Abstract

Fundo

As tirosina-quinases conduzir a proliferação e sobrevivência de muitos cancros humanos. Assim traçar o perfil do estado global de fosforilação de tirosina de um tumor é susceptível de proporcionar uma riqueza de informação que pode ser usada para classificar tumores de prognóstico e previsão. No entanto, a análise abrangente da fosforilação da tirosina de um grande número de amostras de cancro humanos é tecnicamente desafiador usando métodos atuais.

Metodologia /Principais Achados

Foi utilizado um método denominado phosphoproteomic SH2 profiling para caracterizar o mundial estado de fosfotirosina (pTyr) de sinalização em linhas celulares de cancro do pulmão humano. Este método quantifica os locais de ligação fosforilado para os domínios SH2, que são utilizados pelas células para responder a alterações na pTyr durante a sinalização. As células podem ser agrupados com base nos padrões de ligação de SH2, com alguns aglomerados correlacionados com o receptor de EGF (EGFR) ou estado de mutação K-ras. A ligação dos domínios SH2 específicos, o mais proeminente via RAS ativadores Grb2 e SHCA, correlacionada com a mutação EGFR e sensibilidade ao erlotinib inibidor EGFR. padrões de ligação SH2 também refletiu a ativação MET e poderia identificar células impulsionado por vários quinases. As respostas pTyr de células tratadas com inibidores da quinase forneceram evidências de mecanismos distintos de inibição.

Conclusões /Significado

Este estudo ilustra o potencial de domínios proteicos modulares e seus perfis de ligação proteômicas tão poderoso molecular de diagnóstico ferramentas para a classificação do tumor e identificação de biomarcadores

Citation:. Machida K, Eschrich S, Li J, Bai Y, Koomen J, Mayer BJ, et al. (2010) Caracterização de fosforilação de tirosina Sinalização na Lung Cancer Usando SH2 Profiling. PLoS ONE 5 (10): e13470. doi: 10.1371 /journal.pone.0013470

editor: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de maio de 2010; Aceito: 23 de setembro de 2010; Publicação: 19 de outubro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Machida et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O trabalho foi parcialmente financiado por doações do Functional Genomics Centro Nacional (https://nfgc.moffitt.org/nfgc_Site.aspx?spid=E395859332944CBF8AFBDED2CE39B74A) (W81XWH-08-2-0101), os Institutos Nacionais de Saúde (http: //grants.nih.gov/grants/oer.htm) (P50-CA119997, R33-CA107785, e RC1-CA146843) e da mama CT Health Initiative, Inc. (https://ctbhi.org/). Este trabalho foi apoiado em parte por uma concessão do National Institutes of Health (P30CA076292) para o Núcleo de Biologia Molecular e Bioinformática do núcleo As instalações do H. Lee Moffitt Cancer Center Instituto de Pesquisa. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

e receptor tirosina-quinases não receptoras regular muitas actividades importantes para o cancro, incluindo a proliferação celular, sobrevivência, invasão /metástase, e a angiogénese [1]. Estas proteínas de sinalização, portanto, representam uma classe importante de alvos de drogas para o tratamento de cancro, e vários inibidores da tirosina quinase (TKI) estão em desenvolvimento ou estão agora a ser utilizado na prática clínica. O cancro do pulmão é responsável por mais de 160.000 mortes por ano em os EUA [2], para que haja uma lógica poderosa para identificar factores chave de câncer de pulmão que podem ser terapeuticamente exploradas. A actividade do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) é frequentemente elevados em cancro do pulmão, e de inibição de EGFR erlotinib através do inibidor da tirosina quinase pode prolongar a sobrevivência em pacientes com cancro do pulmão avançado refractário à quimioterapia [3]. Além disso a EGFR, um número de outras tirosina-cinases têm sido propostos como alvos terapêuticos no cancro do pulmão, incluindo o TEM, receptores do factor de crescimento tipo insulina (IGFR), SRC-quinases, receptores do factor de crescimento de fibroblastos (FGFR), factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGFR), cinase de linfoma anaplásico (ALK), e EPH receptores [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], [12] .

