Abstract
triterpenóides sintéticos são moduladores de inflamação antioxidantes (AIMS) que exibem actividade anti-cancerígena amplo. AIMs vincular a KEAP1 e inibir sua capacidade de promover a degradação NRF2. Como resultado, NRF2 aumenta a transcrição de genes que restaurar o equilíbrio redox e reduzir a inflamação. AIMs inibir o crescimento de tumores e metástases através do aumento da actividade NRF2 no microambiente tumoral e através da modulação da actividade de vias de sinalização oncogénicos, incluindo NF-kB, em células tumorais. Evidências sugerem que a perda ou mutação KEAP1-o que resulta em níveis elevados de actividade sustentada NRF2-pode promover o crescimento do cancro e aumentar quimioresistência. Perda de KEAP1 também aumenta os níveis de outras proteínas oncogénicas, incluindo IKKβ e BCL2. A vantagem de sobrevivência aparente fornecida para algumas células tumorais por perda de KEAP1 funcional levanta a questão de se a inibição farmacológica de KEAP1 poderia promover o crescimento do tumor. Para abordar esta questão, que caracterizou os níveis basais de KEAP1 e NRF2 em um painel de linhas celulares tumorais humanas e perfilados a atividade de uma AIM, RTA 405. Descobrimos que em linhas de células de tumor com baixa ou mutante KEAP1, e
Keap1
– /-
fibroblastos embrionárias de murino, múltiplos alvos KEAP1 incluindo NRF2, IKKβ e BCL2 foram elevados.
Keap1
– /- fibroblastos embrionários murinos também tiveram maiores taxas de proliferação e formação de colónias do que suas contrapartes do tipo selvagem. Em células com KEAP1 funcional, RTA 405 aumentou os níveis de NRF2, mas não os níveis IKKβ ou BCL2, e não aumentar a proliferação celular ou sobrevivência. Além disso, RTA 405 inibiu o crescimento em concentrações semelhantes em células com diferentes níveis de actividade NRF2 basal e em células com o tipo selvagem ou mutante
KRAS
. Finalmente, o pré-tratamento com 405 RTA não protegeu as células tumorais a partir da inibição de crescimento ou doxorrubicina mediada pela cisplatina. Colectivamente, estes dados demonstram que a ativação farmacológica do NRF2 pela AIMS é distinta da ativação genética e não fornece um crescimento ou vantagem de sobrevivência às células tumorais
Citation:. Probst BL, McCauley L, Trevino I, Wigley WC, Ferguson dA (2015) Crescimento célula cancerosa é diferentemente afectados pela Constitutivo Ativação de NRF2 por KEAP1 Supressão e Farmacológica a ativação de NRF2 pela triterpenóides sintético, RTA 405. PLoS ONE 10 (8): e0135257. doi: 10.1371 /journal.pone.0135257
editor: Irina V. Lebedeva, Universidade de Columbia, Estados Unidos
Recebido: 17 de dezembro de 2014; Aceito: 20 de julho de 2015; Publicação: 24 de agosto de 2015
Direitos de autor: © 2015 Probst et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
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Introdução
triterpenóides oleanano sintéticos, tais como metil bardoxolone e RTA 408, são moduladores de inflamação antioxidantes ( AIMS) que exibem actividade anti-tumoral em modelos de ampla prevenção e tratamento do cancro [1, 2], e são bem tolerada em pacientes com malignidades avançadas [3]. O alvo principal dos objetivos é Kelch-como proteína associada a ECH 1 (KEAP1), uma proteína adaptador de substrato para o complexo E3 ubiquitina ligase CUL3-RBX1. Sob condições normais, KEAP1 facilita a ubiquitinação das suas proteínas de substrato, o que leva a sua degradação pelo proteassoma [4]. Um destes substratos é o factor nuclear factor de transcrição (2-eritróide derivado) -like 2 (NFE2L2), também conhecido como NRF2. AIMS potencialmente aumentar a actividade NRF2 por ligação a um resíduo cisteína do sensor (C151) em KEAP1, causando uma alteração conformacional que torna KEAP1 incapaz de promover a degradação NRF2 [5-8]. NRF2 acumula e entra no núcleo onde se aumenta a expressão do elemento de resposta anti-oxidante (ARE) molecular contendo os genes-alvo. Os produtos destes genes incluem proteínas antioxidantes e citoprotectoras, que restaurar o equilíbrio redox celular e reduzem a inflamação. Deste modo, os objectivos têm demonstrado ampla actividade anti-inflamatória e citoprotectora em diversos modelos animais, bem como em clínica [9, 10].
