Abstract

A via de sinalização /β-catenina Wnt desempenha um papel importante na progressão do câncer de cólon.

DACT1

foi identificado como um modulador da sinalização de Wnt através da sua interacção com Dishevelled (Dvl), um mediador central de ambas as vias de Wnt canónicos e noncanonical. No entanto, as funções de

DACT1

na via de sinalização Wnt /β-catenina permanecem obscuros. Aqui, apresentamos evidências de que

DACT1

é um importante regulador positivo no câncer de cólon através de regulação da estabilidade e sublocation de β-catenina. Nós mostramos que

DACT1

promove a proliferação de células cancerígenas

in vitro

e tumor de crescimento

in vivo

e aumenta o potencial migratório e invasivo de células de cancro do cólon. Além disso, a expressão mais elevada de

DACT1

não só aumenta as fracções nucleares e citoplasmáticos de β-catenina, como também aumenta a sua fracção associada a membranas. A sobre-expressão de

DACT1

leva ao aumento da acumulação de não fosforilado β-catenina no citoplasma e particularmente nos núcleos. Nós demonstramos que

DACT1

interage com a GSK-3β e β-catenina.

DACT1

estabiliza beta-catenin via

DACT1

induzidas por efeitos sobre GSK-3β e interage diretamente com proteínas β-catenina. O nível de fosforilada GSK-3β na Ser9 é significativamente aumentada após a expressão elevada de

DACT1

.

DACT1

medeia a localização subcelular de β-catenina através do aumento do nível de fosforiladas GSK-3β em Ser9 para inibir a actividade de GSK-3β. Tomados em conjunto, os nossos identifica estudo

DACT1

como um importante regulador positivo no câncer de cólon e sugere uma estratégia potencial para o controle terapêutico da via β-catenina-dependente

Citation:. Yuan G, Wang C, C Ma, Chen N, Tian Q, T Zhang, et ai. (2012) Função oncogênicas do

DACT1

no cancro do cólon através do Regulamento de β-catenina. PLoS ONE 7 (3): e34004. doi: 10.1371 /journal.pone.0034004

editor: Jingwu Xie, da Escola de Medicina da Universidade de Indiana, Estados Unidos da América

Recebido: 18 de julho de 2011; Aceito: 21 de fevereiro de 2012; Publicação: 21 de março de 2012

Direitos de autor: © 2012 Yuan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation da China, No. 30770440. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. os autores têm declarou que não existem interesses conflitantes.

Introdução

as mutações e a expressão desregulada de componentes da antiga via de sinalização Wnt estão ligadas à oncogênese em vários sistemas, e têm sido particularmente implicada no início de cancro do cólon [1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]. Mais de 90% dos cancros colorrectais são originários a partir de mutações activas na via Wnt [1]. As mutações foram descritos na polipose adenomatosa coli (

APC) de genes em casos de polipose adenomatosa familiar (FAP), e esta mutação também ocorre em uma elevada percentagem dos cancros colorretais esporádicos [9], [10].

APC

mutações representam um evento precoce na tumorigénese colorectal [11].

β-catenina (símbolo oficial CTNB1) é considerado um jogador central na via de sinalização Wnt. Embora a activação de Wnt pode ocorrer através de mutações que afectam sítios de fosforilação dentro do exão 3 de β-catenina numa minoria de tumores colo-rectais [12], [13], diversos outros componentes da via de sinalização Wnt contribuir para o cancro colorectal através dysregulating a actividade ou localização de β-catenina [14], [15].

O gene

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(Dapper1 /Dpr1), localizado no cromossomo 14q22.3, codifica uma proteína ácido amino 836 com uma leucina putativo zíper (LZ) domínio na extremidade amino-terminal e uma ligação de consenso PDZ (PDZ-B) motivo na extremidade carboxi-terminal que permite o

DACT1

proteína interagir com o Dishevelled (Dvl) domínio PDZ [ ,,,0],16]. análises de bioinformática revelaram que

DACT1

mRNA é expresso na membrana amniótica, cérebro fetal, olho, coração, adulto medula cerebral, câncer gástrico (características celulares anel de sinete), RER + tumor do cólon, leucemia linfoblástica aguda, tumor de células germinativas , tumores condrossarcoma, e paratiróide [17]. Além disso, com base na conservação evolutivo e funcional das moléculas de sinalização de Wnt, bem como a localização cromossómica de DACT1 humano, o

gene DACT1

é também previsto para ser um gene associado a um cancro potente [17].