Uma questão-chave na terapia de TKI para câncer de pulmão é que os doentes irão beneficiar destas drogas, uma vez que o custo é substancial e muitos recebem nenhum benefício do tratamento. Um importante avanço foi a descoberta da activação de mutações somáticas em EGFR que aumentam a sinalização do receptor e para prever a sensibilidade de segmentação TKI EGFR, tais como gefitinib e erlotinib [13], [14], [15]. Em pacientes com cancro do pulmão que albergam estas mutações, as taxas de resposta ao EGFR TKI pode ser elevada e a sobrevivência é melhor do que a observada com agentes citotóxicos [16]. No entanto alguns pacientes sem a mutação do EGFR pode beneficiar de inibidores de EGFR, e marcadores, tais como a amplificação do gene de EGFR, TGFa produção autócrina, ou perfis de expressão de genes têm sido propostos para identificar esses pacientes [17], [18], [19]. Além disso, mecanismos de resistência tais como a amplificação MET ou mutações secundárias no EGFR pode levar rapidamente a resistência aos medicamentos [20], [21], [22]. Finalmente, algumas células tumorais são susceptíveis de ser accionados por várias tirosina-cinases, e métodos para identificar e classificar estes são necessários [23].

estratégias proteômica (que examinam os padrões globais de expressão da proteína ou fosforilação) também estão sendo utilizado para classificar tumores [24]. Espectrometria de massa (MS) juntamente com anticorpos anti-fosfotirosina identificados diferentes padrões de sinalização da tirosina quinase em células cancerosas e tumores do pulmão, e esta abordagem foi capaz de identificar as células impulsionadas pelo EGFR oncogénica, PDGFR, ALK e [4]. Outros estudos utilizando a mesma abordagem encontraram padrões de fosforilação de tirosina associada com a sinalização do EGFR mutante [25], [26]. No geral, este trabalho fornece prova do princípio de que os padrões globais de fosforilação de tirosina pode fornecer informações úteis para a classificação tumor. No entanto, os métodos de MS atuais exigem quantidades relativamente grandes de amostra e quantificação dos locais fosforilada é, assim, novas estratégias phosphoproteomic desafiantes são necessários.

Nós desenvolvemos um método phosphoproteomic alternativa, denominada SH2 perfis, que complementa abordagens baseadas em MS [27], [28]. SH2 profiling é altamente sensível e taxa de transferência é relativamente alto, por isso é ideal para perfilar fosfotirosina (pTyr) de sinalização em células cancerosas. A base conceitual da SH2 profiling é usar o próprio aparelho de resposta de sinal pTyr da célula para interrogar o estado de sinalização pTyr. Após o receptor tirosina-quinase (RTK) de activação, o aumento resultante da fosforilação da tirosina de proteínas gera locais de ligação para os domínios de ligação específica-Ptyr modulares; é a relocalização da efectores intracelulares contendo domínios de ligação a pTyr a estes locais fosforilados que é o passo chave na transmissão do sinal [29]. De longe, o módulo mais abundante de ligação pTyr em seres humanos é a homologia src 2 ou domínio SH2 [30]. Existem 120 domínios SH2 codificadas pelo genoma humano, e cada domínio SH2 liga-se um espectro único de tirosina fosforilada locais [28], [31]. Porque domínios SH2 são o que a célula usa para responder ou “ler” mudanças na fosforilação de tirosina durante a sinalização, a extensão de ligação de diferentes domínios SH2 pode fornecer uma riqueza de informações sobre os mecanismos e status de sinalização pTyr.

para testar se essa abordagem é útil na caracterização e classificação de tipos de tumores complexos, como câncer de pulmão, em que várias tirosina-quinases conduzir sinalização a jusante e manter o crescimento do tumor, foi aplicado SH2 perfil para linhas celulares de cancro do pulmão. Nós achamos que os padrões pTyr poderia estar relacionada com características conhecidas das células, incluindo estado da mutação EGFR e sensibilidade para EGFR TKI. Nossos resultados sugerem que SH2 profiling fornece novos insights sobre a sinalização pTyr que são susceptíveis de serem úteis para a predição e prognóstico de câncer de pulmão.