O aumento da actividade antioxidante e anti-inflamatória que ocorre após o tratamento com fins reduz a incidência do tumor e carga em modelos chemically- e geneticamente induzidas da carcinogênese [11-14]. Da mesma forma, tem como objectivo reduzir o stress oxidativo e inflamação no microambiente de tumores estabelecidos e inibir o crescimento tumoral, metástases, angiogénese e imunossupressão mediada por tumor [15-20]. Visa também inibir diretamente a proliferação e induzir a apoptose em células tumorais [1; 2; 21; 22]. Embora o mecanismo subjacente ao efeito anticancerígeno directa dos objectivos em células tumorais não é completamente compreendido, sabe-se que os objectivos modular a actividade de várias proteínas relacionadas com o cancro, incluindo ciclina D1 [12; 23], CDKN1A (p21) [23], JAK1 e STAT3 [24; 25]., HER2 [26], e fator nuclear kappa B (NF-kB) [27-29]
Apesar de NRF2 desempenha um papel anticancerígeno no microambiente tumoral, tem sido proposto para ter o efeito contrário em células malignas [30; 31]. análises genéticas recentes de tumores humanos demonstraram que as mutações no
KEAP1
ou
NRF2
resultado -que em altos níveis de NRF2 sustentada actividade estão associados com o aumento da proliferação, chemoresistance, e baixa sobrevida [30 ; 31]. Outros mecanismos de ativação NRF2 também foram identificados, incluindo a redução do
expressão KEAP1
devido à hipermetilação do promotor ou expressão miRNA [32-34] e aumento da expressão de
NRF2
devido à oncogenes activados, tais como KRAS [35]. Tem sido sugerido que a atividade NRF2 elevada proporciona uma vantagem de sobrevivência às células tumorais, aumentando os níveis de antioxidantes para gerenciar excesso de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de nitrogênio (RNS), que são características comuns de câncer [35]. Estas observações levantam a questão de se os agentes farmacológicos que ativam NRF2 através da inibição KEAP1 poderia promover o crescimento do cancro ou aumentar a resistência terapêutica [31; 36; 37]. Esta questão é especialmente importante dado o potencial de ativadores NRF2 para prevenir e tratar uma variedade de doenças inflamatórias e auto-imunes crônicas [38-40].
Em consonância com a actividade global anticancerígeno dos objectivos, não há nenhuma evidência de que estes compostos aumentam a incidência de cancro em modelos de animais [36; 37]; em vez disso, há fortes evidências em contrário [1; 31]. Por conseguinte, a indução genética de NRF2 por perda de função KEAP1 parece ter um efeito diferente de activação AIM-mediada através da inibição da NRF2 KEAP1 no crescimento do tumor. No entanto, ambos os efeitos dependentes da NRF2 sobre o microambiente do tumor e os efeitos independentes do NRF2 sobre as células do tumor provavelmente contribuem para a actividade anti-cancro dos objectivos in vivo. Para nosso conhecimento, o efeito de indução NRF2 AIM-mediado sobre a proliferação, a sobrevivência e a quimiossensibilidade de células tumorais isoladas não foi previamente avaliada.
Para avaliar o efeito de indução NRF2 AIM-mediada sobre o crescimento de células tumorais e sobrevivência, que caracterizado pela primeira vez o nível basal de actividade NRF2 num painel de linhas de células tumorais para identificar aqueles que tinham uma de tipo selvagem eixo KEAP1-NRF2 (isto é, níveis baixos NRF2 basais), e aqueles que tinham uma KEAP1-NRF2 disfuncional eixo (ie., níveis de NRF2 basais elevados). Com esta informação, foi avaliada a atividade anticancerígena de uma AIM, RTA 405 (CDDO-Etil Amida) [8; 11; 41-47] em linhas de células tumorais, onde poderia ser induzido a atividade NRF2 (ou seja, aqueles com um tipo selvagem KEAP1 eixo -NRF2) em comparação com linhas de células tumorais em que a actividade NRF2 já estava no seu nível máximo (isto é, actividade NRF2 elevada devido à perda da função KEAP1). Para comparar diretamente os efeitos da perda de função KEAP1 para os efeitos da inibição KEAP1 farmacológica, nós tratamos do tipo selvagem (WT) e
Keap1
– /- fibroblastos embrionárias de murino com RTA 405 e proliferação avaliado e sobrevivência, bem como os níveis de IKKβ e BCL2 e dois outros substratos KEAP1 que têm actividades de promoção do cancro. Também foram avaliados os efeitos de activação NRF2 RTA-405 sobre a proliferação mediada induzida por KRAS e a sensibilidade de linhas de células de tumor para outros agentes quimioterapêuticos. Tomados em conjunto, os resultados deste estudo demonstram que a indução NRF2 por objectivos de não aumentar a proliferação celular ou sobrevivência e que os efeitos a jusante da inibição KEAP1 farmacológica por objectivos são distintos daqueles que resultam da perda de KEAP1 funcional em células tumorais.
