Abstract

Fundo

ErbB2 é um membro da família do fator de crescimento epidérmico de tirosina-quinases que é centralmente envolvido na patogênese do câncer de próstata e vários estudos têm relatado que a alta expressão de esta proteína tem valor prognóstico. No presente estudo, nós investigamos se imunorreatividade ErbB2 tumor (ErbB2-IR) tem valor prognóstico clinicamente útil, ou seja, que fornece informação prognóstica adicional à prevista por testes de rotina clínica (escore de Gleason, estágio do tumor).

Metodologia /principais conclusões

ErbB2-IR foi medido em um tissue microarray bem caracterizada de tumor e amostras não-malignas obtida no momento do diagnóstico. Além disso, os níveis de mRNA de ErbB2-IR na próstata foram determinados em ratos após a manipulação dos níveis circulantes de andrógenos. Tumor ErbB2-IR foi significativamente associada com a molécula de sinalização a jusante fosforilada-Akt e com o marcador de proliferação celular Ki-67. A associação significativa do tumor ErbB2-IR com a pontuação de Gleason no momento do diagnóstico foi perdida quando controlada para a associação de ambos os parâmetros com Ki-67. Na próstata de ratos, mRNA para ErbB2 foi inversamente associado com os níveis circulantes de andrógenos. Não houve associação entre ErbB2-IR e o receptor de androgénio (AR) -IR nos tumores, mas uma interacção entre os dois parâmetros foi observado em relação à sua associação com a fase do tumor. Tumor ErbB2-IR foi confirmado para ser um marcador de prognóstico para a sobrevivência específica da doença, mas não forneceu informações significativas aditivo ao Gleason score ou para Ki-67.

Conclusões /Significado

conclui-se que o tumor ErbB2-IR é de valor clínico limitado como um marcador de prognóstico para auxiliar as decisões de tratamento, mas poderia ser de importância fisiopatológica no cancro da próstata

Citation:. Hammarsten P, Winther J, Rudolfsson SH, Häggström J, Karalija A, Egevad L, et ai. (2014) ErbB2 Receptor Imunoreatividade em Câncer de próstata: Relacionamento ao receptor de andrógeno, gravidade da doença no momento do diagnóstico e Doença Resultado. PLoS ONE 9 (9): e105063. doi: 10.1371 /journal.pone.0105063

editor: Ramin Massoumi, Universidade de Lund, na Suécia

Recebido: 16 de fevereiro de 2014; Aceito: 19 de julho de 2014; Publicação: 12 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Hammarsten et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Conselho de Pesquisa sueco (Grant não 12158, medicina, CJ Fowler.); Cancer Society Sueco (. Grant não CAN2010 /437, C. J. Fowler); Fundação de leão Cancer Research, Universidade de Umeå (P. Hammarsten e C. J. Fowler); a Fundação do Câncer Research no norte da Suécia (P. Hammarsten) e os fundos de pesquisa da Faculdade de Medicina da Universidade Umeå (C. J. Fowler). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

ErbB2 (HER-2 /neu) é um membro da família do factor de crescimento epidérmico de tirosina quinases envolvidas numa variedade de respostas celulares, incluindo a apoptose, migração, crescimento, diferenciação e adesão [1]. ErbB2 forma heterodímeros com outros membros da família ErbB e inicia uma cascata de vias de sinalização, incluindo a activação do factor de sobrevivência Akt [1], [2]. ErbB2 também é encontrada em células tumorais, e trastuzumab, um anticorpo monoclonal de ErbB2, é utilizado para o tratamento adjuvante do cancro da mama ErbB2-positivo. Outros anticorpos monoclonais ErbB2 também estão em desenvolvimento clínico [3].

