Abstract

Introdução

testes de mutação não-invasiva usando DNA tumorais circulantes (ctDNA) é uma premissa atraente. Isso pode permitir que pacientes sem amostra de tumor disponível para acessar mais opções de tratamento

Materiais Métodos

O sangue periférico e tumores pareados foram analisados ​​45 pacientes com NSCLC. Nós investigamos o impacto das variáveis ​​pré-analíticas sobre o rendimento de DNA e /ou

KRAS

detecção de mutações:. Amostra tipo de coleção tubo, tempo de incubação, os passos de centrifugação, de volume e de extração de DNA kits de entrada plasma

resultados

tempo

2 horas de incubação e centrifugação de plasma duplo (2000 xg) reduziu o rendimento DNA global resultando em níveis reduzidos de ADN genómico contaminante (gDNA). Reduzido “contaminação” e aumento da

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detecção da mutação foi observada usando DNA do sangue Coleção Tubes livre de células (cfDNA BCT) (Streck), após 72 horas seguintes sangue tração em comparação com tubos de EDTA. volume de entrada de plasma e uso de diferentes kits de extração de DNA impactado rendimento de DNA.

Conclusão

Este estudo demonstrou que o sucesso de recuperação ctDNA para detecção de mutação em NSCLC é dependente de etapas de pré-analíticas. Desenvolvimento de métodos padronizados para a detecção de

KRAS

mutações de espécimes ctDNA é recomendado para minimizar o impacto das etapas de pré-analíticos sobre as taxas de detecção de mutações. Onde o processamento da amostra rápida não é possível o uso de tubos cfDNA BCT seria vantajoso

Citação:. Sherwood JL, Corcoran C, Brown H, Sharpe AD, Musilova M, Kohlmann A (2016) optimizados métodos pré-analíticos melhorar

KRAS

detecção de mutações no DNA circulante tumoral (ctDNA) de pacientes com não-pequenas células Lung Cancer (NSCLC). PLoS ONE 11 (2): e0150197. doi: 10.1371 /journal.pone.0150197

editor: Javier S. Castresana, da Universidade de Navarra, Espanha

Recebido: 24 de dezembro de 2015; Aceito: 10 de fevereiro de 2016; Publicação: 26 de fevereiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Sherwood et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela AstraZeneca. O financiador forneceu apoio sob a forma de salários para todos os autores, mas não teve nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados ou análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores: JLS, CC, HB, AS, MM e AK são funcionários da e manter acções de AstraZeneca, cuja empresa financiou este estudo. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A necessidade de detecção de mutações precisas de Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) tecido tumoral tem estabelecer-se, juntamente com a necessidade de identificar potenciais respondedores aos medicamentos personalizados, tais como inibidores de tirosina-cinase (TKI); por exemplo.

EGFR TKI

, erlotinib, gefitinib e T790M dirigido TKI osimertinib) [1]. No entanto, o tecido do tumor avaliável nem sempre está disponível para pacientes com NSCLC [2]. Por exemplo, no estudo recente Medida Iressa seguimento (IFUM), estado de mutação do tumor foi incapaz de ser determinada em 19% dos pacientes elegíveis [3]. No Reino Unido, apenas 71% dos doentes com cancro do pulmão têm uma confirmação histológica da doença [4].

Devido à falta de disponibilidade de amostras de tecidos adequados, DNA tumorais circulantes (ctDNA) está se tornando cada vez mais importante como um fonte alternativa para a detecção de mutações accionáveis ​​[5]. Haverá uma maior demanda por testes de biomarcador em amostras particularmente no câncer de pulmão onde as drogas mais específicas estão em desenvolvimento [6], como os inibidores MEK1 /2; selumetinib [7], cobimetinib (GDC-0973, XL-518) e trametinib e a T790M dirigido TKI de EGFR, osimertinib (AZD9291) [8] e rociletinib (CO-1686) [9]. teste de mutação do plasma também oferece uma opção minimamente invasiva para caracterizar metastático e /ou mecanismos da doença resistentes ao tecido ou re-biópsia ou indisponíveis.