DACT1

foi relatado para ser regulada negativamente no carcinoma hepatocelular [18]. Um relatório recente identificou uma correlação entre o

expressão DACT1

no cancro do pulmão e grau histológico pobre, grande tamanho do tumor, extensão da invasão tumoral e metástase ganglionar [19].

Embora alguns estudos têm mostraram associações entre a

expressão e câncer DACT1

, a função de

DACT1

na via WNT de sinalização /β-catenina permanece obscuro. Um mecanismo possível é que a GSK-Dpr estabiliza 3β e axina no complexo APC, tal como mostrado por estudos de co-imunoprecipitação [16]. Outra possibilidade é que compete com Dpr Fz para a ligação ao domínio PDZ de Dvl, bloqueando deste modo a transdução de sinal através de Dvl, e, portanto, inibe a estabilização DVL-mediada de β-catenina [20]. Yau et al. relataram que Dpr1 humana foi regulada negativamente em carcinoma hepatocelular, e esta regulação negativa foi correlacionado com a acumulação citoplásmica de β-catenina [18]. No entanto, neste relatório, descobrimos que

DACT1

é sobre-expressos em câncer de cólon, e atua para melhorar celular proliferação, migração e invasão em linhas celulares de cancro do cólon. Mostrámos que

DACT1

interage com a GSK-3β e β-catenina. Temos ainda demonstrado que

DACT1

estabiliza beta-catenin via

DACT1

induzidas por efeitos sobre GSK-3β e interage diretamente com β-catenina. Nós também demonstraram

DACT1

inibe a actividade de GSK-3β através do aumento do nível de fosforiladas GSK-3β em Ser9, que altera a localização subcelular de β-catenina. É particularmente promove níveis de β-catenina na membrana plasmática e no núcleo.

Resultados

DACT1

é abundante no cólon humano carcinoma

Para identificar os potenciais papéis de

DACT1

no desenvolvimento e progressão do carcinoma do cólon, foi utilizada quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) para avaliar o nível de expressão do gene. Nós comparamos a expressão em seis tecidos de câncer para aqueles em seis amostras pareadas de controlo normal da mucosa do cólon. Os resultados mostraram que o nível de

DACT1

ARNm foi significativamente elevados em todas as seis amostras de cancro do cólon (Figura 1A). Os dados de expressão de gene foram adicionalmente confirmados por transferência de Western, que foram realizados com a utilização de lisados ​​celulares preparados a partir de amostras solúveis colectomia cirúrgicos. Os resultados confirmaram que altos níveis de proteína

DACT1

estão presentes no câncer de cólon (Figura 1B).

(A)

DACT1

níveis de mRNA foram testadas usando quantitativo em tempo real A análise por RT-PCR. As amostras de adenocarcinoma de cólon (T, barras brancas) e mucosa aparentemente normal de controle (N, barras pretas) foram analisados ​​em seis casos de câncer de cólon. (B) Expressão de

DACT1

proteína no adenocarcinoma de cólon humano (T) e de aparência normal da mucosa de controlo (N) em seis casos, tal como determinado por análise de Western immunoblotting. A expressão de GAPDH foi utilizado como controlo de carga.