A importância de ErbB2 na patogênese do câncer de próstata (PCA) é menos clara. crescimento PCA é regulada por receptores androgênicos (AR), e uma chave de tratamento de Pca dependentes de androgénio é uma redução dos níveis de androgénio, quer por castração cirúrgica ou médica. No entanto, o efeito do tratamento é temporária, e os cancros tornou androgénio-resistente. Em 1999, Craft et al. [4] relatou que a introdução de ErbB2 em células Pca andrógeno-dependentes LNCaP prestados los parcialmente resistente ao crescimento de inibição produzido pela privação de andrógeno. Além disso, num modelo de xenoenxerto utilizando ratinhos castrados, as células que expressam ErbB2 produziu uma formação de tumor mais rápido do que as células não transfectadas LNCaP [4]. A validade preditiva de modelos de xenoenxerto é [5] controversa, mas um aumento da taxa de metástases foi avaliado num modelo ortotópico de Pca após a injecção na próstata ventral de ratinhos nus de células de próstata de rato-1,4 NBE que sobre-expressam o homólogo de rato de ErbB2 [ ,,,0],6]. Por outro lado, o tratamento de ratinhos nus do sexo feminino BALB /c com um crescimento de tumor reduzido ErbB2 a seguir à injecção de células 22Rv1 Pca [7]. A remoção de androgénios a partir do meio de cultura celular aumenta a expressão de ErbB2 [8], e um ligeiro aumento de expressão de ErbB2 sete dias após a castração é visto num modelo de xenoenxerto do crescimento do tumor com células CWR22 [9].

Enquanto o estudos em linhas de células e em modelos animais apontam para um papel chave de ErbB2 na patogénese de APC, os estudos em seres humanos são menos claros. Diferentes estudos têm relatado muito grandes variações nos níveis de expressão de ErbB2 em tecido de tumor da próstata (ver [10] e referências). No entanto, uma meta-análise da literatura entre 1996 e 2009 constatou um aumento do risco relativo de morte devido a recorrência bioquímica (antígeno específico da próstata, PSA) da doença em pacientes com moderada a níveis elevados de expressão ErbB2 tumor [11 Pca ou ]. Estes autores concluíram que “novos ensaios clínicos deve testar a hipótese de que HER-2 /neu é um marcador de um resultado clinicamente pior em pacientes com câncer de próstata e um alvo potencial para a terapia”. Um tal investigação subsequente em uma grande ( 1700) número de pacientes confirmou que as propriedades prognósticos de ErbB2 superexpressão com recorrência PSA como ponto final, embora não forneceu informações prognóstico aditivo ao que é dado pelo escore de Gleason, o estágio do tumor e o nível de PSA pré-operatório [10]. Embora os pacientes não foram tratados durante o período de acompanhamento, as amostras foram obtidas a prostatectomia radical em vez de no momento do diagnóstico. Assim, é importante para determinar se ErbB2 tem melhor valor prognóstico (ou seja, fornece informações aditivo ao que é dado usando marcar o Gleason e outros marcadores prognósticos) em um grupo de pacientes em que as amostras de tecido foram obtidos no diagnóstico e a progressão natural da doença pode ser estudada. Este tem sido investigado no presente estudo.

Materiais e Métodos

Ética declaração

O material humano foi recolhido de acordo com os regulamentos suecos numa altura em que o consentimento informado não foi necessária . O Comitê de Ética em Umeå University Hospital (Regional Ethical Review Board em Umeå) aprovou o estudo (no. 02-283) e dispensou a necessidade de consentimento.

permissão de Ética (no. A110-12) para as experiências com animais foi obtido a partir da comissão de ética animal local (Comitê Umeå Ética de Estudos de animais, Suécia).

as amostras dos pacientes

a coorte utilizado é de uma série consecutiva de 412 homens que foram diagnosticados com câncer de próstata após a ressecção transuretral de symtoms do trato urinário inferior [12]. Os casos foram coletados entre 1975 e 1991 no Hospital Central, Västerås, Suécia, um período de tempo quando o teste de PSA não era rotina. Uma vez que os pacientes foram diagnosticados pós-operação, que não haviam recebido tratamento hormonal ou radioterapia antes da ressecção transuretral. As amostras foram em seguida fixadas em formalina e incluídos em parafina. Usando núcleos (diâmetro 0,6 milímetros) os microarrays de tecido foram feitas usando um instrumento Beecher (Sun Prairie, WI, EUA). Para cada paciente, até oito núcleos (normalmente 5) de tecido tumoral e até quatro amostras de tecido não-malignas de cada paciente foram colocadas [12].