A utilidade clínica da detecção de TKI sensibilizar

EGFR

mutações em ctDNA foi comprovado no tratamento de doentes com gefitinib [3] em NSCLC e com erlotinib em cancro colorrectal (CRC) [10]. Triagem para

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mutações no CRC e câncer pancreático utilizando ctDNA também tem sido explorada juntamente com

BRAF

em amostras de melanoma [11-14]. ctDNA é tipicamente degradada até um comprimento de 166 pares de bases, muito provavelmente devido aos processos nucleolíticas que ocorrem durante a apoptose [15,16]. Há alguma evidência para sugerir a ctDNA enquanto em circulação tem uma meia-vida entre 16 minutos [17] e cerca de 2 horas [18,19], mas com grandes variações entre os casos. Isto é provavelmente devido à actividade da nuclease suportados sangue que degrada os fragmentos de [20], em intervalos de 10 pares de bases [18] e o fígado também limpa fragmentos da circulação [21]. A detecção de mutações em ctDNA é difícil, devido à baixa quantidade de alelos mutantes num fundo de ADN de tipo selvagem. Ela está presente em níveis muito baixos ( 1%) [22] e podem variar de paciente para paciente devido a processos biológicos complexos tais como a amplificação do gene visto com

EGFR

[23]. métodos sensíveis são fundamentais para dar resultados confiáveis. variáveis ​​pré-analíticas, tais como coleta de sangue periférico, tratamento, transporte e métodos de armazenamento podem afetar as taxas de detecção.

tecido tumoral Actualmente continua a ser o tipo de amostra padrão ouro recomendado devido à relativamente baixa taxa de detecção em ctDNA quando comparado com tumor tecidual [3,24]. Detecção de ctDNA varia de 62% a sensibilidade 65,7% para

EGFR

mutações em NSCLC [3,25] e de sensibilidade de 25% a 41% para

KRAS

mutações no CRC [26,27 ].

Um dos maiores desafios para a detecção de mutações acionáveis ​​em ctDNA é a instabilidade de células brancas do sangue após a coleta. Os glóbulos brancos quebrar sorteio pós sangue, levando a um aumento no ADNg (ADN genómico) [28,29]. A maior abundância do normal espectador gDNA dilui o tumor derivado ctDNA tornando-o mais difícil de detectar mutações acionáveis ​​[30] e exige que ser usado técnicas mais sensíveis do que os utilizados para a detecção de mutações em amostras de tecido. Estudos anteriores investigaram a utilização de métodos de melhoria, mas números na amostra limitada [30-32]. As recomendações atuais para avaliar ctDNA incluem: plasma em vez de amostras de soro, o uso de EDTA ou tubos de coleta de DNA livre de células com o processamento dentro de 4 horas, centrifugação de casal e não mais de três ciclos de descongelamento congelamento de amostras de plasma [31]

O objetivo deste estudo foi investigar vários métodos para melhorar a detecção de mutação em ctDNA a partir de 10 mL coleta de sangue do paciente padrão. Nós investigado especificamente o uso de diferentes tubos de coleta de sangue. Usando plasma de 45 pacientes com NSCLC com correspondência blocos de tumor também avaliou o impacto sobre a produção de DNA e /ou

KRAS

detecção sob as seguintes condições: 1) tempo de incubação a temperatura ambiente antes do isolamento de plasma; 2) simples ou de dupla centrifugação; 3) volume de entrada de plasma e 4) kits de extração de vários DNA.

Declaração de Ética Materiais e Métodos

Ética aprovação da comissão não foi necessário no caso deste trabalho específico as amostras foram coletadas comercialmente a partir do Centro de Pesquisa do Câncer Manchester (MCRC) Biobank, Reino Unido ou Asterand Bioscience Royston, Reino Unido, que tem genérico aprovação ética: https://www.asterandbio.com/company/ethics/. pleno consentimento informado por escrito foi obtida para todas as amostras utilizadas neste estudo

O MCRC Biobank é licenciado pelo (número de licença: 30004) Human Tissue Authority. e foi eticamente aprovado como um banco de tecidos pesquisa do Manchester Sul Comitê de Ética em Pesquisa (Ref: 07 /H1003 /161 + 5). Um conjunto de Fichas de Informação do Paciente padrão eo consentimento formulários de pacientes foram desenvolvidos e aprovados e consentimento informado do paciente será sempre obtida antes amostras do paciente são tomadas. O Biobank detém o que é conhecido como a aprovação ética genéricos

Isto confere a aprovação para qualquer pessoa usando amostras do MCRC Biobank, assim que os investigadores não precisa obter a sua própria aprovação ética para os projectos relevantes usando amostras Biobank:. Http: //www.mcrc.manchester.ac.uk/Biobank/Ethics-and-Licensing.

