Abstract
Fundo
O
ARID1A
gene codifica adenina-timina (AT) rico em interativo 1A proteínas contendo domínio, que participa na remodelação da cromatina.
ARID1A
foi mostrou funcionar como um supressor do tumor em vários tipos de cancro. No presente estudo, investigamos o valor de
ARID1A
no cancro gástrico primário expressão e prognóstico. Enquanto isso, o papel biológico de
ARID1A
foi investigado usando o modelo de células in vitro.
Metodologia /Principais Achados
Para investigar o papel da
ARID1A
gene na patogénese do cancro gástrico primário, PCR em tempo real quantitativo e western blotting foram utilizados para examinar o
ARID1A
expressão em tecidos cancerosos e cancerosos emparelhados. Os resultados revelaram diminuição
ARID1A
mRNA (
P
= 0,0029) e proteína (
P
= 0,0015) expressão na maioria dos tecidos portadores de tumor em comparação com o não-tumor anexa adaptada tecidos, e em linhas celulares de cancro gástrico. Para investigar mais os papéis clínico-patológicas e prognósticos do
ARID1A
expressão, realizamos análises de imuno-histoquímica dos 224 blocos de tecido de câncer gástrico embebidos em parafina. Os dados revelaram que a perda de
ARID1A
expressão foi significativamente correlacionada com o estádio T (
P
= 0,001) e grau (
P
= 0,006). Consistente com estes resultados, verificou-se que a perda de
ARID1A
expressão foi significativamente correlacionada com pior sobrevida em pacientes com câncer gástrico (
P
= 0,003). A análise de regressão de Cox mostrou que
ARID1A
expressão era um preditor independente de sobrevida global (
P
= 0,029). Além disso, as funções de
ARID1A
na proliferação e formação de colónias de linhagens de células gástricas foram analisados por transfecção de células com o comprimento total
ARID1A
vector de expressão ou siRNA alvejando
ARID1A
. Restaurar
ARID1A
expressão em células cancerosas gástricas inibiu significativamente a proliferação celular e formação de colónias. Silenciando
expressão ARID1A
na linha de células epiteliais gástrica melhorada significativamente a taxa de crescimento celular.
Conclusões /Significado
Nossos dados sugerem que
ARID1A
pode desempenhar um importante papel no câncer gástrico e pode servir como um marcador de prognóstico valioso e alvo potencial para a terapia genética para o tratamento do cancro gástrico
Citation:. Wang Dd, Chen Yb, Pan K, Wang W, Chen Sp, Chen Jg , et ai. (2012) diminuição da expressão do
ARID1A
gene está associada com mau prognóstico no câncer gástrico primário. PLoS ONE 7 (7): e40364. doi: 10.1371 /journal.pone.0040364
editor: Patrick Tan, Duke-National University of Singapore Graduate Medical School, Singapura
Recebido: 19 Janeiro, 2012; Aceito: 06 de junho de 2012; Publicação: 13 de julho de 2012
Direitos de autor: © 2012 Dandan et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (30973398) e Guangdong Natural Science Foundation (925.100.890). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer gástrico é a quarta neoplasia maligna mais comum em todo o mundo e a segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer a cada ano (10,4% das mortes por câncer) [1]. O tratamento do cancro gástrico inclui uma combinação de cirurgia, quimioterapia ou terapia de radiação. No entanto, quase 60% dos pacientes afetados sucumbir ao câncer gástrico, mesmo após uma ressecção curativa isoladamente ou após a terapia adjuvante [2]. Ele tem sido conhecido que os resultados câncer gástrico de uma combinação de fatores ambientais e do acúmulo de alterações genéticas generalizadas e específicas. Muitas das alterações genéticas ou epigenéticas associadas ao câncer gástrico, incluindo a perda de heterozigosidade, microssatélites e cromossômica instabilidade e hipermetilação, têm sido relatados [3]. Entender essas alterações e os mecanismos moleculares envolvidos na carcinogênese gástrica serão críticos para a melhoria do diagnóstico, terapêutica e prognóstico prognóstico desta doença.