imuno ErbB2 (ErbB2-IR) em Pca microarrays

As secções de tecido de 4 uM de micro matriz embebidas em parafina foram colocados em lâminas, cozidas a 60 ° C, 1 h, em seguida, deparaffinised e reidratadas. Foi realizado bloqueio com 3% de peróxido de H

2O

2 em metanol durante 20 min. A recuperação de antígenos foi realizada com secções colocadas em um tampão de pH 6,0 de citrato e cozinhados num forno de microondas durante 2 minutos. A solução foi deixada arrefecer durante 5 minutos, lavados em água destilada e em seguida tampão de TBS. A proteína-Block (DAKO, Estocolmo, Suécia) foi realizada durante 15 min, após o que as secções foram expostas ao anticorpo monoclonal primário (rato c-erbB-2 Pré-diluído cocktail de anticorpos (PM070AA), Biocare, CA, EUA) durante 2 h em RT. Em seguida, o anticorpo secundário (cavalo anti-ratinho (BA-2000), Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) foi incubada a 30 min à temperatura ambiente seguido de marcação do complexo avidina-biotina durante 30 minutos à temperatura ambiente utilizando o estojo Elite ABC (Vector Laboratories ) e DAB, por último (Dako) realce durante 40 s em temperatura ambiente.

tumor (n = 1.822) e não-maligno (n = 1170) núcleos foram marcados para ErbB2 na próstata células epiteliais e células tumorais de varredura digital imagens por um avaliador (JW) que não o fez no momento da avaliação têm acesso aos dados clínicos. As amostras de tumor foram avaliadas com base na intensidade imunorreactivo (variando de 0 = nenhuma coloração para 4 = coloração máxima) e de distribuição (0, 25, 50, 75, 100%). Note-se que a pontuação de distribuição não inclui estroma, uma vez que este não expressa ErbB2-IR. Assim, uma amostra com apenas uma pequena proporção das células epiteliais, mas com uma grande quantidade de estroma ainda pode marcar uma distribuição de 100% e uma intensidade de 4. Em seguida, para cada núcleo foi determinado um valor compósito (entre 1-4). Por exemplo, um núcleo com 25% de onde a amostra tinha intensidade contáveis ​​2 e 75% tinha intensidade 3 receberia uma pontuação composta de (0,25 + 0,75 × 2 × 3) = 2,75. Os valores medianos foram então determinada para cada caso. Para determinar a consistência, 301 núcleos de tumor foram marcados e, em seguida, recodificados. coeficiente de correlação interclasse para a consistência (modelo misto) deu alfa de Cronbach de 0,90, 254 de 301 partituras estavam dentro de 0,5 unidades de pontuação de cada um. Os núcleos não-malignas foram adicionalmente marcado para as células basais e luminais separadamente, quando possível. Alguns núcleos (N = 482) teve basal claramente identificáveis ​​e células luminais e estes foram devolvidos como basal e luminal no banco de dados. Uma camada basal difusa (n = 436) foi observada em alguns outros núcleos e nos núcleos restantes (n = 252 células basais) não puderam ser identificados. Estes núcleos não foram usados ​​aqui, por isso deve ser lembrado como uma advertência de que as pontuações para basal e luminal não-malignas ErbB2-IR representam um conjunto de dados limitado. Índice de Ki67, pAkt-IV, o receptor de androgénio (AR) -IR e as características clínicas de cada paciente foram disponível na base de dados e foram relatados no todo ou em parte anteriormente [12] – [15].

animais e tratamentos

Quarenta e dois ratos adultos machos Sprague-Dawley (284-430 g) foram anestesiados com pentobarbitalnatrium (50 mg /kg) e castrados através do escroto. Seis animais intactos serviram como controlos. Após 7 dias, e vinte e um dos animais recebeu uma injecção subcutânea de longa actuação testosterona (5 mg /kg, Sustanon, Organon, Oss, Holanda) administrado como uma dose única a cada segundo dia como anteriormente descrito [16]. O tecido da próstata foram removidas em diferentes tempos após a castração (1, 3, 7 dias) e em tempos diferentes após o tratamento com testosterona (1 dia, 2 dias, 3 dias) + castração e congelados em azoto líquido. Havia sete grupos, incluindo o grupo de controlo e cada grupo era composto por seis animais.