Materiais e Métodos
Materiais
RTA 405 (2-ciano-3,12-dioxooleana-1,9 (11) -dieno-28-óico etil amida) e RTA 402 (metil 2-ciano-3,12-dioxoolean-1,9-dien-28-oato de etilo) foram sintetizados por Reata Pharmaceuticals, Inc. (Irving, TX EUA). A menos que indicado, todas as outras substâncias químicas foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Do tipo selvagem e
Keap1
– /- fibroblastos embrionárias de murino (MEFs) foram obtidas do Dr. Masayuki Yamamoto (Universidade de Tohoku, Japão) [48; 49]. LSL-Kras
MEFs G12D foram obtidas de Dr. Tyler Jacks (Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA) [50]. Todas as outras linhas celulares utilizadas neste estudo foram a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA EUA). ATCC usa breve análise em tandem repeat (STR) para analisar todas as linhas de células humanas de autenticidade e pureza antes da distribuição. Todas as linhas celulares foram passadas por menos de seis meses após a reanimação.
cultura celular
MEFs, MCF-7, PANC-1, A549 e células HeLa foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Medium ( DMEM), células SK-N-SH de Eagle em meio Essencial mínimo (EMEM), e L-361 células em meio 5A de McCoy. meio 5A de McCoy DMEM e foram obtidos a partir de Life Technologies, Grand Island, NY EUA. EMEM foi obtido a partir de ATCC, Manassas, VA EUA. Todas as outras linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Life Technologies). O meio de cultura foi suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina /estreptomicina. FBS usado em cultura de LSL- Kras
G12D MEFs foi inactivado pelo calor. As linhas de células foram cultivadas na presença de 5% de CO
2 a 37 ° C.
crescimento celular e ensaios clonogénicos
Para as experiências de contagem de células, MEFs (5 x 10
4 células /poço) foram plaqueadas em placas de 6 poços, tratadas com 405 RTA no dia seguinte, e contadas em vários intervalos de tempo, usando um analisador de células XR Vi-CELL (Beckman Coulter, Indianapolis, IN EUA). Para os ensaios clonogénicos, de tipo selvagem (1 x 10
3 células /poço) e
Keap1
– /- (0,5 x 10
3 células /poço) foram semeadas em MEFs 6 -bem pratos e, 6 horas depois, tratados com RTA 405. Após sete dias, as colónias foram fixadas (1: 7 de ácido acético: metanol) e coradas com 0,5% de violeta de cristal em metanol. As colónias de células foram contadas ≥50.