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com a Declaração de Helsinki (1964, alterado em 1975, 1983, 1989, 1996 e 2000 ) da Associação médica Mundial e todas as amostras de doentes submetidos para análise foram feito com o pleno consentimento informado dos pacientes.

Todos os dados clínicos e amostras foram recebidas de forma anônima.

os pacientes

Dois conjuntos de amostras de NSCLC consistindo de (FFPE) tecido embebido em parafina e fixado em formalina e o plasma combinado foram utilizados neste estudo (Figura 1). Para a avaliação dos diferentes métodos de estabilização de plasma, uma coleção de plasma combinado e tecido FFPE ponderados para pacientes caucasianos com adenocarcinoma e com história de tabagismo foi utilizado (n = 20; MCRC Biobank colaborando NHS Trusts). plasma combinado e tecido FFPE foram utilizados para comparar os diferentes volumes de plasma (n = 15; Asterand Bioscience, Royston, Reino Unido) e comparando kits de extração de DNA diferente plasma (n = 10; Asterand Bioscience)

Diagrama mostrando o. fluxo de trabalho experimental para os diferentes grupos de amostra. Painel A. Comparação de Streck Free Cell (BCT) e tubos de EDTA, além de centrifugação simples e dupla no rendimento de DNA e detecção de mutações. B. Comparação de diferentes volumes de plasma e kits de extração ctDNA sobre o rendimento de DNA e detecção de mutações

A coleta de sangue, isolamento e armazenamento de plasma

Para a avaliação dos diferentes métodos de estabilização de plasma, 10. sangue periférico mL foi coletada em um tubo de EDTA de recolha de sangue (Vacutainer K2EDTA) (Becton, Dickinson, Oxford, Reino Unido) e 10 mL de uma DNA ™ BCT-Free Cell (cfDNA BCT) (Streck, Omaha, NE) para 20 pacientes, de acordo com as instruções de utilização (invertendo 10 vezes). Cada volume de 10 ml foram então divididos em 2 x 5 mL de alíquotas e, em seguida, incubadas à temperatura ambiente durante 2 h ou seja 72 horas. O plasma foi então isolado a partir da amostra de sangue através da realização de uma centrifugação 2000 x g durante 10 min e removendo cuidadosamente o plasma. O plasma foi depois removido de novo centrifugado a 2000 x g durante 10 minutos antes da remoção do sobrenadante do plasma por extracção ctDNA. Para 5 dos 20 pacientes de um sorteio adicional de sangue de 10 mL foi coletada em um tubo de EDTA e dividido em 2 x 5 volumes mL. O sangue foi então incubada à temperatura ambiente durante 2 h, quer 72 h antes ou a uma rotação centrífuga solitário a 2000 x g para isolar o plasma (Fig 1A). Para armazenamento a longo prazo, todo o plasma foi armazenado a -80 ° C em aliquotas de 1 mL, antes da extracção do ADN.

Para a comparação dos diferentes volumes de plasma e kits diferentes de extracção de ADN, o sangue foi recolhido em tubos de EDTA e centrifugadas uma vez durante 10 min a 1300 x g. O plasma foi recolhido em alíquotas de 1 ml e armazenadas a -80 ° C dentro de 1 hora da recolha de sangue. As aliquotas do mesmo paciente foram descongeladas em gelo e reunidas por paciente para gerar 6 mL no total. plasma reunido foi, em seguida, mistura-se cuidadosamente e dispensados ​​em 1, 2 e 3 volumes ml, para o estudo de comparação do volume de plasma (n = 15), e 3 x 2 mL alíquotas para o estudo de extracção de ADN de comparação Kit (n = 10) (Figura 1B) . Todas as amostras de plasma foram congeladas a -80 ° C.