O complexo-remodelação da cromatina SWI /SNF eukaryotically conservada desempenha um papel essencial em uma variedade de processos celulares, incluindo a diferenciação, proliferação e reparação do ADN [4]. Perda de subunidades de SWI /SNF tem sido relatada na maioria dos tumores, e um grande número de observações experimentais sugerem que este complexo é crítico para a supressão do tumor [5]. Os complexos têm sete ou mais subunidades não catalíticos que supostamente ajudam a modular a segmentação e da atividade da ATPase [6]. Uma subunidade do complexo, hSNF5 /INI1 /BAF47, tem sido identificada como um supressor de tumores [7], [8]. A outra subunidade não catalíticos, P270 /ARID1A /BAF250a (adenina-timina rica em AT interactivo-domínio contendo proteína 1A), foi demonstrada ser essencial para a detenção do ciclo celular normal [9]. Knockdown de
ARID1A
em uma linha de células de leucemia confere resistência à apoptose mediada por Fas [10]
.
Recentemente,
ARID1A
mutações e perda de proteína BAF250a foram encontrados para correlacionam fortemente com o carcinoma do ovário de células claras e carcinoma endometrióide baixo grau uterino [11] – [13]. Estas observações indicam que
ARID1A
é um potencial gene supressor tumoral candidato. No entanto, o significado clínico de tal expressão diferencial e a função da proteína ARID1A permanecem indefinidos, devido à falta de estudos utilizando amostras frescas de tumor humano. No presente estudo, analisamos o ARID1A
nível de expressão no câncer gástrico utilizando quantitativa em tempo real RT-PCR, western blot e imunohistoquímica. Enquanto isso, identificamos a relação entre o
ARID1A
expressão e características clínico-patológicas e avaliou seu valor prognóstico na sobrevida pós-ressecção de pacientes com câncer gástrico. Além disso, avaliamos o papel funcional da
ARID1A
na tumorigênese do câncer gástrico primário, examinando a formação proliferação e colónia in vitro em linhas de células gástricas.
Resultados
ARID1A
Expressão mRNA Analisando por quantitativa em tempo real RT-PCR
O nível de mRNA de
ARID1A
foi determinada por ensaios de RT-PCR quantitativo em tempo real em 66 emparelhado canceroso e os correspondentes tecidos normais adjacentes gástricas mucosas. O
ARID1A
nível de expressão foi significativamente menor em 43 (65,15%) tecidos portadores de tumor em comparação com os tecidos não tumorais adjacentes (
P
= 0,0029, Figura 1).
A expressão de ARNm relativa de
ARID1A
foi significativamente diminuída nos tecidos de cancro gástrico em comparação com os tecidos não tumorais adjacentes correspondentes (n = 66,
P
= 0,0029). As linhas horizontais representam a média.
Expression ARID1A Protein Analisando por Western Blotting
Western blot foi realizada em 25 amostras de câncer gástrico e correspondentes tecidos da mucosa gástrica não-cancerosas adjacentes a partir do 66 emparelhado amostras. Os resultados mostraram uma banda ARID1A com o tamanho esperado de 242 kDa e a quantidade de proteína presente ARID1A foi adicionalmente medido por densitometria. Consistente com os resultados em tempo real quantitativos de PCR, uma diminuição na expressão ARID1A foi visto em 13 (52%) dos tecidos de tumor gástrico em comparação com os tecidos não tumorais adjacentes correspondentes (
P
= 0,0015, Figura 2A e A Figura 2B). Do mesmo modo, a expressão da proteína ARID1A foi notavelmente diminuída em linhas celulares de cancro gástrico, SGC7901, AGS, especialmente em MGC803, em comparação com a linha de células normais gástrica GES1 (Figura 2C).
(A) Níveis relativos de expressão de proteínas em ARID1A tecidos gástricos cancerosas e tecidos não cancerosos (ARID1A /GAPDH, n = 25,
P
= 0,0015). As linhas horizontais representam a média. (B) resultado representativo da expressão da proteína ARID1A em 4 emparelhado gástricas (C, tecidos com câncer gástrico; N, combinado mucosa gástrica não cancerosos) tumorais e não tumorais, os tecidos adjacentes correspondentes. (C) O nível de proteína ARID1A foi notavelmente reduzida em linhas celulares de cancro gástrico, SGC7901, AGS, especialmente em MGC803, em comparação com a linha de células gástricas normais GES1.