DACT1

aumenta a proliferação celular

in vitro

e cólon tumorigênese

in vivo

Para entender a função de

DACT1

no câncer de cólon, exploramos o efeito da ectópica

expressão DACT1

no crescimento celular in vitro em linhas de células com diferentes níveis de endógena

DACT1

expressão. A seguir à transfecção com um

DACT1

construção de expressão de ADNc, SW480 células cancerígenas do cólon, que expressam níveis muito baixos de endógenas

DACT1

, demonstrou um aumento significativo na proliferação celular (Figura 2A). Por outro lado, a proliferação celular diminuiu quando endógena

DACT1

expressão foi silenciado por transfecção estável com vetores de siRNA que tiveram como alvos

DACT1

na HCT116, linhas de células LoVo e cancro do cólon HT29, que têm níveis endógenos muito mais elevados de

DACT1

(Figura 2B-D). Para confirmar estes resultados, endógena

DACT1

expressão foi silenciado por transfecção estável com outros vetores siRNA (

DACT1

siRNA1) que teve como alvo regiões distintas de

DACT1

nas células HCT116 e foram observados os mesmos resultados (Figura S1A-B)

(a) Esquerda:. superexpressão de

DACT1

em células SW480 transfectadas de forma estável. Direita: crescimento em ensaio de proliferação de curva em>

-transfected células SW480 (média ± SEM; n = 3, * P 0,05 contra células transfectadas com vector vazio). (B, C, D) Esquerda:

expressão DACT1

no tipo selvagem, controlar transfectadas com siRNA, e

DACT1

HCT116 transfectadas com siRNA, as células LoVo e HT29. Direita: ensaios de crescimento em curva

DACT1

HCT116 transfectadas com ARNsi, LoVo e células HT29 (média ± SEM; n = 3, * P 0,05 contra células do tipo selvagem). (E) o volume médio do tumor avaliados semanalmente após a injecção de animais com ARNsi de controlo, ou

DACT1

células HCT116 transfectadas com ARNsi (média ± SEM; n = 3, * P 0,05). (F) imagens representativas de oito semanas após a injeção de células de câncer de cólon do rato com siRNA controle ou

DACT1

células HCT116 transfectadas com siRNA.

Para examinar os efeitos do silenciamento de

DACT1

no crescimento do tumor de cólon in vivo, células HCT116 que expressam de forma estável um controle siRNA ou

DACT1

siRNA foram utilizados. As células (5 × 10

6) foram injectadas no tecido subcutâneo do rato nu (n = 8 animais por grupo). Os tumores foram medidos semanalmente com um compasso de calibre de vernier, e os seus volumes foram calculados de acordo com a seguinte fórmula: π /6 x comprimento x largura

2 [21]. Todos os animais injectados com células HCT116 que expressam ARNsi de controlo desenvolveram tumores aos 14 dias após a injecção, enquanto apenas 75% (6/8) do

DACT1

animais de ARNip desenvolveram tumores. Cinquenta e seis dias após a injecção, os tumores dos animais de controlo de siRNA foram significativamente maiores (Figura 2F). O volume médio do tumor era 2,068.78 ± 561,57 milímetros

3 em ratinhos injectados com células HCT116 que expressam ARNsi de controlo, em comparação com o volume médio do tumor em ratinhos injectados com células HCT-116 que expressa

DACT1

siRNA (503,46 ± 178,90 mm

3) (Figura 2E). Estes dados demonstram o importante papel da

DACT1

na promoção do crescimento de células de câncer de cólon.

DACT1

aumenta a migração e falta de ancoragem das células cancerígenas do cólon

proliferação independente de Anchorage é uma característica da transformação oncogénica e é considerado para ser propício para a proliferação de células cancerosas de distância de seu local original. Com este conhecimento, examinamos a capacidade de

DACT1

para impulsionar o crescimento independente de ancoragem de células de câncer de cólon em ensaios de formação de colónias em agar mole. A sobre-expressão de

DACT1

reforçada a proliferação independente de ancoragem de células SW480 (Figura 3A). Regulação negativa do

DACT1

reduziu o potencial independente de ancoragem de HCT116, LoVo e células HT29 (Figura 3B-D e s1c). Além disso, observou-se que

DACT1

superexpressão reforçado o potencial migratório das células SW480 por transpo� ensaios (Figura 3E e I). Por outro lado, o potencial migratório das células diminuiu quando endógena

DACT1

expressão foi silenciado por transfecção estável com vetores de siRNA que tiveram como alvos

DACT1

em HCT116, LoVo e células HT29 (Figura 3F-I). Na sequência destes resultados, podemos concluir que

DACT1

aumenta a independência de ancoragem em células cancerígenas do cólon e seu potencial migratório.