Todas as colecções de tecido foram realizados simultaneamente, embora os dados recolhidos pelas Asterand Bioscience foram conduzidas sob as limitações de disponibilidade de tais conjuntos de amostras emparelhadas, por conseguinte, alguns parâmetros de recolha não foram ideal para cfDNA por exemplo, recolha com um passo de centrifugação como acima.

extracção de ADN a partir de plasma

Para comparação da estabilização do sangue e o volume plasmático foi utilizado o Kit de circulação de Ácido Nucleico QIAamp (Qiagen, Hilden, Alemanha). Além disso, uma comparação de três kits de extracção de ADN foi realizada em volumes iguais de plasma (2 ml cada) (Fig 1B). Foram utilizados os seguintes kits: PME sem que circula DNA Extraction Kit protocolo (Analytik Jena, Jena, Alemanha) por 2-5 extrações ml, utilizando solução de lise sistema GS /Encadernação solução VL e DSP Virus /Kit Pathogen Midi realizada em QIAsymphony (Qiagen) e a circulação Nucleic Kit ácido QIAamp (Qiagen). QIAsymphony extracções foram realizadas no laboratório aplicações Qiagen (Hilden). Todas as amostras de plasma foram processados ​​de acordo com os protocolos dos fabricantes, com a excepção de o kit de PME em que uma primeira incubação de 20 min em vez de 10 minutos foi realizada e os passos de centrifugação de plasma foram realizados a 3750 x g vs 4500 x g. Todos os ADN foi eluído em 80 uL dentro do intervalo especificado pelo kit.

extracção de ADN a partir de tecido FFPE

O DNA foi extraído a partir de 2 x 5 m secções de tecido FFPE recentemente cortada de acordo com o fabricante do Protocolo utilizando o estojo QIAamp DNA FFPE tecidual (Qiagen) e eluiu-se em 100 uL de tampão.

ADN quantificação

Todos os ADN eluído foi bem misturada (vortex) antes da medição por PCR quantitativa (qPCR ), que foi realizada utilizando o kit de ABI TaqMan® RNase P Detecção Reagentes e TaqMan® Universal PCR master Mix (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) num instrumento Quantstudio Dx (Life Technologies, CA. EUA). As reacções foram preparados utilizando-se 10 ul de Mistura de PCR, 1 ul de mistura de ensaio, 5 uL de ADN e 4 mL de água livre de nuclease (Qiagen, Hilden, Alemanha). As condições de amplificação foram de 95 ° C durante 10 minutos, em seguida 94 ° C durante 15 segundos e 60 ° C durante 1 minuto repetido 40x. Uma série de 10 diluições em série de ADN genómico humano (Roche Diagnostics, Mannheim, Alemanha) a partir de 100 ng /mL para 0,195 ng /mL foi utilizado em duplicado, para produzir a curva padrão. O tamanho amplicon do ensaio RNase P foi de 87 pares de bases, o que é apropriado para uso em ctDNA.

o teste KRAS

KRAS

estado de mutação foi caracterizado a partir de ADN derivado de tecido FFPE usando o

KRAS TheraScreen

RGQ kit de PCR (Qiagen) de acordo com o protocolo do fabricante. O kit TheraScreen emprega amplificação refratária de mutação (ARMS) tecnologia de PCR combinada com a tecnologia de detecção de escorpiões [33]. O estado de mutação de uma determinada amostra é estabelecida por comparação da específica

KRAS

ensaio de mutação de encontro a um ensaio de controlo no

KRAS

exão 4 para gerar uma mudança no Threshold Cycle (ΔCT). O ΔCT é o obtido subtraindo o CT controle do CT ensaio de mutação. O ΔCT é então comparado com os critérios cortadas validado para a ΔCT, a fim de estabelecer estado de mutação.

KRAS

detecção da mutação foi realizada da mesma maneira em amostras de pacientes com ctDNA

KRAS

detectadas mutações no ADN derivado de tecido FFPE correspondente. Amostras processadas por diferentes métodos de pré-analíticos foram analisadas na mesma corrida RotorGeneQ (RGQ). As amostras de plasma só foram avaliados para a conhecida

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mutação como obtido no tecido correspondido.

A análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando-pareado de

t

-test no Microsoft Excel que p 0,05 foi considerado significativo. A análise de regressão linear e cálculo de R

2 foram realizados em GraphPad Prism (versão 6.01) e p-valores foram calculados com base no desvio do zero. Gráficos foram gerados GraphPad Prism.