Análise imuno-histoquímica de ARID1A Expressão em tecidos de câncer gástrico amostras e sua relação com os parâmetros clínico
Para investigar mais os papéis clínico-patológicas e prognóstico da expressão ARID1A, foi realizada imuno-histoquímica dos 224 blocos de tecido de câncer gástrico embebidos em parafina. No geral, 115 de 224 (51,3%) casos apresentaram expressão ARID1A negativo em tecidos cancerosos (Figura 3B), enquanto 109 (48,7%) casos apresentaram imunocoloração positiva (Figura 3C D). mucosa gástrica normal apresentou coloração positiva forte ARID1A (Figura 3A). As correlações entre a expressão de ARID1A e vários parâmetros clínico-patológicos são listados na Tabela 1. Os dados mostraram que a perda de expressão ARID1A foi significativamente correlacionado com a profundidade de infiltração do tumor (fase T,
P
= 0,001) e tumoral grau (
P
= 0,006), mas não com a idade, sexo, tamanho do tumor, metástases à distância (fase M), e locus de tumor ou metástase de gânglio linfático local (N palco).
( a) coloração ARID1A forte foi observada na mucosa gástrica não canceroso. (B) adenocarcinoma gástrico ARID1A-negativos, grau 3. (C) coloração ARID1A fraco no adenocarcinoma gástrico, Grau 2. (D) coloração ARID1A forte no adenocarcinoma gástrico, grau 1.
expressão de ARID1A e evolução clínica
As taxas de sobrevida global em 5 anos em pacientes com expressão ARID1A positivo e negativo foram de 68,8% e 52,2%, respectivamente. A sobrevida global de pacientes com expressão ARID1A negativo foi significativamente pior do que a de pacientes ARID1A-positivo (
P
= 0,003, teste de log-rank, Figura 4). Análises de regressão univariada de Cox mostrou que a profundidade de infiltração tumoral, metástases em linfonodos local, metástases à distância, tamanho do tumor e expressão ARID1A foram significativamente associados com a sobrevida global (Tabela 2). Além disso, uma análise de regressão de Cox multivariada confirmou a profundidade de infiltração tumoral, metástases em linfonodos local, metástases à distância e expressão ARID1A como preditores independentes de sobrevida global de pacientes com câncer gástrico (Tabela 2).
A taxa de sobrevivência de pacientes no grupo ARID1A-negativo foi significativamente menor do que a dos pacientes do grupo de ARID1A-positivas (-rank teste log,
P
= 0,003).
o papel da
ARID1A
na proliferação celular e Formação de Colónias em MGC803 e GES1 linhas celulares
Para avaliar os efeitos do
ARID1A
sobre a proliferação celular, a
ARID1A
vector de expressão e o vector de controlo foram, respectivamente transfectado em MGC803 células.
expressão ARID1A
em células transfectadas foram detectadas por Western blotting (Figura 5A). O ensaio de crescimento celular revelou que a taxa de crescimento de células em
ARID1A
-transfected células gástricas cancerosas foram significativamente mais baixos do que as células de controlo transfectadas com vector gástricas cancerosas (Figura 5C). Enquanto isso, a eficiência da formação de colónias foi significativamente (
P
= 0,0379) inibiu em
ARID1A
-transfected células cancerosas gástricas em comparação com células de controlo transfectadas com vector de câncer gástrico (Figura 5D). Para confirmar ainda mais a função de supressão de proliferação de
ARID1A
, que silenciou o
ARID1A
expressão na linha de células GES1 com siRNA. O
expressão ARID1A
em células transfectadas foram detectadas por Western blot (Figura 5B). Descobrimos que silenciar a expressão de
ARID1A
em GES1 proliferação celular significativamente melhorada em comparação com o tratamento com siRNA simulada (Figura 5E).