Resultados

profiling SH2 identifica subconjuntos de linhas celulares de cancro de pulmão

Foi selecionado um grupo de 22 linhas celulares de cancro de pulmão não pequenas células com EGFR conhecido e estado de mutação K-RAS e sensibilidade conhecida ao erlotinib EGFR TKI (Suppl. Tabela S1). A estratégia geral para os nossos estudos é mostrado na Fig. 1. Os lisados ​​celulares foram preparados a partir de células que crescem activamente cultivadas em meio suplementado com soro. Duas abordagens para gerar foram utilizados perfis SH2, array de proteínas de fase inversa e far-transferência de Western [28]. No primeiro método, várias amostras de proteína (lisados ​​celulares) são vistos em matrizes em registo com os poços de um aparelho de câmara de 96 poços. Cada poço é então preenchido com uma solução contendo uma sonda diferente do domínio de GST-SH2, e depois da incubação e lavagem, a sonda ligada é quantificada para cada local. A quantidade de ligação depende do número e da afinidade dos sítios de proteína tirosina fosforilada na amostra. Com esta abordagem, o que chamamos o ensaio de “roseta”, é possível traçar o perfil do nível total de ligação para praticamente todos os domínios SH2 no genoma (94 sondas de domínio SH2 e um domínio PTB representando 90 proteínas distintas), utilizando quantidades mínimas de proteína amostra.

linhas celulares de cancro de pulmão humano (Supl. Tabela S1) foram cultivadas na presença ou ausência de inibidores de tirosina quinase erlotinib ou dasatinib. proteínas celulares foram extraídos e analisados ​​por mancha de roseta e far-Western, utilizando uma matriz de sondas de domínio SH2 (Supl. A Tabela S3). análise bioinformática de dados quantificados foi utilizado para a classificação e biomarcador de triagem.

Para investigar a relação dos diferentes linhas celulares de cancro de pulmão de células, os valores de ligação SH2 quantitativos foram submetidos à análise de agrupamento hierárquico não supervisionado (ver Métodos). Os resultados são apresentados em formato de mapa de calor na Fig. 2A e os dados de imagem em bruto é mostrado na Suppl. FIG. S1. Dados com baixo sinal /fundo foram descartados; dados para os restantes 70 sondas foram mediana-centrada para o agrupamento; vermelho indica mais elevado do que mediana de ligação, verde inferior. Os dados processados ​​podem ser encontrados em Supl. Tabela S2. Os dados também podem ser acessados ​​usando um visualizador baseado na web (https://proteome.moffitt.org/sh2/). Nesta análise, as linhas de células portadores de cluster EGFR mutante em conjunto em três sub-grupos distintos, enquanto dois grandes grupos (de quatro e oito linhas de células) são inteiramente constituídas por linhas com o tipo selvagem (wt) de EGFR. Estes resultados sugerem que SH2 profiling pode identificar subconjuntos de células de câncer de pulmão, e que tais agrupamentos aparecem relacionadas com estado da mutação EGFR.

Dados (A) Rosette agrupados por domínio SH2 e linha de células. Cada linha representa um único domínio SH2 e cada coluna representa uma única linha de células. Características biológicas (mutação do EGFR, mutação K-ras, sensibilidade erlotinib) são mostrados acima no preto e branco. Para a sensibilidade erlotinib, positivo /sensíveis: IC

50 10 nM; intermediário /moderadamente sensível: 10-1000 nM; negativo /insensível: 1000 nM. (b) Dados Far-ocidentais agrupados por bin específica do domínio SH2 e linha de células. Cada linha representa um único bin MW (20 escaninhos /pista) para um domínio SH2 particular e cada coluna representa uma única linha celular.

A segunda abordagem SH2 profiling usa blotting far-Ocidental para obter mais detalhada informações sobre a abundância relativa e peso molecular aparente (MW) de fosfoproteínas que se ligam diferentes sondas de domínio SH2. As amostras de proteínas são separadas com base no tamanho por electroforese em gel e transferidos para membranas, que são então sondadas com domínios SH2 rotulados. proteínas de ligação SH2 são revelados como bandas, ea aparente MW dessas bandas pode fornecer pistas para a sua identidade. Nós desenvolvemos ferramentas de software que permitem a ligação de dados SH2 de borrões far-ocidentais para ser quantificados em “caixas” por MW aparente, por exemplo, 20 caixas por pista. Os dados a partir de cada reservatório (correspondente a uma gama de fosfoproteínas MW particular, que se ligam à sonda SH2) pode então ser usado como a base para a classificação das amostras. Assim, em vez de um único valor para cada amostra e domínio SH2, como no ensaio de roseta, quantitativa blotting far-ocidental fornece pelo menos 20 pontos de dados diferentes, aumentando consideravelmente a potencial discriminação entre as amostras.