Resultados

Quantificação de DNA seguinte processamento de plasma diferente Passos para

Para entender se os métodos de processamento de plasma podem influenciar os níveis de contaminação gDNA presente , que recolhido sangue a partir de 20 doentes com NSCLC e processada do plasma sob várias condições (Figura 1A e Figura 2). tubos de colheita EDTA e tempo de incubação foi significativamente (p 0,01) associado ao aumento do rendimento DNA, significa ± SD: tubo de EDTA /2 horas de incubação (2,49 ± 1,60 ng /mL) versus tubo de EDTA /72 hr de incubação (15,12 ± 16,44 ng /mL) (Figura 2A). Um baixo, mas significativo (P 0,01) aumento de rendimento de ADN foi também observado com o ADN isento de células tubos de recolha de sangue (cfDNA BCT) a 72 h (3,31 ± 1,82 ng /mL), em comparação com cfDNA BCT /2 hr (2,39 ± 1,42 ng /mL) (Figura 2B). Não houve diferença significativa no rendimento total de ADN observada quando o plasma foi processado dentro de 2 horas utilizando um ou outro tipo de tubo (Fig 2C). O rendimento de ADN a partir de plasma processada após 72 h utilizando tubos cfDNA TBC foi significativamente (p 0,01) mais baixo do que o plasma processado usando tubos de EDTA (Figura 2D) “

O sangue total foi colhido a partir de 20 doentes com NSCLC e processados ​​usando. vários tipos de tubos, tempos de incubação e passos de centrifugação um subconjunto destes pacientes (n = 5) tinham sangue total processado para avaliar um único passo de centrifugação dupla versus ADN foi medida utilizando o ABI TaqMan® RNase P Detection Kit de Reagentes a:.. sangue foram obtidos utilizando tubo de recolha de sangue com EDTA (EDTA) e processado após 2 horas ou 72 horas B:. O sangue foi coletado usando o tubo livre DNA coleta de sangue de células (cfDNA BCT) e processado após 2 horas ou 72 horas C:. O sangue foi coletado usando tubos e EDTA ou cfDNA BCT processado após 2 horas D:. O sangue foi colhido utilizando tubos de EDTA ou cfDNA BCT e processadas após 72 hr e:. O sangue coletado em tubos de EDTA, após 2 horas de incubação e processados ​​usando centrifugação simples ou dupla F.: O sangue coletado em tubos de EDTA após incubação de 72 horas e processada usando centrifugação simples ou dupla. Os resultados são exibidos para cada paciente. A análise estatística foi realizada utilizando um teste t de Student pareado, onde; ** P . 0,01

Um subconjunto destas amostras de doentes (n = 5) foi ainda avaliada a influência de um único ou um degrau duplo centrifugação sobre os rendimentos de ADN (Figura 2E e 2F). Quando processado dentro de 2 horas, centrifugar as amostras de plasma duas vezes não têm um efeito significativo sobre o rendimento de DNA em comparação com única rodada (Fig 2E). No entanto, quando processadas após 72 horas, uma etapa dupla centrifugação resultou numa diminuição média da produção de DNA (19,35 ± 24,3 ng /mL) em relação ao processamento de única centrifugação (35,47 ± 32,1 ng /mL). Uma diminuição do rendimento foi observada em 4 das 5 amostras analisadas (Figura 2F) mas não foi estatisticamente significativa (p = 0,058). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que os níveis de rendimento de ADN pode variar, dependendo do método pelo qual o plasma é processado com métodos não-óptimas.

KRAS

detecção de mutação na sequência diferentes etapas de processamento de plasma

Aplicação dos vários métodos de processamento de plasma também foi investigado por

KRAS

a detecção de mutações em 20 amostras de pacientes (Fig 1A). Antes de executar

KRAS

detecção de mutações em qualquer DNA derivado do plasma, o tecido FFPE combinado correspondente foi exibido usando o

KRAS TheraScreen

kit RGQ PCR para identificar pacientes com tumores positivos mutação (n = 10 /20; dados não mostrados). Nesta coorte, 50% (n = 5) tinham

KRAS

mutações identificadas no plasma combinado processado em tubos de recolha cfDNA BCT dentro de 2 horas e 40% (n = 4) em 72 horas. No entanto, esta taxa de detecção reduzida quando comparada com um método não-óptima considerado, por exemplo, tubos de colheita de EDTA após 2 h, 40% (n = 4) de mutações foram detectadas caindo para 20% (n = 2), após 72 horas (Tabela 1) nas mesmas amostras. Os valores individuais (CT), o total de DNA KRAS (KRAS controle) amplificável e valores ΔCT para todas as amostras de plasma 10 são exibidos em S1 Table. Deve notar-se que