O delineamento experimental deste estudo procedeu de acordo com as orientações para cuidados e tratamento dos animais de laboratório e foi aprovado pelo comitê de ética animal local ( Comissão Umeå Ética de Estudos de Animais, Suécia). Os animais foram alojados sob uma temperatura controlada em um quarto artificialmente iluminado (12 horas de luz /12 h escuro). Alimentos e água da torneira estavam disponíveis gratuitamente.

preparação de RNA e transcrição reversa quantitativa PCR

O RNA total a partir de tecidos foi isolado de acordo com o método TRIzol (Invitrogen, Estocolmo, Suécia). As concentrações de RNA foram quantificadas espectrofotometricamente a 260 nm (640 DU Spectrophotometer, Beckman Coulter, Bromma, Suécia) e a integridade de ARN foi verificada por 28 S e 18 S integridade do rRNA após electroforese em gel de agarose (dados não mostrados).

Cinco cem ng de ARN total foi transcrito revertida utilizando hexâmeros aleatórios (Applied Biosystems, Sundbyberg, Suécia) e Superscript II de transcriptase reversa (Invitrogen, Estocolmo, Suécia) numa reacção de 10 uL de acordo com as instruções do fabricante. Todas as reacções de ADNc foram corridos em duplicado.

A quantificação de ARNm de ErbB2 foi realizada por PCR em tempo real quantitativo usando a ABI PRISM 7900HT Instrumento (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). As reacções foram realizadas num volume de 20 ul usando genes TaqMan ensaios de expressão Rn00566561_m1 (Applied Biosystems, Life Technologies Europe BV, Estocolmo, Suécia) com a expressão do gene TaqMan mastermix acordo com o protocolo do fabricante. Cada amostra foi analisada para Rpl13a (Rn00821946_gl, Applied Biosystems) e β-actina (Rn00667869_ml, Applied Biosystems) de expressão para usar como controlos de referência de normalização. Para confirmar a especificidade de amplificação os produtos de PCR foram sujeitos a uma análise de curvas de fusão. Os dados de quantificação foram analisados ​​com SDS 2.4 Software (Applied Biosystems) e os valores relativos de ARNm de ErbB2 nas amostras são calculados a partir de uma curva padrão obtida por amplificação de cinco vezes de diluição em série de ARN total transcrito revertida a partir de uma amostra de referência. Um problema neste tipo de estudo é a arrumação adequada a utilização, uma vez que os seus níveis pode variar em estudos de investigação do cancro [17], [18]. Optamos por apresentar os dados normalizados a dois genes: ß-actina e rpl13a, a fim de dar uma avaliação da solidez dos dados

Estatísticas

O coeficiente de correlação intraclasse, binário. análises de regressão de riscos proporcionais de logística e de Cox foram realizadas utilizando o software SPSS (IBM). regressão ordinal analisa software utilizado desenvolvido no âmbito do projecto de I para computação estatística (versão 2.15.2) [19]. Todos os outros cálculos estatísticos utilizado o pacote estatístico incorporado no programa de computador GraphPad Prism 6 para o Macintosh (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, EUA). Para os casos seguidos pela esperança, characteristic (ROC) curvas Receiver Operating com limite de follow-up de 15 anos foram utilizados para definir os pontos de corte para ErbB2-IR. Por estas curvas e para as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier, um evento foi definida como morte atribuível ao câncer de próstata e registrado no banco de dados como “evento = 1”. Pacientes com morte por outras causas e casos em que os pacientes estavam vivos no momento da follow-up foram censurados e inseridos no banco de dados como event = 0.

Resultados

ErbB2-IR em Pca Tissue microarrays: comparação das contagens do tumor e não-malignas

Um total de 357 222 casos (não-malignas basal e luminal) (de tumor) e foram marcados para ErbB2-IR. Exemplos de diferentes intensidades de ErbB2-IR a partir de quatro núcleos de tumor são mostradas na Fig. 1A-D. Um exemplo de um tecido não-malignas que mostra uma clara diferença entre basal e luminal ErbB2-IV está mostrada na fig. 1E. Para tanto o tumor e amostras não-malignos, as células epiteliais mostrou ErbB2-IV ao passo que estroma não o fez. As pontuações cumulativas para o tumor epitelial basal e a não-malignas e células luminais são mostrados na Fig. 2A. Para amostras emparelhadas, os resultados foram significativamente diferentes entre si (P 0,0001 para testes de pares, Wilcoxon-correspondida pares assinado rank). Ao nível dos núcleos individuais, o número de casos com contagens basais ≥-1, -0,99 a -0,01, 0, 0,01 a 0,99, 1,99 e 1 para ≥2 unidades mais elevado do que as pontuações luminais combinados foram de 1, 1, 5, 86, 286 e 103, respectivamente