(A) Análise de Western blot de restaurar
ARID1A
expressão em células MGC803. (B) Análise de Western blot de expressão silenciado
ARID1A
em células GES1. (C) ensaio de proliferação celular que mostra o efeito supressor de restaurar
ARID1A
expressão na proliferação in vitro de linha celular MGC803. (D)
ARID1A
formação de colónias inibido de MGC803 células. As imagens são mostrados à esquerda e à direita, análises quantitativas dos números de placa são apresentados como média ± DP. (E) ensaio de proliferação celular mostrando taxa de proliferação significativamente melhorada do
ARID1A
-silenced GES1 células em comparação com células siRNA tratamento GES1 simulados. *,
P Art 0,05 versus o mock-controle; **,
P
. 0,01 versus o mock-controle
Discussão
Apesar dos grandes avanços no diagnóstico e terapia, câncer gástrico continua sendo um dos as neoplasias mais mortais, com um prognóstico sombrio após gastrectomia radical [14], [15]. O resultado clínico do cancro gástrico é determinada por uma série de características do tumor, tais como o crescimento loco-regional e invasão do tumor, grau de diferenciação, angiogénese, metástase distante e progressão do ciclo celular, que são regulados por uma variedade de genes relacionados, incluindo oncogenes e supressor tumoral genes. Portanto, a identificação de biomarcadores específicos de cancro gástrico envolvidos nestes procedimentos é muito importante para o diagnóstico, tratamento e prognóstico previsão na clínica.
ARID1A
, um gene supressor tumoral recém-identificado que codifica um membro do complexo SWI /SNF, tem uma frequência de mutação alta no cancro da bexiga, carcinoma endometrioid uterina, endometrioid ovário e carcinoma de células claras [11] – [13], [16], [17]. No carcinoma de células claras de ovário, é relatado que
ARID1A
mutação é significativamente associada com ARID1A imunorreatividade [18]. Recentemente, estudo exome sequenciamento revelou que
ARID1A
também é frequentemente mutado no cancro gástrico [19], [23]. No entanto, até agora a expressão, significado clínico e funções biológicas do
ARID1A
no câncer gástrico não foram exploradas. Portanto, avaliamos a expressão de
ARID1A
no câncer gástrico por PCR em tempo real, western blot e imunohistoquímica, além de seu significado clínico-patológico e prognóstico em uma grande amostra humana. Além disso, utilizando no modelo de células in vitro, nós também investigou o papel supressor de tumores de
ARID1A
em células gástricas em detalhe.
No presente estudo, demonstramos que
ARID1A
foi expressa tanto a nível inferior mRNA e proteína nos tecidos câncer gástrico que corresponde mucosa não-cancerosas. De acordo com estes resultados de biologia molecular, imuno-histoquímica com um anticorpo anti-ARID1A mostrou que
ARID1A
foi completamente silenciada em 115 de 224 amostras de câncer gástrico do paciente, com expressão positiva em mais de 109 pacientes. Nossa observação está de acordo com uma série de estudos revelando que
ARID1A
expressão é frequentemente perdido ou reduzido em uma série de tecidos de câncer e linhas celulares, tais como o cancro da mama, carcinoma endometrioid uterino, de células claras de ovário e carcinoma endometrioid [13,18,20, e 21].