(A) ensaio de agar macio no

DACT1

-transfected SW480 células após 14 dias de incubação. (B, C, D) Ensaio de agar mole em HCT116 transfectadas com ARNsi, as células LoVo e HT29 após 14 dias de incubação. (E) Imagens representativas são mostradas para o sobre-expressão de

DACT1

em células SW480 transfectadas de forma estável. As células foram semeadas numa câmara de Transwell e deixadas migrar através da câmara para o meio condicionado específico de células durante 24 h. Fotomicrografias de células que migram coradas foram tomadas sob iluminação de campo claro (20 ×). (F, G, H) Imagens representativas são mostradas para, as células LoVo e HT29 in

DACT1

HCT116 transfectadas com ARNsi. As células foram semeadas numa câmara de Transwell e deixadas migrar através da câmara para o meio condicionado específico de células durante 24 h. Fotomicrografias de células que migram coradas foram tomadas sob iluminação de campo claro (20 ×). (I) A quantificação do ensaio de migração. Os resultados foram obtidos a partir de três experiências separadas, cada uma realizada em triplicado. Migração foi determinada por contagem de células em seis campos microscópicos aleatórios por poço (média ± SEM; * p 0,05 contra células do grupo controle).

DACT1

aumenta a invasão das células cancerígenas do cólon

in vitro

ou

in vivo

a característica mais perigosa de malignidade é o potencial invasivo e metastático de células tumorais. Para testar se a invasão celular foi afetada pela

DACT1

, foi investigado os efeitos do

DACT1

na invasão celular através de Matrigel. A sobre-expressão de

DACT1

reforçada a invasão de células SW480 (Figura 4A e E). Regulação negativa do

DACT1

reduziu o potencial invasivo da HCT116, LoVo e células HT29 através do Matrigel (Figura 4B-E). Para examinar os efeitos do

DACT1

silenciamento sobre a invasão de células cancerígenas do cólon in vivo, as células infectadas HCT116 que expressam um controle siRNA ou

DACT1

siRNA. Em seguida, 5 × 10

6 células foram injectadas no tecido subcutâneo de cada ratinho nu (n = 8 animais por grupo). Cinquenta e seis dias depois, os tumores de seis em ratinhos nus transfectadas com siRNA oito controle tinham invadido na musculatura, enquanto que apenas dois dos tumores em

DACT1

animais transfectadas com siRNA tinham invadido na musculatura. Estes dados novos mostram que

DACT1

afetou o potencial invasivo de células de câncer de cólon in vitro e in vivo.

(A) Imagens representativas são mostradas para o sobre-expressão de

DACT1

-transfected SW480 células. As células foram semeadas numa câmara de invasiva e deixou-se invadir a câmara para o meio condicionado específico de células durante 24 h. Fotomicrografias de células invasoras coradas foram tomadas sob iluminação de campo claro (20 ×). (B, C, D) Imagens representativas são mostradas para

DACT1

HCT116 transfectadas com siRNA, LoVo e HT29 células. As células foram semeadas numa câmara de invasão e deixou-se invadir a câmara para o meio condicionado específico de células durante 24 h. Microfotografias das células invasoras coradas foram tomadas sob brightfield iluminação (20 ×). (E) A quantificação do ensaio de migração. Os resultados foram obtidos a partir de três experiências separadas, cada uma realizada em triplicado. Invasion foi determinado por contagem de células em seis campos microscópicos aleatórios por poço (média ± SEM; * p 0,05 contra células do grupo controle)

DACT1

regula o ciclo celular, embora crescente. β-catenina níveis

Para elucidar o mecanismo que causou ainda mais os resultados acima, foram testados os níveis de proteína do β-catenina e os genes alvo de Wnt /β-catenina, ciclina D1 [8] e c-myc [22]. A nossa experiência mostrou que a sobre-expressão de

DACT1

resultou num aumento significativo nos níveis totais de β-catenina, ciclina D1 e c-Myc em células SW480 (Figura 5A). Por outro lado,

DACT1

siARN, que mediou o silenciamento de

DACT1

expressão endógena, diminuiu os níveis totais de β-catenina, níveis de ciclina D1 e c-myc em HCT116, LoVo e células HT29 ( Figura 5B).