As notas atribuídas foram:. Score 1 para o Painel a; Pontuação 2 para Painel B; Pontuação 2,25 (75% de intensidade marcou 2, a intensidade de 25% de classificação: 3) para o Painel C; Pontuação quatro pontuações para Painel D. A Gleason dos casos, a partir da qual os núcleos foram derivados foram 5 para Painéis A e C, e 10 para os painéis B e D. O painel E mostra exemplo de ErbB2 imunorreactividade em um núcleo não-maligno, onde basal e coloração luminal poderia facilmente ser identificado.

no Painel Uma das frequências cumulativas de pontuação ErbB2-IR são mostrados para as amostras de tumor (n = 357), e para a basal e as amostras não-malignas luminais (n = 222 em ambos os casos). Os valores da mediana (intervalo interquartil entre parênteses) foram: tumor, 3,0 (2,25-3,5); nonmalignant luminal, 2,25 (2,0-2,625); basal não-malignas 3,875 (3,5-4,0). Os valores médios foram significativamente diferentes umas das outras (p 0,001, teste de comparação múltipla de Dunn significativa seguinte teste de Kruskal-Wallis). O painel B mostra um gráfico de dispersão das pontuações individuais para tumor ErbB2-IR e pAkt-IR (tomadas a partir de [14]).

Associação de ErbB2-IR com a gravidade da doença no momento do diagnóstico

a associação de ErbB2-IR com (idade, classificação de Gleason,% do núcleo que estava associado a tumor) clínicas e bioquímicas (índice de Ki67, estroma AR-IR e IR-pAkt) medidas na mesma região são mostrados na Tabela 1. em primeiro lugar -order valores Rho de Spearman na Tabela 1 foram calculados como descrito em [20]. Nas amostras de tumores, as associações significativas com o escore de Gleason,% do núcleo que foi associado a tumor, índice de Ki67 e pAkt-IR foram encontrados. Um gráfico de dispersão que mostra a associação entre a pontuação ErbB2-IR e IR-pAkt tumor é mostrada na Fig. 2B. Consistente com valor rho a significativa de Spearman, a distribuição dos casos com escores de Gleason 4-5, 6, 7 e 8-10, respectivamente, foi diferente para aqueles com uma pontuação tumor ErbB2-IR ≤2.75 (40 [26%], 46 [30%], 26 [17%] e 41 [27%]) do que aqueles com uma pontuação 2,75 (21 [10%], 57 [28%], 40 [20%] e 86 [42%]) (P 0,0005, teste qui-quadrado; valores dados são o número [% para o grupo ErbB2-IR] com o intervalo de pontuação de Gleason no momento do diagnóstico os valores correspondentes para os graus tumorais 1a-1b, 2, 3 e 4, respectivamente,. foram: tumor pontuação ErbB2-IR ≤2.75, 92 [61%], 30 [20%], 25 [17%] e 3 [2%]); tumor pontuação ErbB2-IR 2,75, 83 [41%], 61 [30%], 49 [24%] e 8 [4%] (P 0,005, χ

2 de teste).

