linhas DPY30-superexpressão celulares (DPY30-over) usando HFE145, SNU216 e SNU638 células, e em seguida, em comparação com os níveis de mRNA DPY30 em células simuladas (controle) e células DPY30-over. Real-time PCR resultados mostraram que o nível de expressão DPY30 foi de 4,2, 3,5 e 3,2 vezes superior em DPY30 que sobre-expressam HFE145, SNU216 e SNU638 células do que as células simuladas, respectivamente (Fig 2A). DPY30 superexpressão reforçada as proliferações de HFE145, SNU216 e SNU638 células contra células simuladas de 1,9, 2,2 e 1,6 vezes, respectivamente (Figura 2B).

(A) PCR em tempo real foi usada para determinar a eficiência de knockdown ou sobre-expressão de DPY30 em HFE145, SNU1, SNU16, SNU216 e SNU638 células. eficiência knockdown foi determinada depois que as células com 100 nM DPY30 siRNA visando o ORF ou mexidos siRNA (SCR) transfecção. A sobre-expressão eficiências foram determinados em células que sobre-expressam DPY30 e simulados. (B) Efeito de sobreexpressão DPY30 knockdown ou na proliferação celular. Um ensaio de viabilidade celular foi utilizado para medir a proliferação das células na presença de 1% de FBS. Para as experiências DPY30 knockdown, ensaios de viabilidade celular foram efectuados cinco dias após a transfecção de 100 nM DPY30 siRNA ou SCR. Depois de três dias de cultura, ensaios de viabilidade celular foram realizados em DPY30-over e células falsamente. (C) Análise da expressão de DPY30 depois conhecido para baixo ou a sobre-expressão por ARNsi ou DPY30 ORF respectivamente. A ORF-segmentação ou o siRNA 3′-UTR-alvo foi utilizado para o knock-down. (D) exógena DPY30-ORF resgatado a inibição da proliferação pelo 3′-UTR de direccionamento DPY30 siARN. Mock células que sobre-expressam ou DPY30 foram transduzidas com os dois tipos de DPY30 siRNA (3′-UTR de direccionamento ou ORF-targeting), em seguida, ensaio de viabilidade celular foi examinada. Os valores são as médias ± desvios-padrão de três experiências independentes realizadas em triplicado. *,

p Art 0,01 (

t

teste de Student, contra SCR ou Mock).

Para confirmar a especificidade da DPY30 siRNA, foram realizados os experimentos de resgate. Para as experiências de socorro, foi utilizado um siRNA alvejando DPY30 3′-UTR, em vez da ORF porque o siRNA ORF de direccionamento também podem degradar o ADN exógeno DPY30 ORF que introduzido. Para superexpressão DPY30, nós transduzidas SNU1 e SNU16 com partículas virais, pLenti6.3-V5 /DEST (controle) ou construções DPY30-ORF-over. SNU1 ou SNU16 células DPY30-superexpressão apresentaram maior expressão de DPY30 2.1 ou 2.5 vezes maior do que as células simuladas, respectivamente (Fig 2C). O siARN ORF de direccionamento levou à diminuição da regulação dos níveis de expressão por DPY30 maior do que 75% em simulada, bem como células que sobre-expressam DPY30. A 3′-UTR-targeting siRNA regulada a expressão DPY30 em mais de 85% em células simuladas, enquanto que, nas células-superexpressão DPY30, diminuiu a expressão DPY30 a um nível semelhante ao de células SCR siRNA-transfectadas ( A Fig 2C). Este resultado indica que o DPY30-ORF de ADN exógena é resistente à 3′-UTR-targeting siRNA e é expresso a um nível semelhante ao do ARNm endógeno DPY30. A ORF-siRNA alvejando inibiu a proliferação de células, independentemente da expressão DPY30 exógena (Figura 2D). Proliferação também foi inibida pela siRNA 3’UTR-alvo em células de simulação, no entanto, foi parcialmente inibida em células DPY30-sobre-expressam. Em células que sobre-expressam DPY30, o siRNA ORF de direccionamento diminuiu a proliferação de SNU1 e SNU16, em comparação com SCR ARNsi por 74% e 66%, respectivamente, no entanto, o siARN 3′-UTR de direccionamento diminuiu em 20% e 8%, respectivamente . Este resultado indica que DPY30 exógena resgata a inibição da proliferação induzida pelo siRNA 3′-UTR-alvo, e os fenótipos causadas por DPY30 siRNA específico não são efeitos fora do alvo.