(A) Western blot representativos de células transfectadas com vector e

DACT1

-transfected SW480 vazias. A sobre-expressão de

DACT1

resulta na regulação positiva de β-catenina e genes alvo do factor de células T (TCF), ciclina D1 e c-Myc. GAPDH foi usada como controlo de carregamento. (B) Western blot representativos de HCT116 e LoVo e células HT29 expressam controle siRNA ou

DACT1

siRNA. Silenciamento de

expressão DACT1

em HCT116 e LoVo e células HT29 diminuição dos níveis de total de β-catenina, ciclina D1 e c-Myc. GAPDH foi usada como controlo de carregamento. (C) O efeito de

DACT1

sobreexpressão no perfil do ciclo celular de células SW480. Três dias após a privação de soro, as células foram analisadas quanto ao perfil do ciclo celular por FACS. A percentagem de células em G1, G2 e S são mostradas fases. (D, E, F) O efeito de

DACT1

siARN transfecção no perfil do ciclo celular das células HCT-116, LoVo e HT29. Três dias após a privação de soro, as células foram analisadas quanto ao perfil do ciclo celular por FACS. A percentagem de células em G1, G2 e S fases são mostrados.

Considerando-se que a ciclina D1 e c-Myc estão relacionadas com a regulação do ciclo celular, examinámos o efeito de

DACT1

superexpressão e silenciamento na regulação do ciclo celular em células do cancro do cólon. Nestas experiências, todas as células foram sincronizadas nas fases G0 /G1 por privação de soro. Ciclo celular perfis por FACS indicou que a sobre-expressão de

DACT1

em células SW480 foi associado com um aumento na proporção de células nas fases G0 /G1 (Figura 5C). Consistentemente, silenciamento de

expressão DACT1

com siRNA resultou num aumento do número de células no S + G2 /M fases no HCT116, linhas de células LoVo e HT29 (Figura 5D-F). Estes resultados sugerem que o S + G2 /M, a acumulação de células após

DACT1

silenciamento está especificamente associada com a perda de proteína

DACT1

. Colectivamente, estes resultados indicam que

DACT1

promove a proliferação de células cancerígenas do cólon, ao facilitar a transição de G1 para a fase S do ciclo celular.

Além ciclina D1, CDK4 é outra tecla fator que facilita a transição G1 /S. Observamos que a sobre-expressão de

DACT1

em células SW480 aumentou a expressão de CDK4, enquanto os níveis de CDK4 foram significativamente reduzidos em HCT116, LoVo e HT29 células que expressavam

DACT1

siRNA (Figura S2). Juntos, estes resultados mostram claramente que

DACT1

estimula a proliferação celular e o crescimento de tumores através da promoção da entrada das células no ciclo celular, através do aumento dos níveis de β-catenina.

DACT 1

aumenta potencial migratório e invasivo de células cancerígenas do cólon através da mudança da localização subcelular de β-catenina

Para revelar os meios pelos quais

DACT1

aumenta a expressão do gene β-catenina /TCF-regulada, a localização precisa de β-catenina foi observado sob um microscópio confocal de varrimento laser (LSCM) por imunofluorescência. Os resultados mostraram que a expressão mais elevada de

DACT1

não só aumentou as fracções nucleares e citoplasmáticos de β-catenina, como também aumentaram a sua fracção associada a membranas. A mudança no nível da fracção β-catenina membrana associada foi a descoberta mais significativa (Figura 6A-D e S1D)

(A) fotomicrografias de vector vazio e

DACT1

. – superexpressando células SW480 imunocoradas com um anticorpo anti-β-catenina (vermelho). (B, C, D) Fotomicrografias de ARNsi de controlo e