Em teoria, uma associação significativa de dois parâmetros pode ser devido ao facto de que os dois parâmetros estão associados com um terceiro parâmetro. Assim, por exemplo, se os casos com uma elevada taxa de proliferação de células, como pode ser visto com o marcador de índice de Ki67, mais frequentemente têm pontuações altas Gleason e pontuações ErbB2-IR mais elevados do que os casos com baixas taxas de proliferação de células, em seguida, uma correlação entre ErbB2- IR pontuações e o Gleason seria induzida. Consistente com esta situação, as correlações de primeira ordem entre ErbB2-IR e quer a classificação de Gleason ou% de núcleo que estava associado a tumor para controlar o índice de tumor Ki67 não foram significativos. No entanto, a associação entre o tumor ErbB2-IR e IR-pAkt permaneceu significativa (Tabela 1). Assim, no tecido do tumor, as pontuações ErbB2-IR estão associados com a molécula de sinalização a jusante de pAkt e com o marcador de proliferação celular Ki67, mas não de forma robusta com as medidas clínicas de gravidade da doença. Nenhuma correlação significativa entre ErbB2-IR e quer a pontuação de Gleason, a% de núcleo que foi associado a tumor ou o índice Ki67 não-maligna foi visto para qualquer ErbB2-IR basal ou luminal. associações significativas entre ErbB2-IR basal e ambos não-malignas pAkt-IR e estroma AR foram vistos.

Relação entre tumor ErbB2 e andrógeno sinalização

Ricciardelli et al. [21] relataram que altos níveis de tumor ErbB2-IR e AR-IR foram mais comuns em pacientes APC com a fase 3 tumores (n = 31) do que na fase 2 tumores (n = 22, as amostras obtidas a prostatectomia radical). Aqui nós investigamos a relação entre estas duas variáveis ​​no nosso tissue microarray. Consistente com o estudo de [21], não houve correlação entre as duas variáveis ​​

per se

no tecido do tumor (Tabela 1). No entanto, no nosso material, casos com níveis de tanto do tumor ErbB2-IR e AR-IR acima da mediana foram menos comuns em doentes com estádio 3 tumores (n = 58) do que para a fase 2 tumores (n = 82) (Tabela 2) . Como seria de esperar a partir da correlação análises apresentadas na Tabela 1, uma questão de confusão é que o índice Ki-67 varia entre os grupos (Tabela 2).

A fim de explicar isso, realizamos regressão ordinal análises com tumor ErbB2-IR, AR-IR e Ki67-índice como as variáveis ​​independentes eo estágio do tumor como a variável ordinal dependente. Como uma advertência, deve ser salientado o Ki67-índice correlaciona tanto com ErbB2-IV (Tabela 1) e Ar-IV (Rho de Spearman -0,17, n = 340, P 0,005) e de modo que os três variáveis ​​não são verdadeiramente independente . No entanto, as correlações, embora significativo, são relativamente baixos, de modo que o risco de multicolinearidade é pequena. Além disso, a palavra “ordinal” em análise de regressão ordinal refere-se a variável dependente, e os valores das variáveis ​​independentes foram definidos como contínua, em vez de ordinal, que é, de facto, o caso para os pontos (Assim, por exemplo, a uso de rho de Spearman, em vez de r de Pearson na Tabela 1). No entanto, isso é inteiramente razoável, em modelos de regressão ordinais quando a variável em questão tem um grande número de categorias (existem 22 pontuações diferentes de tumor ErbB2 variando de 1 a 4 na base de dados). No modelo de efeitos principais, os valores devolvidos a partir da análise de regressão ordinal para uma variável representar o seu efeito total quando as outras variáveis ​​estão incluídos. Neste caso, tanto o índice de Ki67 (positivo) e a AR-IV (negativo) foram significativas, ao passo que não foi ErbB2 (Tabela 3). No modelo de termo de interacção, o valor para a variável individual é para um valor constante das outras variáveis. Neste caso, os resultados para as três variáveis ​​foram os mesmos em termos de importância, no entanto, uma significativa interacção ErbB2-IV X-AR IV (positivo) foi devolvido. Em outras palavras, quando as variáveis ​​são mantidas constantes, há uma influência da combinação de ErbB2-IR x AR-IR, de modo que quanto maior a pontuação, quanto maior o número fase do tumor. Os valores da relação logit e odds para os quatro níveis de resposta (nível 1 sendo o nível de referência) em diferentes pontuações ErbB2-IR e AR-IR são apresentados na Tabela S1 para ilustrar este ponto para os leitores bem familiarizados com este método estatístico.