Até o momento, as causas da
ARID1A
silenciamento não foram completamente elucidados. Os estudos existentes se concentrar em mutações no
ARID1A
, particularmente em cancros ginecológicos. Relata-se que uma mutação sem sentido ou de indel
ARID1A
foi correlacionada com a perda ou diminuição da expressão da proteína no carcinoma endometrióide uterino, carcinoma do ovário endometrióide e carcinoma de células claras [11] – [13], [18]. Em uma investigação genómica integrada, Mamo
et al
. só encontrou uma mutação truncada de
ARID1A
na linha de células do cancro da mama T47D, sem qualquer mutação nas amostras de câncer de mama 11 que apresentaram cópia de DNA perda número no 1p36.11 local adjacente ao
ARID1A
[22]. Oito dos nove amostras com perda do número de cópias de DNA em 1p36.11 também têm baixa expressão da proteína ARID1A, sugerindo uma concordância entre a perda do número de cópias de DNA e
ARID1A
inativação. No estudo exome sequenciamento por Wang
et al
., Um total de 46 mutações foi encontrado em 32 de 109 (29%) amostras de câncer gástrico, com 39 (85%) mutações truncadas [19]. Vinte e quatro (75%) das 32 amostras com câncer gástrico com
ARID1A
mutações mostrar qualquer perda ou expressão da proteína substancialmente reduzida em comparação com aqueles sem
ARID1A
mutação. Em contraste, há apenas 6 amostras de câncer gástrico que mostram a expressão da proteína ausente ou fraco na ausência de detectável
ARID1A
mutação, o que sugere que outros mecanismos podem contribuir para
ARID1A
inativação. Recentemente, outra pesquisa exome sequenciamento por Zang
et al
. também mostrou
ARID1A
mutações em 8% das amostras gástricas, dos quais 75% perda ou redução da expressão da proteína [23]. Mais interessante, ambos os estudos demonstraram maior
ARID1A
alterações em amostras de câncer gástrico com instabilidade de microssatélites (MSI) do que aqueles com a estabilidade de microssatélites (MSS). Além disso, o espectro de mutação do
ARID1A
é distinta entre os dois tipos genéticos do câncer gástrico, com a maioria dos indels no tipo MSI e mais variações de-neucliotide única no tipo MSS. MSI é definido como mutações InDel dentro de repetições de nucleotídeos (conhecidas como regiões microssatélites) resultaram de erros de incompatibilidade DNA de genes de reparo induzida por inactivação de replicação [24]. Proposto como os que iniciam eventos genômicos de câncer gástrico, MSI, muitas vezes leva ao acúmulo de instabilidades genéticas relacionadas ao câncer adicionais, como as perdas de alelos e mutações frameshift em genes envolvidos na regulação da proliferação celular, apoptose e reparo do DNA. Tem sido relatado que a MSI ocorre em 25% a 50% do cancro gástrico esporádica, definindo um tipo de doença genética única com diferentes características clinicopatológicas [24]. No estudo de Wang
et al
., A taxa de mutação INDEL (78%) de
ARID1A
no câncer gástrico MSI é comparável à de
TGFBR2
na MSI cólon cancro, um gene controlador bem estabelecida e funcionalmente inactivado validado pela MSI [25]. Estes dados indicam que a mutação de
ARID1A
juntamente com MSI pode desempenhar um papel importante na carcinogénese gástrica. Portanto, a relação entre o
alterações ARID1A Comprar e MSI estado câncer gástrico, bem como o seu significado clínico-patológico, precisa de uma investigação mais aprofundada na pesquisa futura.
No estudo de Wang
et al.
, a expressão de
ARID1A
só foi detectado em uma amostra de tamanho pequeno (32 casos), e não houve uma maior exploração de seu significado clínico [19]. Aqui, em uma população câncer gástrico maior (224 casos), descobrimos que a perda de
ARID1A
expressão foi significativamente correlacionada com um maior estádio T de câncer gástrico, o que implica que a ausência de
ARID1A
expressão pode promover o crescimento tumoral e a invasão. Além disso, detectamos menor imunorreatividade ARID1A em tecidos com câncer gástrico pouco diferenciadas do que aquelas em bem diferenciados, o que sugere que a diminuição da
ARID1A
expressão pode desempenhar um papel no tumor de-diferenciação. Consistente com nossos achados, outros pesquisadores também descobriram que a diminuição da
ARID1A
expressão é significativamente associada com um maior grau de câncer de mama [22], bem como um estágio FIGO maior em carcinoma de células claras ovário [21]. ARID1A promove a formação de Brg1 ou BRM-contido SWI /SNF complexos de cromatina remodelação, que são essenciais para a apreensão do ciclo celular normal [9], [26].
A análise de sobrevivência de Kaplan-Meier mostrou uma correlação significativa entre a perda de
ARID1A
expressão e pior evolução clínica de pacientes com câncer gástrico após a operação radical. Cox taxa de risco de regressão análises demonstraram ainda que o
ARID1A
nível de expressão foi um fator de risco independente para a sobrevivência, o que sugere que ele pode servir como um biomarcador de prognóstico valioso para pacientes com câncer gástrico após a cirurgia e um alvo potencial para a terapia genética em o tratamento do cancro gástrico. No carcinoma de células claras do ovário, também foi relatado que pacientes com positiva
ARID1A
expressão tiveram uma sobrevida livre de progressão mais do que aqueles com negativo
ARID1A
expressão [21]. Além disso, a perda de
ARID1A
expressão é significativamente correlacionada com chemoresistance em carcinoma de células claras de ovário, que também está associado a um mau prognóstico do câncer. Estes dados sugerem que
ARID1A
exame expressão e mutação pode ser útil para orientar o manejo clínico. Tomados em conjunto, as nossas observações de que a perda de
expressão ARID1A
no câncer gástrico está associada com fenótipos mais malignos e pior prognóstico implica que ele pode desempenhar um papel supressor de tumor na carcinogênese gástrica.