Para determinar IC
50 e GI
50 valores, as células foram plaqueadas em placas de 96 poços e tratadas com RTA 405 em concentrações que variam de 50 a 1000 nm . O crescimento celular foi avaliado utilizando o ensaio de sulforrodamina B (SRB) [51]. Resumidamente, 50 uL de gelo frio de 50% (w /v) de ácido tricloroacético foi adicionado a cada poço e as placas foram incubadas a 4 ° C durante 1 hora. As células fixadas foram então lavados cinco vezes com água da torneira e secas ao ar durante a noite. No dia seguinte, as células foram coradas com 0,4% (w /v) de SRB em ácido acético a 1% à temperatura ambiente durante 20 minutos. As células coradas foram depois lavadas cinco vezes com ácido acético a 1% e secas ao ar. SRB corante foi solubilizado pela adição de 200 uL de 10 mM de Tris base e a absorvância foi medida a 490 nm. Para IC
50 determinação, a viabilidade celular foi avaliada após 48 horas de crescimento. Para GI
50 determinação, as células em uma placa foram fixados no início da experiência (tempo 0) e as células em uma placa em duplicado foram tratadas com 405 RTA durante 72 horas. [(T
it
z) /(CT
z)] x 100, em que (T: O percentual de crescimento da RTA células em relação às células tratadas com o veículo foi calculada usando a seguinte equação 405-tratada
z) é o valor da absorvância no tempo zero, (C) é o valor de absorvância de poços tratados com veículo após 72 horas, e (T
i) é o valor da absorvância de poços tratados com a droga. Para as experiências de combinação com a doxorrubicina ou cisplatina, as células foram pré-tratadas com 405 RTA durante 2, 6, ou 24 horas e em seguida tratou-se com doxorrubicina ou cisplatina durante mais 72 horas. IC
50 e GI
50 valores foram determinados a partir de curvas de dose-resposta utilizando o GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA EUA).
em tempo real transcrição reversa PCR
o ARN total foi isolado a partir de células com o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD EUA) e reversamente transcrito utilizando Superscript II (Life Technologies). As reacções de PCR foram realizadas utilizando os iniciadores validados para a especificidade e a eficiência de amplificação. A transcrição reversa e PCR informao do ciclo pode ser encontrado em S1 protocolos e sequências iniciadoras de PCR estão apresentados na Tabela S1.
proteína ribossômica S9
(
RPS9
) e
ribossômica L19 proteína
(
Rpl19
) foram utilizados como genes de referência para amostras humanas e de rato, respectivamente. A abundância relativa de cada gene alvo foi determinada utilizando o método comparativo Ct (ΔΔCt) [52].
KEAP1
e
NRF2
sequenciamento
Genomic o ADN foi isolado a partir de células utilizando o kit DNeasy (Qiagen). A amplificação por PCR e sequenciamento dos exons codificantes do
KEAP1 Comprar e exão 2 de
NRF2
foi realizada utilizando iniciadores como descrito anteriormente [53; 54]. Os produtos de PCR foram purificados utilizando o kit de purificação PCR QIAquick (Qiagen) e sequenciado por Sequetech Corporation (Mountain View, CA EUA). Todas as mutações foram confirmadas por sequenciação em ambas as direcções.
Western blotting
Pormenores experimentais para a preparação de lisados de células inteiras e extractos nucleares são em S1 protocolos. A concentração de proteína foi determinada utilizando DC Protein Assay (Bio-Rad, Hercules, CA EUA). As proteínas (20 a 40 ug) foram resolvidas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C. Anticorpos informação é fornecida na Tabela S2. anticorpos secundários conjugados rábano-peroxidase foram de Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA EUA).
ensaios de ROS e glutationa
níveis Basal ROS foram medidos usando CM-H
2DCFDA (Molecular Probes , Eugene, OR EUA). Os níveis totais de glutationa foram medidos utilizando o GSH glutationa-Glo Assay (Promega, Madison, WI EUA). os níveis de glutationa foram normalizadas para os níveis de proteína celular utilizando o ensaio de SRB. Para controlar a variabilidade entre experiências, o basal de ROS e nível total de glutationa para cada linha celular foi normalizada para NCI-H460 (definido para um valor de 1). detalhes experimentais adicionais para ensaios de ROS e da glutationa pode ser encontrado em S1 protocolos.
A caspase-3/7 actividade
a actividade da caspase-3/7 foi determinada como descrito anteriormente [55] utilizando DEVD- AFC (EMD Biosciences, Billerica, MA, EUA) como substrato. Para controlar a variabilidade entre experiências, a fluorescência de cada amostra foi normalizada para 786-0 (definido para um valor de 100).
siARN
A549, DU 145, e as células NCI-H460 foram transfectadas inversa em OptiMEM com Lipofectamina RNAiMax (Life Technologies, Grand Island NY EUA) e 20 nM ou 20 nM siNRF2 siNTPool (GE Dharmacon, Lafayette, CO EUA), L-e D-003755-00-0005 001810-10-05 , respectivamente). amostras Mock não recebeu siRNA. As células foram plaqueadas em placas de 24 poços a uma densidade de 4 x 10
5 (A549 e DU 145) ou 8 x 10
5 (NCI-H460) células por poço ou em placas de 96 poços a uma densidade de 8 x 10
3 1,6 x 10
4 células (NCI-H460) por cavidade em meio RPMI (A549 e DU 145) ou 1640 suplementado com 10% de FBS. Vinte e quatro horas após a transfecção as células foram tratadas com DMSO ou RTA 405. Depois de 0, 24, 48, e 72 horas as células em placas de 96 poços foram fixadas com TCA a 50% e processados para o ensaio de SRB tal como descrito acima. Após 72 horas, as células nas placas de 24 poços foram lavados com PBS estéril e colhidas em tampão de lise para Western blots.