Os dados de Ricciardelli et al. [21] e do presente estudo são consistentes com, mas não a prova de uma interacção entre a sinalização de andrógeno e expressão ErbB2. Essa prova requer a utilização de modelos experimentais. remoção de androgénio afecta a expressão de ErbB2 em linhas de células de tumor [8] e em modelos de xenotransplante de [9]. Não se sabe, contudo, se esta regulação é restrita a células de tumor ou também é visto no tecido da próstata intacto seguindo variações em larga escala em níveis de testosterona circulante. A fim de determinar se os efeitos reguladores semelhantes foram observados na próstata normal, a expressão de ErbB2 no nível de mRNA nesse tecido foi medida por qPCR castração seguinte em ratos e, posteriormente, a reintegração dos níveis circulantes de testosterona de androgénio por injecção. Os resultados observados (Fig. 3) são consistentes com os estudos de tumor acima citados

Os dados são normalizados para A. ß-actina.; B, Rpl13a. Abreviaturas: d pc, número de dias pós-castração; T, a testosterona. Mostram-se os valores individuais (n = 6 por grupo); as barras a cheio indicam medianas. Em ambos os casos, os testes de Kruskal-Wallis indicou uma variação significativa entre os grupos (P 0,0001).

Valor prognóstico do tumor ErbB2-IR

Um total de 255 casos marcou para tumor ErbB2-IR foram seguidos pela esperança após o diagnóstico, sendo este o tratamento padrão no momento. Nestes casos, a progressão natural da doença pode ser seguido, e a influência de um biomarcador em cima do resultado pode ser investigada. Em geral, um valor de corte do biomarcador é escolhido, eo resultado é comparado entre os casos abaixo e acima do cut-off é determinada em análises de sobrevivência, tais como análise de riscos proporcionais de Cox e gráficos de Kaplan-Meier. Os valores-limite pode ser arbitrária, tal como uma divisão média simples dos dados, ou definida sobre a base de uma análise estatística. Uma dessas abordagens é o uso do Receiver Operating Characteristic (ROC) analisa, que parcela para todos os possíveis de corte valoriza a verdadeira taxa positiva (sensibilidade) vs. a taxa de falsos positivos (1-especificidade). Para uma curva ROC com uma área sob a curva [AUC] significativamente superior a 0,5 (sem valor prognóstico), o ideal de corte de valor (o índice de Youden, representando o cut-off que dá o maior valor de sensibilidade + especificidade – 1 ) pode ser calculado (veja [22] para uma descrição). A curva ROC com um limite de 15 anos indicaram um valor prognóstico significativo de tumor ErbB2-IV (Área sob a curva [AUC] 0,60, P 0,05), e foi na divisão ≤2.75 e 2.75. Por comparação, a área de ROC sob a curva para o tumor Índice de Ki67 foi de 0,75 (P 0,0001) e assim um valor de 0,60, embora significativo, não é impressionante. O basal não-malignas e dezenas ErbB2-IR luminais faltava valor prognóstico (AUC≤0.55, P≥0.4).

Em teoria, é possível que, embora a AUC para o tumor ErbB2-IR é modesto, poderia contribuir para uma combinação de marcadores com valor prognóstico útil. Para investigar esta possibilidade, duas abordagens têm sido feitas, utilizando o tumor ErbB2-IV, juntamente com três outros marcadores tumorais (índice de Ki67, epitelial AR-IR e de pAkt). Os dados foram normalizados de modo que a pontuação máxima em cada caso é de 100%, e no caso da RA, as contagens foram expressas como pontuação de 100 normalizada, uma vez que um baixo, em vez de um nível elevado, AR-IV está associada com um mau prognóstico [15]. Diferentes combinações foram testados, mas nenhum deu uma melhoria ao observado com Ki67 sozinha (Tabela S2). As curvas ROC deu peso igual aos diferentes biomarcadores, e por isso, em teoria, uma ponderação ótima poderiam ter sido perdidas. Em consequência, uma análise de regressão logística binária com o resultado clínico como variável dependente foi investigada utilizando os mesmos parâmetros. A melhor combinação de parâmetros em termos de prever correctamente morte devido a Pca foi ~~23% ea inclusão de ErbB2 não melhorou este valor (Tabela S3). Em comparação, a pontuação de Gleason teve uma taxa de previsão de 55,6% (Nagelkerke R

2 valor de 0,419) por conta própria e 45,6% (Nagelkerke R

2 valor de 0,401) em combinação com AR-IR + Ki67-IR ( dados não mostrados).