Porque DPY30 é um componente do enfermarias , examinamos expressões e funções de outros componentes de alas. PCR em tempo real mostraram que os níveis de ARNm de WDR5 e RBBP5 em SNU1, SNU16, SNU216 e SNU638 foram semelhantes aos de HFE145. No entanto, o nível de ARNm de ASH2L foram significativamente maiores (dobre mudança 3) em SNU1 e SNU16 que em HFE145 células (Fig 3A) como DPY30 na Fig 1E. A fim de investigar se os componentes Wrad estão associados com a proliferação de células de cancro gástrico, que knockdowned Wrad cada componente usando a sua siRNA específico e monitorizada eficiências knockdown por PCR em tempo real (Figura 3B). Cada ARNsi (100 nM) diminuiu os níveis de ARNm em células SNU1 e SNU16, em comparação com SCR de 65% -75%. Knockdown de WDR5 e RBBP5 inibiu a proliferação de células e SNU16 SNU1, em comparação com 30-48% por SCR (Fig 3C). No entanto, ASH2L inibiu a proliferação de SNU1 e SNU16, em que o nível de expressão foi ASH2L elevada, em comparação com SCR em 85% e 75%, respectivamente.

(A) Os níveis de ARNm de WDR5, RBBP5 e ASH2L em HFE145, SNU1, SNU16, SNU216 e SNU638 células foram determinados por PCR em tempo real, usando primers específicos para WDR5, RBBP5 e ASH2L. GAPDH foi utilizada para normalizar os dados. eficiência (B) Queda foi determinada por PCR em tempo real. eficiência knockdown foi determinada após transfecção de células com 100 nM WDR5, RBBP5 e ASH2L siRNA ou mexidos (SCR). (C) Efeitos da WDR5, RBBP5 e ASH2L knockdown sobre a proliferação celular. Um ensaio de viabilidade celular foi utilizado para medir a proliferação das células na presença de 1% de FBS. 24 horas após a transdução e foram realizados ensaios de viabilidade celular. Os valores são as médias ± desvios-padrão de três experiências independentes realizadas em triplicado. *,

p Art 0,01 (Student

t

teste, contra HFE145 (A) ou SCR (BC)).

Papéis de DPY30 na migração e invasão das células cancerosas gástricas

a seguir, analisou se DPY30 regula a migração de células cancerosas gástricas. Knockdown de DPY30 diminuiu as migrações induzidas por FBS das células SNU1 e SNU16 contra SCR em 35% e 45%, respectivamente (Figura 4). Em contraste, a sobre-expressão aumentada DPY30 as migrações induzidas FBS de SNU216 e SNU638 células em comparação com células falsamente em 2,5 e 2,2 vezes, respectivamente (Figura 4). Estes resultados levaram-nos a examinar o papel do DPY30 na invasão das células cancerosas gástricas. Num ensaio de invasão de Matrigel, DPY30 siARN inibiu as invasões induzidas por FBS das células SNU1 e SNU16 contra SCR siRNA de 65% e 84%, respectivamente (Figura 5A e 5C). Além disso, a sobre-expressão aumentada DPY30 as invasões induzidas por FBS das células SNU216 e SNU638 contra células simuladas de 3,2 e 2,9 vezes, respectivamente (Fig 5B e 5C). Estes resultados mostram que DPY30 promove a migração e a invasão de células de cancro gástrico.

de ensaio (A) Uma câmara de Boyden foi usada para medir a migração de células de cancro gástrico. 10% de FBS foi utilizado para induzir a migração e a mitomicina C (0,01 ug /ml) foi adicionado para remover os efeitos de proliferação. Dois dias após a transfecção com 100 nM ORF-alvo DPY30 siRNA ou mexidos (SCR) siRNA, foram realizados ensaios de migração (ensaio de câmara de Boyden). Os ensaios de migração foram efectuados em DPY30-over e células falsamente após cultura durante um dia. Barra = 100 um. células (B) migraram foram contadas e os resultados são apresentados como um gráfico de barras. Os valores são as médias ± desvios-padrão de três experiências independentes realizadas em triplicado. *,

p Art 0,01 (

t

teste de Student, contra SCR ou Mock).

(A-B) Um ensaio de invasão Matrigel foi utilizado para medir a invasão de células de câncer gástrico. Os resultados apresentados são representativos dos resultados obtidos. 10% de FBS foi utilizado para induzir a invasão, e mitomicina C (0,01 ug /ml) foi adicionado para remover os efeitos de proliferação. ensaios de invasão foram realizados dois dias após a transfecção com 100 nM ORF-alvo DPY30 ou SCR siRNA. Depois de cultura durante um dia, o ensaio de invasão foi realizada durante a DPY30-over e células falsamente. Barra = 100 um. (C) As células foram contadas invasoras e os resultados são apresentados como um gráfico de barras. Os valores são as médias ± desvios-padrão de três experiências independentes realizadas em triplicado. *,

p Art 0,01 (

t

teste de Student, contra SCR ou Mock).