KRAS

estado de mutação foi estabelecida utilizando o Qiagen TheraScreen

KRAS

Handbook RGQ PCR, ΔCT cortado valores variam 6,6-8 para as mutações detectadas. Devido ao baixo número de amostras com

KRAS

mutações que eram detectáveis ​​em ctDNA, não é possível atribuir um significado estatístico.

amplificável Total

DNA KRAS

(

KRAS

controle) de detecção em todas as amostras demonstraram uma tendência semelhante à observada para a produção de DNA (qPCR) na figura 2 (S1 Tabela). Uma diminuição no valor de C T foi demonstrada por métodos não-óptimas, indicando uma maior concentração de ADN contaminante; média CT ± SD: EDTA de incubação tubo /2h (29,0 ± 1,0), tubo de EDTA /incubação 72hr (25,5 ± 1,5), cfDNA BCT /2 h de incubação (29,4 ± 1,1) e cfDNA BCT /72 hr de incubação (28,5 ± 1,0) , respectivamente (Tabela S1). Estes resultados demonstram que ambos

KRAS

a detecção de mutações e também amplificável total de

KRAS

ADN pode ser influenciada de acordo com o método de processamento de plasma utilizada.

A quantificação de ADN seguinte plasma diferente entrada

Como esperado, um aumento significativo do rendimento de ADN foi observada com o aumento do volume da amostra (P 0,01) dos 15 pacientes (Fig 3). Um aumento no rendimento irá aumentar a concentração e os números de cópias absolutos de ctDNA disponíveis para análise fazendo, assim, a detecção de mutações mais prováveis. O rendimento de DNA média de 3 ml de plasma foi de 4,39 ± 4,55 ng /mL em comparação com 3,03 ± 3,24 ng /mL (2 ml de plasma) e 1,79 ± 1,81 ng /mL (1 mL de plasma). A partir desses 15 pacientes, 7 tinham

KRAS

mutações no tecido combinado correspondente Nesta coorte, um paciente (número 23) tinha uma detectáveis ​​

KRAS

mutação no plasma para todos os três volumes das amostras restantes paciente tendo valores ΔCT fora dos critérios de corte para o teste (Tabela S2). Isto pode ser devido a este conjunto particular de amostras de plasma correspondentes sendo arrastado para tubos de EDTA comuns, apenas com uma única rotação reflectindo a taxa de detecção habitual que se coloca em métodos não-óptimas [34]. Além disso essas amostras foram específicos deriva principalmente de fase I ou II de NSCLC (13/20) que podem conter níveis mais baixos de ctDNA do tumor [35]. Curiosamente,

KRAS

controlo de amplificação demonstrou uma tendência semelhante à do rendimento de DNA (qPCR) na figura 2. Abaixe os valores médios de CT para o

KRAS

controle foram observadas com o aumento do volume plasmático. Os valores mais baixos CT demonstraram um aumento significativo (p 0,001) em

KRAS

detecção de controlo (média CT ± DP) de 3 mL de plasma (26,5 ± 1,7) em comparação com 2 ml de plasma (27,1 ± 1,8) e 1 mL de plasma (28,1 ± 1,7) amostras (S2 tabela). Estes dados demonstram que o volume variada de plasma de entrada pode ter impacto sobre o rendimento de DNA e amplificável total de

KRAS

. Para

KRAS

detecção da mutação, no entanto, um grupo maior de amostras mutantes detectável é necessária para posterior análise.

Três volumes de plasma (1 ml, 2 ml e 3 ml) foram processados ​​a partir de cada amostra em uma coorte de 15 pacientes com NSCLC. O DNA foi extraído usando o Kit QIAamp CNA e foi medida por qPCR utilizando o kit TaqMan ® ABI RNase P Reagente de Detecção. Os resultados são exibidos para cada paciente. A análise estatística foi realizada utilizando um teste t de Student pareado, onde; ** P . 0,01

Enquanto nenhuma conclusão pode ser feita a partir de uma única amostra, todas as amostras aumentou com um rendimento de ADN conforme esperado. O aumento do número de

KRAS

cópias de DNA amplific�eis obtidos através da extração de mais de plasma, poderia influenciar a taxa de detecção nestas amostras, se os métodos mais sensíveis, por exemplo, digital de PCR foram empregues.