LSL-Kras
G12D fibroblastos embrionários de murídeo
Recombinação do Kras
LSL-G12D alelo foi realizada
in vitro
usando um Cre recombinase auto-excisão. MEFs foram infectados com 500-1000 MOI de simulação, Ad-EGFP ou partículas de adenovírus Ad-Cre /EGFP (GeneCopoeia, Rockville, MD EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram colhidas 72 horas após a infecção. O ADN genómico foi isolado utilizando o DNeasy Blood Kit de tecido (Qiagen) e a PCR foi realizada para avaliar a recombinação, conforme descrito (https://web.mit.edu/jacks-lab/protocols/KrasCond_tablesTWO.html). Níveis de tipo selvagem e Kras
proteínas G12D foram avaliadas por western blot.
Análises Estatísticas
Todos os experimentos foram realizados em triplicado, salvo indicação em contrário. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando o software GraphPad Prism 6.0. Os métodos utilizados para determinar a significância estatística são descritas em cada legenda.
Resultados
Classificação das linhas celulares de tumores humanos por actividade NRF2 basal
NRF2 foi avaliado para ser constitutivamente activo em tumores com KEAP1 mutante. O principal objetivo do nosso estudo foi determinar se a ativação do NRF2 pela RTA 405 aumenta o crescimento celular ou a sobrevivência em linhas tumorais humanas. Nós fundamentado que RTA 405 não seria capaz de aumentar a atividade NRF2 em linhas de células com baixa ou mutante KEAP1; No entanto, o estado de KEAP1 e o nível de actividade basal de NRF2 tem sido relatada para algumas linhas de cancro muito comuns [34; 48; 56]. Por conseguinte, a fim de avaliar o efeito de RTA 405, que em primeiro lugar realizada uma série de experiências para caracterizar o estado de KEAP1 e NRF2 em um painel de vinte linhas de tumores humanos (Quadro 1). Para conseguir isso, temos sequenciado todos os exons codificantes do
KEAP1 Comprar e exão 2 de
NFE2L2
para determinar se alguma das linhas celulares tinham mutações nestes genes. Nós limitado
NFE2L2
sequenciação ao exão 2 porque ele codifica o domínio de interacção KEAP1 e anteriormente foi demonstrado que mutações de activação abrigar [30; 53]. Os resultados de sequenciação confirmaram
KEAP1
mutações identificadas anteriormente na A549 e linhas celulares de cancro do pulmão de células NCI-H460 não pequenas [54] e identificou uma nova mutação (Q193H) na linha celular NCI-H23, que é também derivada de cancro do pulmão de células não pequenas (Tabela 1). Não foram encontradas mutações no exão 2 de
NFE2L2
neste painel de linhas celulares.
Além de
KEAP1 Comprar e
NFE2L2
mutações , outros mecanismos de como a hipermetilação do promotor, a expressão miRNA e oncogênico sinalização-pode resultar em altos níveis constitutivos da atividade NRF2 [32-35]. Para determinar se qualquer uma das linhas celulares sem
KEAP1
ou
NFE2L2
mutações tinham altos níveis basais de atividade NRF2, medimos KEAP1, NRF2 nuclear, e NQO1 (um gene alvo NRF2 prototípico) proteína níveis por western blot. Descobrimos que, apesar de ter de tipo selvagem
KEAP1
e
NFE2L2
genes, várias das linhas celulares tinham características de atividade NRF2 elevada. Para facilitar a análise, agrupamos as linhas celulares em três categorias: aqueles com baixa, moderada ou alta atividade NRF2 basal (Fig 1A; borrões uncropped estão em S1 Fig). Em linhas de células com baixo NRF2 actividade basal (
N
= 8), a actividade de KEAP1 apareceu suficiente para promover a degradação NRF2, resultando em baixos níveis de NQO1 (Fig 1A e 1B, painéis superiores). Em linhas de células com actividade basal NRF2 moderado (
N
= 5), de tipo selvagem KEAP1 era detectável, mas é pareceu ser insuficiente para suprimir completamente a actividade NRF2, resultando em níveis detectáveis de NQO1 (Figura 1A e 1B , painéis meio). As linhas de células com elevada actividade basal (NRF2
N
= 7) tinham níveis baixos quer mutantes ou de KEAP1, que apareceu a torná-lo incapaz de atingir NRF2 para degradação (Fig 1A e 1B, painéis inferiores). Como resultado, os níveis elevados de NQO1 NRF2 nuclear e foram detectados nestas linhas celulares.