DACT1

siARN em HCT116, HT29, células LoVo e imunocoradas com um anticorpo anti-β-catenina (vermelho). (E) borrões representativas dos níveis de β-catenina em membrana (Mem), nuclear (Nuc), e as fracções citoplasmática (Cyto) e total lisados ​​(Lys) em células SW480. Laminin B (expressão nuclear) e GAPDH (expressão citoplasmática) foram usados ​​como controlos de carga. “+” Representa a superexpressão

DACT1

. “-” É vector vazio. (F) blots representativos de níveis β-catenina em membrana (MEM), Nuclear (Nuc), e as fracções citoplasmática (Cyto) e lisados ​​totais (Lys) em células HCT116. Laminin B (expressão nuclear) e GAPDH (expressão citoplasmática) foram usados ​​como controlos de carga. “+” Representa ARNsi de controlo. “-“.

DACT1

siRNA

Para confirmar estes resultados interessantes, extractos de controle /

DACT1

-overexpressing SW480 células e controle /

DACT1

células HCT116 -silenced foram separados em membrana, no citoplasma, e fracções nucleares. Em seguida, a abundância relativa de β-catenina nestas fracções foi analisada por Western blotting (Figura 6E e F). Relatórios anteriores demonstraram um papel importante para β-catenina na adesão celular como parte de um complexo de proteína que inclui a E-caderina [23]. O padrão de expressão de E-caderina nas células do câncer de cólon foi inalterada pela

DACT1

silenciamento ou a sobre-expressão (Figura S3). Estes dados sugerem que níveis aumentados de

DACT1

afectar os níveis de β-catenina e β-catenina /transcrição TCF-dependente pela activação da via de sinalização Wnt. Eles também sugerem a possibilidade de que

DACT1

aumenta o potencial migratório e invasivo de células cancerígenas do cólon através de estabilização β-mediada-catenin da junção adherens.

Correlação entre

DACT1

e expressão β-catenina associada à membrana

in vitro

e

in vivo

a partir dos resultados das experiências acima, descobrimos que

DACT1

foi altamente expresso em cancros do cólon humanos e que promoveu o potencial de crescimento celular, migração e invasão de células cancerígenas do cólon através de seus efeitos sobre a sinalização β-catenina. Com base nestes resultados, a hipótese de que

DACT1

e os níveis de associada à membrana β-catenina expressão seria positivamente correlacionada em linhas celulares de cancro do cólon e cancros do cólon primários. Como mostrado na Figura 7A e B, os níveis de

DACT1

e β-catenina em linhas celulares de cancro do cólon foram correlacionados. Os níveis mais elevados de β-catenina na membrana celular foram observadas em células HCT116 com altos níveis de endógena

DACT1

. Níveis intermediários de β-catenina na membrana celular e

proteínas DACT1

foram encontrados em células HT29. Ambos associada à membrana β-catenina e

DACT1

foram minimamente expressa em células SW480.

(A) análise de RT-PCR semiquantitativa da

expressão DACT1

em HCT116, HT29 e células SW480. GAPDH foi usada como controlo. análise (B) Imunofluorescência de

DACT1

e expressão β-catenina em HCT116, células HT29 e SW480. ampliação original, 40 ×. (C, D) de coloração HE de amostras de mucosa normal do cólon humano (N) e adenocarcinoma tecidos (T) por um anticorpo anti-β-catenina. ampliação original, 40 ×. (E, F) de imunofluorescência (IF) de coloração de amostras de mucosa normal do cólon humano (N) e adenocarcinoma tecidos (T) por um anticorpo anti-β-catenina. ampliação original, 40 ×. (G, H) imuno-histoquímica (IHC) coloração de amostras de mucosa normal do cólon humano (N) e adenocarcinoma tecidos (T) por um anticorpo anti-β-catenina. ampliação original, 40 ×.

Para estudar a relação entre

DACT1

e expressão β-catenina associada à membrana no câncer de cólon ainda, análises de imuno-histoquímica e imunofluorescência foram realizadas de β-catenina em tecidos normais e adenocarcinoma de cólon humano (seis casos acima mencionados). Observou-se coloração focal de membrana associada-β-catenina em todos os seis tumores (100%; a Figura 7C-H). Estes resultados correlacionam-se bem com os resultados anteriores no que diz respeito a p-catenina expressão em linhas celulares de cancro do cólon. Estes resultados confirmam que os níveis elevados de membrana associada-β-catenina pode ser dependente da expressão elevada de

DACT1

.