extracção de ADN de comparação kit

Volumes iguais (2 ml) de plasma de 10 pacientes foram submetidos a extracção de ADN, utilizando três métodos distintos. Todos os três métodos demonstrou extração bem sucedida de DNA (Fig 4) com QIAamp da Qiagen circulação Nucleic kit ácido produzindo o rendimento de DNA maior, ou seja, significa ± SD (3,03 ± 2.19ng /mL) em comparação com PME de Analytic Jena livre circulante protocolo Kit DNA Extraction ( 0,83 ± 0.88ng /uL; p 0,001) e comparada com os vírus de DSP da Qiagen /kit Midi Pathogen realizada em QIAsymphony (0,53 ± 0.53ng /mL; p 0,01). Os kits manuais são simples de usar e adequada para pequenos para o tamanho dos lotes médios enquanto que o QIAsymphony exige treinamento específico, mas é mais adequado para alto rendimento e processamento contínuo.

Volumes iguais de plasma (2 ml) de pacientes com NSCLC 10 foram processadas utilizando-se três métodos de extração de DNA diferentes: QIAamp circulantes Kit ácido nucleico (Qiagen Kit CNA); PME-livre que circula DNA Extraction Kit (Analytik Jena) eo Vírus /Kit Pathogen Midi DSP realizada em QIAsymphony (QIAsymphony). De ADN foi medida por qPCR utilizando o kit TaqMan ® ABI RNase P Reagente de Detecção. Os resultados são exibidos para cada paciente. A análise estatística foi realizada utilizando um teste t de Student pareado, onde; ** P 0,01, *** p 0,001

Discussão

terapia personalizada no câncer assenta o teste para mutações no DNA usando um ensaio de diagnóstico companheiro para identificar pacientes que vai. mais provável responder a terapias específicas. Actualmente, o espécime mais utilizados para detecção de mudanças mutação do DNA acionáveis ​​é tecido do tumor, geralmente de tecido FFPE. No entanto, uma amostra de tecido não está sempre disponível, [3], quer devido ao esgotamento do bloco de diagnóstico para outras investigações patologia molecular ou porque o paciente nunca foi feita a biópsia para outras razões clínicas. Onde a disponibilidade de tecido é uma escolha cuidadosa edição de plataformas de diagnóstico altamente paralelos, tais como Next Generation Sequencing (NGS) ou Matrix Assisted Laser dessorção /ionização Time of Flight (MALDI-TOF), pode atrasar o esgotamento do bloco [36].

biópsias de líquidos (plasma) oferecer uma opção alternativa, temporal e menos invasiva para o teste de mutação preciso. Estudos anteriores demonstraram que o teste de mutação de ctDNA tem especificidade elevada ( 95%), mas a sensibilidade é inferior (60%) em comparação com o tecido [3,37]. A maioria das evidências documentadas em NSCLC a data refere-se a

EGFR

testes. Alguns estudos têm investigado

KRAS

mutações de ctDNA em pacientes com câncer colorretal [12,26,34].

Tecnologias e métodos que podem melhorar o isolamento de ctDNA e reduzir a contaminação do DNA de tipo selvagem são emergentes [31]: evitando tubos de heparina [38], o uso de plasma em vez de soro [39] e prevenção de amostras de congelamento [28]. Estes incluem mudanças graduais em processamento de plasma para as etapas exemplo centrifugação (velocidade e número de rotações) [40] e melhorias mais sofisticadas, como a tubos de coleta especializados, tubos ou seja, células DNA livre de coleta de sangue que estabilizam as células brancas no sangue [30, 32]. Embora a potencial utilidade clínica de

KRAS

detecção de mutações a partir de plasma também foi explorada [41] em NSCLC, o efeito destas modificações de processamento no

KRAS

a detecção de mutações em NSCLC não tenha ainda sido especificamente investigada.

O objetivo deste estudo foi identificar as etapas de processamento de pré-analíticas ideais para obter ctDNA a partir do plasma de pacientes com câncer de pulmão. Neste estudo, medimos o impacto dessas medidas sobre os rendimentos de DNA e

KRAS

taxas de detecção de mutação.