. diagrama esquemático que mostra as características de linhas de células com baixo (painel superior), moderada (painel do meio), ou elevada (painel inferior) NRF2 actividade basal. B. Os níveis de proteína de KEAP1 e NQO1 (lisado de células inteiras), e NRF2 (fracção nuclear), foram avaliadas por transferência de western. Actina (lisado de células inteiras) e HDAC2 (fracção nuclear) serviram como controlos de carga. Com base em KEAP1, NRF2, e os níveis de proteína em NQO1, as linhas celulares foram classificados de acordo com a sua actividade basal NRF2
A maioria das linhas celulares pode ser categorizado em um dos três grupos.; No entanto, alguns possuía características de mais de um grupo. Por exemplo, quando comparados com outras linhas de células no grupo NRF2 actividade basal baixa, a linha SK-N-SH tinham níveis relativamente baixos de KEAP1 (Fig 1B, painel superior). No entanto, com base nos baixos níveis de NRF2 nuclear e de NQO1, os níveis KEAP1 nesta linha pareceu ser suficiente para promover a degradação NRF2. Por outro lado, quando em comparação com as outras linhas de células no grupo NRF2 actividade basal elevada, a linha NCI-H460 tinha níveis relativamente elevados de KEAP1 (Fig 1B, painel inferior). No entanto, sabe-se que
KEAP1
é mutado (D236H) em células NCI-H460 e que NRF2 é constitutivamente activa [54]. Apesar de muito altos níveis de NRF2 nuclear na linha de células A498, foram detectados níveis relativamente baixos de NQO1. No entanto, esta linha de células exibiram várias outras características que eram consistentes com elevada actividade NRF2 basal (ver abaixo); o que sugere que se NQO1 pode ser perdido ou mutado. Finalmente, embora KEAP1 foi mutante (Q193H) na linha celular NCI-H23 (Tabela 1), a actividade NRF2 pareceu ser baixa, o que sugere que a mutação Q193H pode ser um polimorfismo que não reduz a função KEAP1. Isto é consistente com os resultados de um estudo recente em que 4 de 18 mutações KEAP1 identificados em amostras de cancro do pulmão não prejudicar a capacidade de promover a KEAP1 NRF2 degradataion [57].
Caracterização de linhas de células de tumores humanos com diferentes níveis da atividade NRF2 basal
Para validar ainda mais a classificação das linhas de células, foram medidos os níveis de outros biomarcadores de actividade NRF2, incluindo
NQO1
mRNA, ROS, e os níveis de glutationa. Como mencionado acima,
NQO1
é um gene alvo NRF2 prototípico e seria de esperar que a sua transcrição a ser elevada em linhas de células com elevada actividade NRF2 basal. Quando comparados às linhas de células com baixo NRF2 actividade basal, aqueles com actividade basal NRF2 moderada e alta tinham níveis sucessivamente mais elevados de expressão de NQO1 (Fig 2A e Fig S2). Além
NQO1
, NRF2 também regula a expressão de vários genes envolvidos na síntese de glutationa e aumenta os níveis de glutationa celular [58]. Consistente com isto, os níveis totais de glutationa foram significativamente elevados em linhas de células com elevada actividade basal NRF2 em comparação com aqueles com baixa ou moderada actividade NRF2 basal (Figura 2B e Figura S2). Ao aumentar os níveis de glutationa, bem como a expressão de outros genes antioxidantes, NRF2 reduz o stress oxidativo. Para avaliar o nível de estresse oxidativo em cada linha de células de tumor, medimos níveis de ROS usando uma sonda fluorescente. Descobrimos que os níveis de ROS foram menores nas linhas de células com actividade NRF2 basal alta (Fig 2C e S2 Fig). Portanto, em resumo, as linhas celulares com elevada actividade basal NRF2 tinha níveis elevados de NQO1 mRNA, níveis elevados de glutationa, e baixos níveis de ROS. Além disso, os níveis de glutationa em NQO1 e aumentado em proporção com o nível de actividade basal NRF2. Em contraste, os níveis de ROS não seguiu uma tendência semelhante: não houve diferença entre as linhas de células com níveis baixos e moderados de atividade NRF2. Isto sugere que a activação de NRF2 moderada é suficiente para aumentar a expressão do gene alvo e a síntese de glutationa, mas a actividade NRF2 deve atingir um certo limiar, o que só pode ser alcançado quando KEAP1 está ausente ou inactivo, de forma a reduzir os níveis de ROS.
A.
NQO1
níveis de mRNA para linhas de células individuais foram medidos por qPCR e normalizados para o basal média
NQO1
nível para todas as linhas de células com baixa atividade NRF2 basal. B. Os níveis totais de glutationa para linhas celulares individuais foram normalizados com o NCI-H460 (definido para um valor de 1), que foi executado como uma referência em cada experiência. Os valores apresentados foram normalizados para o nível de glutationa basal média para todas as linhas de células com baixa atividade NRF2 basal. C. espécies reactivas de oxigénio (ROS), os níveis de linhas celulares individuais foram normalizados com o NCI-H460 (definido para um valor de 1), que foi executado como uma referência em cada experiência. Os valores mostrados foram normalizados para o nível basal média ROS para todas as linhas celulares com baixa actividade NRF2 basal. D-E. Basal IKKβ (D) e BCL2 (E) os níveis de proteína em linhas celulares de tumores humanos com baixa, moderada ou alta actividade NRF2 basal. As barras de erro em A-C são SEM. A significância estatística foi determinada pelo teste de Mann-Whitney. *,
P Art .05; **,
P Art .01; ***,
P Art . .001
Além de NRF2, KEAP1 regula os níveis de outras proteínas, incluindo IKKβ e BCL2 [59; 60]. KEAP1 se liga directamente para, e facilita a ubiquitinação de IKKβ e BCL2 pelo complexo E3 ligase CUL3 /RBX1. Isto leva a degradação de IKKβ e BCL2 pelo proteassoma. Por conseguinte, a perda de KEAP1 em linhas de células resulta em níveis elevados de IKKβ e BCL2 [59; 60], e os níveis de IKKβ são elevados em tumores humanos com níveis baixos KEAP1 /CUL3 [59; 61]. IKKβ é uma cinase que promove a degradação do factor nuclear de leve kapa potenciador gene do polipéptido em células B Inhibitor, alfa (NFKBIA ou IκBα), um supressor do factor de transcrição NF-kB, que controla a expressão de muitos genes envolvidos na sobrevivência, e BCL2 é um oncogene com actividade anti-apoptótica. Dada a relação entre KEAP1, IKKβ, BCL2, e cancro, nós investigamos se as linhas de células de tumor com elevada actividade basal NRF2 também tinha níveis elevados de proteínas BCL2 e IKKβ. Descobrimos que muitas linhas celulares no painel tendem a ter níveis elevados de IKKβ (S3 Fig). No entanto, os níveis de IKKβ foram elevados em 100% de linhas celulares com elevada actividade NRF2 basal, em comparação com 80% das linhas de células com actividade NRF2 moderada, e 62,5% das linhas de células com baixa actividade NRF2 (Figura 2D). Quando investigamos BCL2, descobrimos que menos das linhas celulares tinham níveis elevados BCL2 (S3 Fig). Nas linhas de células com elevada actividade basal NRF2, 71% também tinha níveis elevados de BCL2, em comparação com 37,5% e 20% das linhas de células com actividade de baixo e moderado NRF2, respectivamente. Como os níveis de glutationa, IKKβ níveis aumentados em proporção aos níveis de actividade NRF2 basal, enquanto que os níveis elevados em BCL2 foram uma fracção maior de linhas de células que tinham elevada actividade de NRF2, em comparação com aqueles com actividade baixa ou moderada NRF2. Isto sugere que os substratos KEAP1 diferentes podem ter diferentes sensibilidades a alterações na função KEAP1. Tomados em conjunto, estes dados são consistentes com a noção de que a perda de KEAP1 afeta múltiplos alvos que são relevantes para a biologia de células de câncer, incluindo não só NRF2, mas também IKKβ e BCL2 [62].
IKKβ e BCL2 níveis
Keap1
– /- fibroblastos embrionários murinos
Temos demonstrado que os níveis de IKKβ e BCL2 tendem a ser maiores em linhas de células tumorais que têm alta atividade NRF2 basal, sugerindo que mutante ou níveis baixos /ausentes de KEAP1 pode contribuir para níveis elevados IKKβ e BCL2. Nós próxima usadas do tipo selvagem (WT) e
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– /- murino fibroblastos embrionários (MEFs) como um modelo para avaliar diretamente a relação entre KEAP1, IKKβ, e os níveis de BCL2. Como relatado anteriormente [49], NRF2 foi elevada em
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– /- MEFs (S4 FIG). O tratamento com RTA 405 aumentou os níveis de NRF2 em WT MEFs, mas não no
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– /- MEFs (S4 FIG). Consistente com a ativação NRF2, a proteína (A) e mRNA (Fig 3B) níveis de NQO1 e GCLM, dois genes alvo NRF2, foram elevadas em
Keap1
– /-
MEFs . Além de elevados níveis de NRF2 e seus genes alvo a jusante, também descobrimos que os níveis de IKKβ e BCL2 foram maiores no
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– /- MEFs que no WT MEFs (Fig 3A). Para determinar se os níveis elevados IKKβ correlacionados com um aumento da sua actividade, foram avaliados os níveis de componentes a jusante da via de sinalização de NF-kB. IKKβ fosforila IκBα, o que leva a sua degradação e subsequente activação do factor de transcrição NF-kB. Consistente com maior atividade IKKβ, observou-se níveis mais baixos de IκBα (Fig 3A) e os níveis de expressão significativamente mais elevados de vários genes alvo NF-kB, incluindo
CCND1
,
MMP9
,
Ptgs2
,
Vegf
,
e Bcl2l1
, no
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– /- MEFs em comparação com WT MEFs (Fig 3C e S5 Fig). Não houve diferenças significativas no
CCL2
,
Birc3
ou
IL1B
níveis, e por razões desconhecidas
CCL5
níveis foram significativamente maiores no WT MEFs que em
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– /- MEFs (S5 FIG). Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que a perda de resultados KEAP1 em níveis mais elevados IKKβ e BCL2, e que o nível elevado de IKKβ leva a um aumento da actividade transcricional de NF-kB. Estes resultados são consistentes com a observação de que a perda de KEAP1 foi correlacionada com uma maior actividade transcricional de NF-kB em tumores humanos [61].
. níveis basais de proteínas interagindo KEAP1 e alvos a jusante foram avaliados em WT e
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– /- MEFs por western blot. GAPDH serviu como um controlo de carga. níveis de mRNA B. Basal de
NQO1
e
GCLM
no WT e
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– /- MEFs medido por qPCR. níveis de mRNA em
Keap1
– /- células foram normalizados para células WT. *,
P Art .05; **,
P Art .01 Vs. WT pelo teste t emparelhado. níveis C. Basal de mRNA de
CCND1
,
MMP9
,
Ptgs2
, e
Vegf
no WT e
Keap1
– /- MEFs medido por qPCR. níveis de mRNA em
Keap1
– /- células foram normalizados para células WT. ***,
P Art .001; ****,
P Art 0001 vs. WT pelo teste t. Para todos os painéis, os pontos de dados são a média de três experiências independentes. As barras de erro são SD
Taxa de crescimento de células com diferentes níveis de atividade NRF2 basal
Perda de KEAP1 foi avaliado para aumentar a taxa de proliferação de MEFs. [48; 63]. Para confirmar e ampliar estes estudos, contamos o número de WT viável e
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– /- MEFs em intervalos de 24 horas após a semeadura. Descobrimos que significativamente mais
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– /- MEFs que WT MEFs estavam presentes em 48 e 72 horas (Fig 4A). *,
P Art **,
P Art 0,01; 0,0001. *,
P Art 0,05; **,
P Art 0,01; 0,0001; **,
P Art 0,01; 0,001. *,
P Art 0,05; *,
P Art 0,05; 0,001; ns, não significativo; *,
P Art 0,05; **,
P Art 0,01;