borrões Far-ocidentais cancro do pulmão de linhas celulares foram sondados com 36 domínios SH2 ou PTB, bem como anticorpos anti-pTyr. dados de imagem em bruto pode ser encontrado em Suppl. Filme S1, e os dados quantitativos em Suppl. Tabela S2. Quando os resultados quantitativos foram submetidos à agrupamento hierárquico, as amostras agrupados em 3 classes distintas, além de dois valores extremos (Fig. 2B). Um destes (grupo 3) consiste inteiramente de células com EGFR wt e é altamente enriquecida para células com mutações de activação K-RAS. Em contraste, os conjuntos 1 e 2 são enriquecidas para as células com mutações de EGFR; dentro de cada um desses grupos, as células com EGFR em peso e mutante são segregados. Assim quantitativa blotting far-Oeste aparece para fornecer informações adicionais sobre o estado sinalização da tirosina quinase que pode ser usado para classificar funcionalmente as células com base no status de ativação RTK. Em geral, os resultados de agrupamento dos ensaios roseta e far-ocidentais são semelhantes, mas não idênticas, como discutido abaixo.

A ligação de um conjunto de domínios SH2 é reforçada em células que abrigam mutações ativadoras do EGFR

próximo perguntou se a ligação de quaisquer sondas de domínio SH2 individuais foi altamente associado com mutações ativadoras do EGFR. A partir de experiências de ligação roseta identificamos 7 sondas cuja ligação foi correlacionada de forma estatisticamente significativa com estado da mutação EGFR:. Grb2, SHCA (PTB), Grap2, Brk, Txk, CblB e cblA (Fig. 3A) (ver Suppl Tabela S3 para nomes de domínio SH2 e proteínas correspondentes). Nós entrada destes domínios em PPI Aranha, uma ferramenta para a interpretação de dados de proteômica no contexto das redes conhecidas de interação proteína-proteína. Esta análise mostrou que cinco destes proteínas (SHCA, Grb2, cblA, CblB, e BRK) têm sido relatados para se ligar directamente a EGFR, enquanto Grap2 é potencialmente ligados ao EGFR através SHCA (Fig. 3B). O facto de que os locais de Grb2 e SHCA (ea estreita Grb2 Grap2 relativa) de ligação estão intimamente associados com mutação do EGFR é particularmente intrigante, como o aumento da ligação destes domínios SH2 seria fortemente previsto para levar à activação da via de sinalização RAS via recrutamento de o RAS ativador Sos [32], [33]

domínios SH2

(a) cuja ligação é significativamente correlacionada com a mutação EGFR (q 0,1).. Barra de trama de sinal de SH2 para linhas celulares de EGFR mutante do tipo selvagem e é mostrado como média com barras de erro padrão. “Domínio SH2” é usado nas figuras para todas as sondas, incluindo domínios PTB e anticorpo anti-pTyr. (B) mapa de interação proteína-proteína para EGFR (círculo cinza) e as proteínas com domínios SH2 cuja ligação é significativamente correlacionada com a mutação EGFR (círculos brancos). Linhas indicam relatado interacções de ligação directas. bandas específicas de domínio Far-ocidentais (C) significativamente correlacionada com a mutação EGFR. Caixas coloridas indicam os resultados de significância estatística em um teste de Mann-Whitney para as diferenças (P 0,1) entre as linhas de células 22 mostrado na Figura 2B. A seta indica escaninho correspondendo a membros da família de EGFR. Os números adjacentes para lixeiras indicam MW aparente, por exemplo, “291,0” = MW entre 256-291 kDa.

Uma análise similar foi realizada utilizando os dados de blotting far-ocidental. Descobrimos que uma série de bandas específicas em borrões far-ocidentais correlacionados significativamente com a mutação EGFR (Fig. 3C). Aqui é interessante considerar bandas cuja ligação tende a aumentar em células mutantes de EGFR (vermelho) versus aqueles cuja ligação tende a diminuir em células mutantes de EGFR (verde). Notamos que para sondas previsto (com base na actividade de sinalização conhecido) para ser associada com a estimulação da via de Ras (Grb2 e Shc), aumentou a ligação na gama de peso molecular contendo membros da família EGFR fosforilados (MW194, seta) é observado para As células mutantes de EGFR. Isto provavelmente reflecte uma maior ligação destes efectores para EGFR anormalmente activado, em comparação com o receptor em peso. Isto também é verdade para os domínios SH2 dos outros efetores positivos conhecidos de sinalização de EGFR, incluindo Vav2, PI 3-quinase (PI3K; P85B)., E PLCy Plcg1)