PCR quantitativo (qPCR) foi pensado para ser o método de DNA quantificação mais adequado, uma vez que caracteriza amplificável moléculas de DNA apenas [28]. O método utilizado empregue um par amplicão de base 87 que iria amplificar ctDNA que é tipicamente degradada a 166 pares de bases (40). Deve-se notar no entanto, que a utilização de outros métodos é adequado, quando utilizado como parte de um método previamente validado.

DNA circulante existe naturalmente, mas é frequentemente elevados em doentes com cancro [19]. A quantidade de ctDNA em uma amostra varia de acordo com definição e fase da doença [35]. A detecção de mutações de ctDNA depende fortemente da estabilidade da amostra. Houve uma emergência de tubos de coleta de sangue alternativas que estabilizam as células do sangue, por exemplo, CellSave conservante Tubes (Cell Search, Sul Ritan, NJ, EUA) e cfDNA BCT (Streck). Neste estudo centrou-se na avaliação dos tubos cfDNA BCT porque estas eram o único produto disponível no mercado projetado especificamente para estabilizar sangue para avaliação ctDNA. A solução estabilizadora contido em tubos cfDNA BCT não afeta a análise molecular a jusante por PCR [42] como também observado neste estudo. Estudos anteriores demonstraram que os tubos cfDNA BCT preservar sangue possibilitando a detecção de DNA circulante livre utilizando plasma de dadores saudáveis ​​[30,32] ou plasma enriquecida com células de câncer [43]. No entanto, com o melhor de nosso conhecimento não há estudos que usaram estes tubos para avaliar o rendimento de DNA e mutações específicas no plasma de pacientes com NSCLC.

Nós aqui demonstrado que, ao usar métodos de processamento diferentes, como um hr 72 incubação antes do processamento, tubos cfDNA BCT eram melhores em estabilizar o sangue em comparação com tubos de colheita EDTA como pode ser visto por uma redução nos rendimentos de DNA. Como tal, quando o processamento imediato ( 2 h) de plasma não é possível, tubos cfDNA BCT proporcionar uma alternativa superior aos tubos de colheita de EDTA padrão. Isto é particularmente importante num ambiente clínico onde o sangue é recolhido, mas não é capaz de ser processado imediatamente

Tem sido relatado que uma centrifugação inicial lento ( 1600 xg durante 10 min). Seguido por uma segunda centrifugação, a velocidade elevada ( 16.000 xg durante 10 minutos) é necessário para o isolamento de plasma isento de células [40,44], tal como visto por uma diminuição no rendimento de ADN. Importante, laboratórios clínicos nem sempre têm a capacidade de executar uma segunda centrifugação mais rápido. Nosso estudo confirmou que a contaminação gDNA foi menor do plasma isolado com uma centrifugação dobro em relação a uma única centrifugação apoiar observações anteriores. Nestas condições recomenda-se que uma segunda centrifugação a uma velocidade inferior é mais eficiente na remoção de células do que uma única centrifugação [45]. Além disso, o aumento do volume do plasma, aumentaram a produção de ADN e reduzido o

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controlo como esperado [45].

Há um número de opções de extracção de ADN que pode ser utilizado para a análise de ctDNA plasma ou no soro (Tabela S3). Nós escolhemos comparar três métodos, todos projetados especificamente para extração de DNA, o que permitiu o uso de 2 mL de plasma de entrada em circulação. Nós escolheu um método automatizado (QIAsymphony), um método comumente usado (kit QIAamp CNA) e um método menos documentado (Analytik Jena). Enquanto observamos que os métodos rendeu DNA suficiente para aplicação a jusante no entanto os rendimentos diferiu significativamente entre os ensaios. Os rendimentos diferentes como medido por qPCR pode ter resultado de isolamento de fragmentos de diferentes tamanhos de distribuição, devido à exclusão de tamanho de ácidos nucleicos de uma dada kit. Devido à variação de desempenho dos kits comerciais, um método validado deve ser utilizado quando se analisam amostras clínicas. Portanto, a consideração cuidadosa deve ser dada ao escolher um método de extracção ctDNA ideal.

Em conclusão, embora individualmente alguns passos de otimização teve um efeito modesto no presente estudo, a acumulação de várias modificações acabará por levar a melhores taxas de detecção de mutação em ctDNA. Em particular, foi demonstrado a inclusão dos tubos cfDNA BCT para melhorar a estabilização do sangue periférico em relação a tubos com EDTA após incubação de 72 h.