DACT1

interage com β-catenina e a componentes do complexo de destruição β-catenina para estabilizar β-catenina

Estávamos interessados ​​em esclarecer o mecanismo pelo qual níveis elevados de

DACT1

resultou em aumento da expressão β-catenina. Na ausência de ligandos de Wnt, níveis citoplasmáticos de β-catenina são regulados pelo complexo de destruição que contém axina, APC, e glicogénio-sintase-quinase-3β (GSK-3β), onde β-catenina é fosforilada por GSK-3β em múltiplos serina e treonina em seu terminal N. Fosforilada β-catenina é então ubiquitinadas, conduzindo à sua rápida degradação proteossómica [4], [24], [25], [26], [27], [28]. Para determinar se

DACT1

aumenta os níveis de β-catenina, influenciando estabilidade β-catenina, células HCT-116 (com ou sem

DACT1

silenciamento) foram incubadas com 10 ug /ml de ciclo-heximida (CHX) para evitar síntese de β-catenina nova. Em seguida, os níveis de β-catenina foram medidos por transferência Western de modo a reflectir a taxa de degradação da proteína β-catenina. O silenciamento de

DACT1

expressão aumentou significativamente a taxa de degradação β-catenina, o que resulta em uma redução evidente nas restantes níveis de β-catenina (Figura 8A). Este efeito da

DACT1

na estabilidade β-catenina foi confirmada por um teste de imunofluorescência. Descobrimos que β-catenina foi degradado mais rapidamente nas células HCT116 que expressam

DACT1

siRNA do que em células HCT116 expressar controle

DACT1

siRNA (Figura 8B).

(A Os ensaios Western blot) em células HCT116 foram realizados para determinar a estabilidade β-catenina. (B) Os ensaios de imunofluorescência em células HCT116 foram realizados para determinar a estabilidade β-catenina. (C) Os lisados ​​celulares de células SW480 transfectadas com GFP

DACT1

foram sujeitos a imunoprecipitação (IP) com anticorpos anti-axina, anti-GSK-3, ou anti-β-catenina. Os imunocomplexos foram separados por SDS-PAGE e submetidos a análises de Western blot com um anticorpo anti-GFP. Blotting com um anticorpo anti-GAPDH mostrou o carregamento igual. (D) co-localização subcelular da endógena

DACT1 Comprar e β-catenina,

DACT1 Comprar e GSK-3β em células HT29. (E) Os lisados ​​celulares de células HT29 foram sujeitos a imunoprecipitação (IP) com um anti-

DACT1

anticorpo. Os imunocomplexos foram separados por SDS-PAGE e submetidos a análises de Western blot com anticorpos anti-GSK-3β, ou anticorpos anti-β-catenina. Blotting com um anticorpo anti-GAPDH mostrou o carregamento igual.

Para determinar o mecanismo pelo qual o

DACT1

influências β-catenina estabilidade, examinamos se ou não

DACT1

interage com os componentes do complexo multiproteico que regula a estabilidade β-catenina. Nossa análise de co-imunoprecipitação revelou co-localização de

DACT1 Comprar e GSK-3β,

DACT1 Comprar e axina em células SW480 transfectadas estavelmente com um GFP

DACT1

construção (Figura 8C ). Além disso,

DACT1

fez interagir com β-catenina em células SW480 que overexpressed

DACT1

(Figura 8C). Em seguida, examinaram a co-localização de

DACT1

com GSK-3β, e

DACT1

com β-catenina em células HT29 tipo selvagem (sem APC ou β-catenina mutações) (Figura 8D-E) . Estes resultados indicaram que consistentes

DACT1

interfere com a fosforilação por GSK-dependente de 3β de β-catenina pelo complexo de destruição, e

DACT1

afecta a estabilidade β-catenina, interagindo com β-catenina.