Discussão

Papéis de DPY30 em biologia do câncer foram pouco caracterizada, embora seus papéis na diferenciação de CES e células progenitoras hematopoiéticas tinha sido relatada [10, 12]. No presente estudo, mostramos novos papéis de DPY30 no câncer gástrico. DPY30 é amplificado (dados não mostrados) e altamente expresso (figura 1) em alguns tecidos de cancro gástrico. Além disso, a sua sobre-expressão regulada knockdown ou a proliferação, a migração e a invasão de células de cancro gástrico. Alterações na expressão, translocações cromossómicas e mutações somáticas de genes que codificam subunidades de complexos MLL SET1 /têm sido relatados em muitos tipos de câncer. Estes resultados suportam as funções críticas de membros do SET1 /complexo MLL na progressão do cancro.

Up-regulação da expressão DPY30 foi observada apenas nas células cancerosas gástricas SNU1 e SNU16 entre seis células cancerosas gástricas que examinamos. No entanto a sua sobre-regulação foi observado em mais de metade dos tecidos de cancro gástrico temos examinados (figura 1). É difícil de explicar esta discrepância. No entanto, é óbvio que o número de tecidos de cancro gástrico, examinámos não é suficiente. Assim, um estudo expressão extensa usando muito mais número de tecidos é necessária para avaliar o valor clínico no futuro.

Papéis de SET1 /complexo metiltransferase MLL H3K4 na biologia do câncer é complexa. subunidades reguladoras de SET1 /complexos MLL, incluindo Wrad, contêm ambos oncoproteínas potentes e supressores tumorais. Por exemplo, o gene que codifica Menin MEN1, uma subunidade integral da MLL1 e MLL2, e é mutante em pacientes com neoplasia endócrina múltipla tipo 1 (MEN1) [18, 19]. Além disso, menin regula p18 (CDKN2C) e p27 (CDKN1B), recrutando MLL1 complexo [20]. Em contraste, WDR5, um componente do complexo Wrad, tem sido relatado para actuar como uma oncoproteína no cancro da próstata, em que se encontra sobre-expresso e crucial para a proliferação induzida pelo androgénio de células tumorais [21]. ASH2L, que é outro componente do complexo Wrad e podem interagir com a oncoproteína MYC [22], é crucial para a transformação MYC /Ha-ras-dependente de fibroblastos de embrião de rato. Além disso, é sobre-expressa em muitos tipos de tumores e é crítica para a proliferação de células de tumor [23]. No presente estudo, mostramos papéis de DPY30 como uma oncoproteína no câncer gástrico.

O que são mecanismos moleculares papéis de DPY30 subjacentes no câncer gástrico? Apesar de não revelar, várias hipóteses podem ser propostas com base em estudos anteriores. Uma das hipóteses possíveis é que DPY30 superexpressão leva aos overexpressions de oncogenes por meio de aumento da atividade H3K4MT. Depleção de DPY30 ou ASH2L leva a uma diminuição na H3K4me3, enquanto WDR5 e RBBP5 são cruciais para todos os três tipos de H3K4 (H3K4me1, H3K4me2, e H3K4me3) [6, 8, 10, 11]. Além disso, a sobre-expressão de DPY30 sozinho pode aumentar a actividade H3K4MT [10]. Desde H3K4me2 /3 é uma marca activo para a transcrição [3, 24], aumentou H3K4MT pode regular positivamente directamente muitos genes, tais como os oncogenes, ou alternativamente, indirectamente, infra-regular supressores tumorais. Um relatório anterior apoiando esta hipótese é que ASH2L, um componente crítico de SET1 /complexo MLL, foi mostrado para jogar como uma oncoproteína [25, 26]. Outro relatório anterior é que DPY30 ativa diretamente a expressão de proteínas de identificação via H3K4 metilação [13, 27]. ID proteínas inibiram as actividades de ETS1 ETS2 e que podem induzir uma de gene supressor de tumores, p16. No presente estudo, mostramos que os componentes do Wrad (WDR5, RBBP5 e ASH2L) pode inibir a proliferação de células cancerosas gástricas (Fig 3), sugerindo que o ato DPY30 através do aumento da atividade H3K4MT. Mais estudos são necessários para desvendar os mecanismos subjacentes aos papéis de DPY30 em células cancerosas gástricas.