investigado o papel funcional da
ARID1A
em linhas de células gástricas. Restaurar
ARID1A
expressão em células cancerosas gástricas inibiu significativamente a proliferação celular e formação de colónias. Silenciar a expressão de
ARID1A
em células epiteliais gástricas aumentou significativamente a velocidade de crescimento celular. Estes resultados indicaram que
ARID1A
pode desempenhar um papel de importação na inibição do crescimento de células tumorais. Recentemente, ensaios funcionais de
ARID1A
em linhas celulares de cancro gástrico por Zang
et al
. sugeriu que
ARID1A
exercer atividade supressor de tumor [23]. Guan
et al
. demonstraram que o restabelecimento da expressão do tipo selvagem
ARID1A
é suficiente para suprimir a proliferação e tumorigenecity de xenoenxertos com linhas celulares de cancro do ovário humano abrigando
ARID1A
mutações, enquanto que o RNA de interferência mediada por
ARID1A
silenciamento aumenta a proliferação celular e tumorigenicidade em duas linhas não transformadas humanos ovarianos epiteliais celulares, Iosé-80pc e OSE4 [27]. Estes dados, juntamente com a nossa, sugerem que a perda de
ARID1A
pode desempenhar um papel importante no processo de carcinogênese.
Em conclusão, temos demonstrado a perda de
ARID1A
expressão em cancro gástrico e a sua correlação com um fenótipo mais maligna e pior prognóstico em um grande número de amostras clínicas. Além disso, provamos que
ARID1A
pode inibir o crescimento de células tumorais e formação de colónias in vitro. Para o melhor de nosso conhecimento, os dados gerados no presente estudo representa o primeiro relatório correlacionando a presença de
ARID1A
com características clínicas e a sobrevida global de pacientes com câncer gástrico. Tomados em conjunto com os resultados de Wang
et al.
E Zang
et al
. [19], [23], nós ainda confirmado que
ARID1A
pode servir como um supressor de tumor candidato e biomarcador prognóstico em carcinogênese gástrica.
Materiais e Métodos
Declaração de Ética
a pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Sun Yat-sen University Cancer Center de Ética e consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente envolvido no estudo.
linhas de células e condições de cultura
as linhas celulares de cancro gástrico, SGC7901, AGS, MGC803, ea linha de células de mucosa epitelial gástrica GES1 foram obtidos do Comité das Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). As linhas de células foram cultivadas em meio RPMI 1640 fornecidos com soro de bovino fetal, termicamente inactivo a 10% (FBS). As células foram incubadas a 37 ° C numa câmara humidif içada contendo 5% de CO
2.
Humano Amostra de Tecido
s
Um total de 66 emparelhado e canceroso tecidos da mucosa combinados adjacentes não cancerosas gástricas foram coletadas de pacientes com câncer gástrico submetidos a gastrectomia a Sun Yat-sen University Cancer Center entre 2009 e 2011, eo diagnóstico foi confirmado pelo exame patológico. A 25 emparelhado cancerosos e não cancerosos tecidos da mucosa gástrica adjacentes usados para detectar a expressão da proteína ARID1A em western blot correspondente foram selecionados a partir das 66 amostras pareadas. Após a ressecção cirúrgica, tecidos frescos foram imediatamente imersas em RNAlater (Ambion, Inc., EUA) para evitar a degradação de ARN, armazenado a 4 ° C durante a noite para permitir a penetração completa de RNAlater para o tecido e, em seguida, congeladas a -80 ° C até ARN e extracção da proteína foi realizada. Mais 224 amostras de carcinoma embebidos em parafina primários gástricos que tinham sido recolhidos entre 2003 e 2005, foram obtidos a partir da Sun Yat-sen University Cancer Center. Nenhum destes pacientes tinha recebido radioterapia ou quimioterapia antes da cirurgia. Os dados de acompanhamento dos pacientes com câncer gástrico neste estudo estão disponíveis e completa. Acompanhamento pós-operatório ocorreu em nosso ambulatório e incluiu exames clínicos e laboratoriais a cada 3 meses para os primeiros 2 anos, a cada 6 meses durante o terceiro ao quinto ano, anualmente, por mais 5 anos ou até à morte do paciente, o que ocorrer primeiro. O tipo histológico e estágio do câncer gástrico foram determinados de acordo com os critérios da classificação da Organização Mundial da Saúde e do estágio TNM estabelecidos pela União de Controle do Câncer International.