DACT1

afecta o subcelular localizados β-catenina através da inibição da actividade de GSK-3β

β-catenina é conhecido por se acumular no núcleo [29] e os seus níveis são especulado para aumentar a lamelip�ios membrana, membrana adherens junções e pregas da membrana [30], [31], em resposta a sinalização de Wnt ou a inibição mediada por drogas da actividade de GSK-3β. Além disso, com base em nossos resultados, nós especulamos que

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inibe a GSK-3β. Alguns factores que inibem a GSK-3β através da fosforilação da Ser9 foram relatados [32], [33]. Observou-se os níveis de expressão de GSK-3β proteína com Ser9 fosforilado em células HCT116 (com ou sem

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silenciamento). Os resultados mostraram que os níveis de GSK-3β fosforilada em Ser9 foram significativamente aumentados em células HCT116 que expressam ARNsi de controlo (Figura 9A e B). Para confirmar que

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regulamentou o padrão de localização de β-catenina através da inibição GSK-3β, testamos o efeito de inibição de GSK-3β em células HCT116 que expressa tanto o siRNA controle ou o

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siRNA. Observou-se uma melhoria nítida e significativa em células que apresentavam coloração β-catenina associada a membrana depois de terem sido tratados com LiC1 40 mM durante 1 h (Figura 9C e D). Foi testada ainda a expressão de activado β-catenina em células SW480. Os resultados revelaram a maior acumulação de não fosforilado β-catenina em citoplasma e particularmente nos núcleos de células SW480 que sobre-expressa

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(Figura 9E e F). Todos estes resultados suportam a conclusão de que o

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afecta a localização subcelular de β-catenina através da inibição da actividade de GSK-3β.

(A) Fotomicrografias de ARNsi de controlo e

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siRNA expressando células HCT116 imunocoradas com um anticorpo anti-fosfo-GSK-3β (Ser9) (vermelho). Silenciamento de

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em células HCT116 diminui os níveis de fosfo-GSK-3β (Ser9). (B) Western blot representativos de células HCT116 que expressam controle de siRNA e

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siRNA. Silenciamento de

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em células HCT116 diminui os níveis de fosfo-GSK-3β (Ser9). GAPDH foi usada como controlo de carregamento. (C) Células HCT116 que expressam ARNsi de controlo e

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siRNA foram tratadas durante 1 h com fármacos inibidores de GSK-3p (LiCl 40 mM). As células foram coradas e analisadas por microscopia para detectar a expressão de β-catenina. tratamento de células HCT116 de LiCl aumenta os níveis de β-catenina na membrana plasmática. (D) Western blot representativos de células HCT116 tratados com LiCl, que expressam tanto o controle siRNA ou

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siRNA. tratamento de células HCT116 de LiCl aumenta os níveis de β-catenina na membrana plasmática. KDEL foi utilizado como um controlo de carga. 1: células HCT116 que expressam ARNsi de controlo que tinha sido tratada com LiCl 40 mM durante 1 h. 2: células HCT116 que expressam ARNsi de controlo que não tinha sido tratado com LiCl. 3: células HCT116 que expressam

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siRNA que foram tratados por LiCl 40 mM durante 1 h; 4: células HCT116 que expressam

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siRNA que não tinham sido tratados com LiCl. (E) As fotomicrografias de ARNsi de controlo e

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siRNA expressando células HCT116 imunocoradas com um anticorpo anti-fosfo-GSK-3β (Ser9) (vermelho). Silenciamento de

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em células HCT116 diminui os níveis de fosfo-GSK-3β (Ser9). (F) Western blot representativos de células HCT116 que expressam controle de siRNA e

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siRNA. Silenciamento de

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em células HCT116 diminui os níveis de fosfo-GSK-3β (Ser9). GAPDH foi utilizado como um controlo de carga.

Discussão

O aumento da expressão de

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tem funções oncogênicos em câncer de cólon

Nossos estudos têm mostrado que

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é abundante em adenocarcinomas do cólon humano. Este resultado é consistente com a observação anterior que

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foi regulada em tumores de mama invasivos [34].