uma análise proporcional de Cox univariada perigos de regressão com a sobrevivência específica da doença como ponto final indicou que o risco relativo de casos com uma pontuação tumor ErbB2-IR acima do ideal de corte, tal como definido pelo índice de Youden, foi aproximadamente o dobro que para os que estão abaixo do valor de corte (o valor Exp (B) mostra a Tabela 4). A análise univariada não ter em conta as potenciais variáveis ​​de confusão. A partir dos resultados anteriores apresentados neste trabalho, Ki67 é um fator de confusão óbvia, e as análises de bivariada de Cox de regressão indicou que o tumor ErbB2-IR não forneceu informação prognóstica adicional à prevista por qualquer tumor índice de Ki67 (Tabela 3). Em termos de utilidade clínica, um marcador seria de interesse se prestar informações sobre e acima que a prevista pela escala de Gleason. No entanto, um bivariada de Cox análises de regressão controle de pontuação de Gleason (três grupos: 4-6, 7 e 8-10) indicou que o valor prognóstico do tumor ErbB2-IR não permaneceu significativa (Tabela 4). Consistente com isto, gráficos de Kaplan-Meier para todos os casos seguido pela esperança mostrou um efeito prognóstico significativo do tumor ErbB2-IV (Figura 4A), e para os casos com pontuações de Gleason 4-6 (Fig. 4B). No entanto, um efeito prognóstico significativo não foi visto para os casos com Gleason pontuação de 6 sozinho (Fig 4C), escores de Gleason 7 sozinho (Fig 4D, embora na fronteira com significado) ou para casos com Gleason pontuação 8-10 (Fig. 4E).

o número de casos em que a morte foi devido ao câncer de próstata são indicados como

† Pca na figura. As escotilhas nas linhas mostram dados censurados (ou seja, outros do que a morte casos, devido a cancro da próstata). A gama de pontuações Gleason (GS) para os pacientes encontram-se em cada painel.

Discussão

No presente estudo, investigamos a associação de ErbB2-IR com a gravidade da doença no diagnóstico e com a evolução da doença em um tecido bem caracterizada microarray [12]. Há um grande corpo de trabalho relativo ao valor prognóstico da ErbB2 em Pca (revisão, ver [11]), mas o presente estudo fornece novas informações em dois aspectos importantes: primeiro, os dados são obtidos em casos que não tinham recebido qualquer tipo de câncer tratamento antes de as amostras foram tomadas, uma vez que eles foram diagnosticados somente após a ressecção transuretral para os sintomas do trato urinário inferior. Além disso, uma vez que o tratamento padrão na época era a expectativa, o acompanhamento mais longo usado permite o exame do curso natural da doença. Isso é extremamente valioso para a avaliação de biomarcadores. Em segundo lugar, a disponibilidade de dados sobre AR nas mesmas amostras permitiu uma análise das inter-relações entre ErbB2 e expressão AR nos tumores. Em geral, os nossos resultados estão em boa concordância com a literatura. No que diz respeito a diferenças na expressão de ErbB2 tecido, Lyne et ai. [23] relataram que a percentagem de espécimes com moderada a forte imunorreactividade para ErbB2 foi de 100 células basais benignas da próstata, 11 para células luminais benignas da próstata, para 0 estroma da próstata benigna, 87 para neoplasia intraepitelial prostática e 82 para cancro da próstata. No presente estudo, não observamos ErbB2-IR no estroma, bem como o número (com% entre parênteses) dos casos com pontuações ErbB2-IR ≥3 foram 196/222 (88%), 39/222 (18%) e 201/357 (56%) para amostras não-malignas basais, luminais e de tumor, respectivamente.

Nas amostras tumorais, ErbB2-IR foi significativamente associada tanto com o marcador de proliferação celular Ki67 e a imunorreactividade do pAkt , a forma fosforilada do factor de sobrevivência de Akt. A associação com o Ki67 é consistente com um grande estudo utilizando amostras obtidas em prostectomy radical, onde o índice médio de rotulagem Ki67 foi maior para as amostras de tumores 388 ErbB2-positivo do que para as 1940 amostras ErbB2-negativos (6,1 vs 4,3, respectivamente, [10]). [21].