Extração de RNA total e em tempo real PCR quantitativo
o ARN total foi extraído utilizando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. concentração de ARN total foi determinada medindo a absorvância a 260 nm utilizando um espectrofotómetro NANO gota (ND-1000, Thermo Scientific, EUA). A transcrição reversa (RT), para sintetizar a primeira cadeia de ADNc foi realizada com 2 ug de ARN total tratado com M-MLV de transcriptase reversa (Promega, EUA) de acordo com as recomendações do fabricante. O ADNc resultante foi depois submetido a PCR em tempo real quantitativa para avaliação dos níveis de ARNm relativa de
ARID1A
e
GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato, como um controlo interno) com o seguinte iniciadores:
ARID1A
frente: 5′-CTTCAACCTCAGTCAGCTCCCA-3 ‘, e inverter: 5′-GGTCACCCACCTCATACTCCTTT-3’;
GAPDH
frente: 5′-CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC-3 ‘, e inverter: 5′-CCCAATACGACCAAATCCGTT-3’. a amplificação específica do gene foi realizada utilizando um sistema em tempo real de PCR ABI 7900HT (Life Technologies, Carlsbad, Califórnia, EUA) com uma mistura de PCR de 15 uL contendo 0,5 uL de ADNc, 7,5 ul de 2 x SYBR Green Master Mix (Invitrogen, Carlsbad , Califórnia, EUA), e 200 nM de iniciadores oligonucleotídicos apropriados. A mistura foi pré-aquecido a 95 ° C (10 min) e, em seguida, amplificado a 95 ° C (30 s) e 60 ° C (1 min) durante 45 ciclos. A curva de resolução foi medida a 95 ° C durante 15 seg, 60 ° C durante 15 seg e 95 ° C durante 15 seg. O valor de Ct (limiar de ciclo) de cada amostra foi calculada a partir dos ciclos de limiar com o software do instrumento (SDS a 2,3), e a expressão relativa de
ARID1A
ARNm foi normalizada para a
GAPDH
valor . Os dados foram analisados utilizando o ciclo limiar comparativa (2
-ΔCT) método.
Ocidental análise de transferência
As amostras homogeneizadas de câncer gástrico, incluindo tumor e não tumorais tecidos, bem como linhas celulares , foram lisadas em tampão de lise RIPA, e os lisados foram colhidos por centrifugação (12.000 rpm) a 4 ° C durante 30 min. Aproximadamente 50 ug amostras de proteína foram então separadas por electroforese num gel de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sódio a 12% e transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno. Depois de bloquear os sítios de ligação não específicos durante 60 minutos com leite não gordo a 5%, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com um anticorpo monoclonal de ratinho contra ARID1A (Abgent anticorpo primário Company, EUA, a uma diluição 1:1000) . As membranas foram então lavadas três vezes com TBST (soro fisiológico tamponado com Tris com Tween-20) durante 10 min e sondaram-se com a peroxidase de rábano (HRP) de anticorpo IgG de coelho anti-ratinho -conjugated (Imunologia Consultants Laboratory, EUA, a uma 1: diluição de 2000) a 37 ° C durante 1 hora. Após três lavagens, as membranas foram desenvolvidas por um sistema de quimioluminescência aumentada (Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, EUA). A intensidade da banda foi medido por densitometria utilizando o software Quantity One (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, EUA). Os níveis de proteína foram normalizados para que de GAPDH detectada utilizando anticorpo de rato anti-GAPDH humano monoclonal (Xangai Kangchen, China, a uma diluição 1:10000).