Em contraste com a mutação EGFR, encontramos nenhum indivíduo domínios SH2 cuja ligação fortemente correlacionada com o estado de mutação RAS por roseta ou blotting far-ocidental. Apesar disso, observou-se uma aparente correlação interessante entre o agrupamento com base em perfis SH2 globais e estado de mutação K-RAS. Isto é particularmente claro no caso da extrema-transferência de Western (Fig. 2B), onde dois grupos principais consistem inteiramente de células com peso K-RAS, enquanto que uma terceira grande cluster (grupo 3) é composto quase inteiramente de células com EGFR em peso, mas mutante K-RAS. Nós foram confundidos inicialmente pelo aparecimento de H1299 em conjunto # 3, tal como K-ras é p nestas células. No entanto, uma análise mais aprofundada de dados de sequências revelou que o K-RAS em relação N-RAS está mutado em H1299 (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/), mas não em qualquer uma das outras células linhas utilizadas neste estudo. Assim, uma previsão com base em SH2 perfis, que H1299 células são prováveis ​​abrigar RAS ativados, foi confirmado, validando fortemente a relevância biológica desta abordagem. Este grupo de mutantes RAS (6 de 6 linhas de células que abrigam a mutação RAS) é altamente improvável que tenha ocorrido por acaso (p = 0,001, teste de permutação, n = 100.000). Estes resultados indicam que o padrão de fosforilação de tirosina pode células com base no estado de mutação RAS sub-classificar. A falta de correlação entre as sondas domínio SH2 indivíduo e ras (em oposição a correlação com base no perfil global de fosforilação de tirosina) podem reflectir o facto de as funções RAS jusante de tirosina-quinases. Estamos actualmente a testar o modelo que a atividade Ras constitutiva leva à ativação de vias de feedback que, grosso modo regulam negativamente a sinalização da tirosina quinase.

Um conjunto de sondas SH2 está correlacionada com a sensibilidade das células de câncer de pulmão para EGFR TKI

a seguir, determinado se o domínio SH2 ligação correlacionada com a sensibilidade de linhas de células de cancro de pulmão de erlotinib, um inibidor de molécula pequena de cinase de EGFR. Tais domínios podem servir como base para biomarcadores preditivos para identificar tumores probabilidade de responder à terapia TKI. SH2 de dados de perfis foram examinados quanto possível correlação com o CI

50 por erlotinib para cada linha celular (IC

50 foi ensaiado para este estudo sob as mesmas condições de cultura utilizados para perfis SH2). Verificou-se que a ligação de 13 a 12 sondas correspondentes proteínas correlacionadas de uma forma estatisticamente significativa com erlotinib IC

50 (Fig. 4A). Estes incluem Grb2 (mostrado na Fig. 4B), SHCA, SHCA (PTB), p85B, Cis1, Arg, Eat2, Plcg1, Ptk70 /MRE, Fes, Lnk, Tem6, e a Btk. análise de rede confirma relatos de interação direta entre EGFR e Grb2, SHCA, p85B, Cis1, Arg, Plcg1, Fes, e Btk (Fig. 4C). Em geral, os resultados são consistentes com um modelo em que a sensibilidade erlotinib está associada com a sinalização particularmente forte de EGFR activados para efectores a jusante do núcleo conhecidos, incluindo a vias de MAPK (Grb2 e SHCA), PI3K /Akt (p85B), e PLCy (PLCg1).

sinal de domínio SH2 em células não tratadas foi comparado com ln IC

50 para erlotinib. (a) Domínios significativamente correlacionada com ln IC

50. correlações negativas indicam ligação maior SH2 em células mais sensíveis (inferior IC

50) ao erlotinib. (B) Gráfico de dispersão dos Grb2 SH2 domínio de ligação contra o ln (IC

50) para erlotinib. (C) mapa de interação proteína-proteína para EGFR e as proteínas com domínios SH2 cuja ligação é significativamente correlacionada com a sensibilidade erlotinib. Linhas indicam relatado interacções de ligação directas. (D) Heatmap representando correlação de cada bin de domínio específico para a sensibilidade erlotinib. A correlação de Pearson foi calculado para cada bin de domínio específico por 22 linhas de células eo ln (IC

50) para a linha celular correspondente. Cada local heatmap representa coeficiente de correlação para que bin; verde indica o aumento de sinal SH2 com a diminuição da CI

50 valores (maior sensibilidade); vermelho indica um aumento de sinal SH2 com o aumento da IC

50 valores (ver barra de cores). A seta indica escaninho MW contendo proteínas da família de EGFR. (E) Lista das caixas 46 específicas de domínio com