Análise Imunohistoquímica
As secções de tecido foram desparafinadas e reidratadas com dimetilbenzeno através de 100%, 95%, 90%, 80% e 70% de etanol. Após três lavagens em PBS (solução salina tamponada com fosfato), os slides foram fervidas em tampão de recuperação de antigénio contendo 0,01 M de citrato de sódio de ácido clorídrico (pH = 6,0) durante 15 min num forno de microondas. Após lavagem com PBS, as secções de tecido foram incubadas com anticorpo primário e, em seguida, as lâminas foram lavadas em solução de peroxidase de têmpera 3% (Invitrogen) para bloquear a peroxidase endógena. As secções foram então incubadas com um anticorpo monoclonal de ratinho contra ARID1A (Abgent anticorpo primário Company, EUA, a uma diluição 1:300) a 4 ° C durante a noite e, em seguida, incubadas com peroxidase de rábano (HRP) (DAKO ChemMateTM EnVisionTM kit de detecção) em quarto temperatura durante 30 min. Após lavagem em PBS, o sinal de visualização foi desenvolvido com 3, solução de 3′-diaminobenzidina (DAB), e todas as lâminas foram contrastadas com hematoxilina. Como controlos negativos, seces adjacentes foram processados tal como descrito acima, excepto que eles foram incubadas durante a noite a 4 ° C em solução de bloqueio, sem o anticorpo primário.
O ARID1A total de imunocoloração pontuação foi calculada como a soma da percentagem de positivamente células de tumor coradas e a intensidade da coloração. Resumidamente, a percentagem de coloração positiva foi pontuada como 0 (0-9%, negativa), 1 (10% -25%, esporádica), 2 (26% -50%, focal) ou 3 (51% -100%, difusa), e a intensidade de 0 (sem coloração), 1 (coloração fraca), 2 (moderada coloração) e 3 (coloração escura). A pontuação total imunocoloração foi calculada com o valor de pontuação por cento positividade × pontuação intensidade de coloração, que variou de 0 a 9. O nível de ARID1A expressão foi definida da seguinte forma: “-” (negativo, a pontuação 0), “+” (fracamente positiva, a pontuação 1-3), “++” (positivo, a pontuação 4-6), “+++” (fortemente positiva, a pontuação 7-9). Com base nos níveis de expressão ARID1A, os pacientes com câncer gástrico foram divididos em dois grupos:. Grupo expressão ARID1A negativo (ARID1A-) eo grupo expressão ARID1A positivo (ARID1A +, ARID1A ++ ou ARID1A +++)
Expression plasmídeo e transitória Transfec�es
Um plasmídeo de expressão pCMV6-Entry eucariótica que contém o comprimento total do ser humano
ARID1A
cDNA foi obtido a partir do Asbio Companhia de Tecnologia (Guangzhou, China). Vector vazio foi utilizado como controlo negativo. MGC803 células foram cultivadas em placas de 6 cavidades até atingirem 85-90% de confluência e, em seguida transfecções transientes foram efectuadas utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Quarenta e oito horas após a transfecção, a expressão do gene foi analisada por análise de transferência de Western. E, em seguida, foram realizadas a proliferação celular ea formação de colônias.
RNA Oligonucleótidos e transfecções celulares
Para knockdown de
ARID1A
expressão, os siRNAs foram sintetizados por GenePharma Company (Xangai, China). As sequências de siRNA foram os seguintes: siRNA-
ARID1A
, sentido: 5’GCCCUAACAUGGCCAAUAUTT3 ‘, antisense: 5’AUAUUGGCCAUGUUAGGGCTT3’. O controle negativo (NC), sentido: 5’UUCUCCGAACGUGUCACGUTT3 ‘, antisense: 5’ACGUGACACGUUCGGAGAATT3’. 400 pmol siRNA-
ARID1A
ou NC foram transfectados em 2 × 10
5 GES1 células utilizando Lipofectamina ARNi reagente MAX (Invitrogen, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante.