Abstract

Cancro células-tronco-like (CSCs) /células-initiaiting câncer (CICs) são definidos como uma pequena população das células cancerosas que têm capacidade de auto-renovação, potencial de diferenciação e alta capacidade de iniciação tumor. CSCs /CICs de câncer de ovário foram isolados pela população lado análise (SP), ensaio ALDEFLUOR e utilização de marcadores de superfície celular. No entanto, estas abordagens não são marcadores definitivos para CSCs /CICs, e é necessário para refinar os métodos recentes para identificar mais puras CSCs /CICS. Neste estudo, foram analisados ​​células SP e aldeído células brilhante dehydrogenese (ALDH

Br) a partir de células de cancro do ovário. Ambas as células SP e ALDH

Br células apresentaram maior capacidade e maior nível de um marcador de células-tronco expressão de iniciação do tumor,

sexo região determinante Y-box 2 (SOX2)

, do que aqueles da população principal (MP células) e ALDH

células baixos, respectivamente. Analisamos um SP e ALDH

Br sobreposição população (SP /ALDH

Br), eo SP /população ALDH

Br apresentaram maior capacidade de iniciação do tumor do que a de células SP ou

células Br ALDH , permitindo o início do tumor com apenas 10

2 células. Além disso, SP /ADLH

população Br apresentou maior capacidade de formação de esfera, resistência à cisplatina, a capacidade de diferenciação dos adipócitos e expressão de

SOX2

do que os de SP /ALDH

Baixo, MP /ALDH

Br e MP /ALDH

células baixos. Gene knockdown de SOX2 suprimiu o tumor-iniciação de células de cancro do ovário. Um SP /ALDH população

Br foi detectado em várias células de câncer ginecológico com razões de 0,1% para células de adenocarcinoma HEC-1 endometrióides a 1% para células de adenocarcinoma mucinoso ovário MCAS. Tomados em conjunto, o uso da SP e ALDH população sobreposição

Br é uma abordagem promissora para isolar altamente purificados CSCs /CICs e SOX2 pode ser um novo marcador funcional para CSCs ovarianos /CICs

Citation:. Yasuda K , Torigoe t, Morita R, Kuroda T, Takahashi A, Matsuzaki J, et al. (2013) ovarianos células-tronco cancerosas são enriquecidas em Side População e aldeído desidrogenase brilhante sobreposição População. PLoS ONE 8 (8): e68187. doi: 10.1371 /journal.pone.0068187

editor: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de dezembro de 2012; Aceito: 28 de maio de 2013; Publicação: 13 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Yasuda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas-in-Aid para a Investigação científica do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (conceder nos. 16209013, 17016061 e 15659097) de investigação Aplicação prática da Agência de Ciência e Tecnologia do Japão, e para Cancer Research (15-17 e 19-14) do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-estar do Japão, Cancer Research Fund Ono (a NS) e Takeda Science Foundation (para YH). Este trabalho foi financiado em parte pelo Fundo de Investigação e Desenvolvimento Cancer Center Nacional (23-A-44). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Cancro de células estaminais-like (CSCs) /células iniciadoras de câncer (CICs) são definidos como pequena população de células cancerosas que têm as propriedades de alta tumor iniciando habilidade, capacidade de auto-renovação e capacidade de diferenciação [1] – [3]. Além disso, CSCs /AIC são mostradas para ser resistente a terapias de cancro convencionais incluindo quimioterapia e radioterapia; portanto, CSCs /CICs são responsáveis ​​pela reincidência do câncer após o tratamento [4], [5]. Várias abordagens têm sido descritos para identificar os CSCs /AIC, incluindo o isolamento de expressão do marcador de superfície celular CSC /CIC específica-(por exemplo, CD44, CD133, CD166), detecção da população lateral (SP) fenótipo celular por Hoechst 33342 exclusão e detecção de aldeído desidrogenase 1 atividade (ALDH1) no ensaio ALDEFLUOR [6]. No entanto, a expressão de marcadores de superfície celular, as células SP e a expressão de ALDH1 não está relacionado com a capacidade de iniciação do tumor em alguns relatórios [7] – [9]. Estas observações sugerem, assim, que estes marcadores de células-tronco (marcadores da superfície da célula, células SP e ALDH1) não são funcionais e não é necessário para a manutenção da CSCs /CICs. Estes marcadores podem não definir altos tumorigênicos CSCs /CICs, e estes marcadores são, portanto, apenas os marcadores substitutos para CSCs /CICS. Portanto, funcional marcador não-substituto, que é essencial para a manutenção da CSCs /CICs é esperado.

O câncer de ovário é uma das principais doenças malignas e provoca a morte de mais de um milhão de pessoas no mundo a cada ano [10 ]. Além disso, a maioria dos pacientes têm episódios miseráveis ​​de ascite, especialmente em estágios avançados. Para melhorar o tratamento clínico de câncer de ovário, a pesquisa de células-tronco do câncer de ovário surgiu como um tópico recente. marcador da superfície celular CD44, células SP e ALDH

células Br foram relatados como marcadores de células-tronco para doenças malignas ginecológicas, utilizando linhas celulares OVCAR3, HEC-1 e outras linhas e amostras primazia [11] – [14], e CSC /CIC pesquisa pode melhorar os resultados dos pacientes com câncer de ovário avançado.

para melhorar os métodos para isolamento de altamente purificados ovarianos CSCs /CICs, analisamos a combinação de ovário marcadores CSC /CIC conhecidos. Foram analisadas linhas celulares de cancro do ovário da análise SP e ensaio ALDEFLUOR e descobriram que as células SP e ALDH

células Br foram maiores tumorigénico do que aqueles da população principal (MP) células e ALDH

células Baixos, respectivamente. Descobrimos que a população sobreposição de células SP e células ALDH

Br (SP /ALDH

Br) foram mais altamente tumorigénico. E descobrimos que

SOX2

foi expressa num SP /população ALDH

Br de nível superior, e silenciamento de genes de

SOX2

revogou o tumor-iniciação de células de cancro do ovário. Portanto, SOX2 pode ser um novo marcador funcional para CSCs ovarianos /CICs e SP /ALDH

população Br é a população mais adequado para análise das CSCs ovarianos /CICs do que as células SP ou células ALDH

Br.

Materiais e Métodos

h3> Declaração

os ratos foram mantidos e experiências com de acordo com as diretrizes do e após aprovação pela Comissão de Sapporo Medical University School of Medicine, Experimentação animal Center sob o número de autorização 08-006. Qualquer animal encontrado pouco saudável ou doente foram prontamente sacrificados. estudo de coloração imuno-histoquímica foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) do Hospital Universitário Sapporo Medical. Obtivemos consentimento informado por escrito de todos os pacientes de acordo com as diretrizes da Declaração de Helsinki.

As linhas celulares e cultura

linhas de células de ovário Humanos (MCAS, HTBoA, OVCAR3, OVSAHO) e endometrial humana células de carcinoma (HEC-1) foram obtidas de ATCC (Manassas, VA, EUA). MCAS e células HEC-1 foram mantidas em Meio Essencial Mínimo (MEM) (Life Technologies, Grand Island, NY, EUA). HTBoA células OVCAR3 e foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EUA). OVSAHO células foram mantidas em meio RPMI1640 (Sigma-Aldrich). Cada linha celular foi suplementado com FBS a 10% e cultivadas numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 incubadora a 37 ° C.

população lateral (SP) ensaio

população lateral (SP) a análise foi realizada como descrito anteriormente com algumas modificações [15], [16]. Hoechst 33342 (Lonza, Walkersville, MD, EUA) corante foi usada na concentração de 2,5 ou 5,0 ug /mL na presença ou ausência de verapamil (50 mM; Sigma-Aldrich) como um inibidor do transportador ABC. As células foram incubadas a 37 ° C durante 60 min ou 90 min, com agitação contínua. Um milhão de células marcadas foram analisadas por FACS Aria II (BD Biosciences, San Jose, CA, EUA). A Hoechst 33342 dye estava animado em 357 nm e sua fluorescência foi analisada utilizando comprimentos de onda dupla (azul, 402-446 nm; vermelho, 650-670 nm).

ensaio ALDEFLUOR

aldeído actividade de desidrogenase (ALDH) foi detectada utilizando um kit de ensaio de ALDEFLUOR (StemCell Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante [17]. As células foram coradas pela BODIPY-aminoacetaldeído (BAAA) a 1,5 mM e incubado durante 30 min a 37 ° C. Um inibidor de ALDH1, dietilamino benzaldeído (DEAB), em excesso molar A10 vezes foi usada como um controlo negativo. Um milhão de células marcadas foram analisadas por FACS Aria II. As células que expressam ALDH1 brilhantemente fluorescentes (ALDH1

Br) foram detectados no canal de fluorescência verde (520-540 nm).

SP e ALDEFLUOR dupla coloração

As células foram marcadas por Hoechst 33342 e corante, em seguida, coradas por BAAA. Um milhão de células SP e ALDEFLUOR-dupla-coradas foram analisadas por FACS Aria II. As células foram divididas em três grupos de acordo com a intensidade de ALDH (ALDH

Br (ALDH brilhante), ALDH

Mid (média ALDH), ALDH

Baixa (ALDH baixo)), em seguida, analisados ​​pelo ensaio SP.

imunohistoquímicos coloração

coloração imuno-histoquímica utilizando secções embebidas em parafina e fixado em formalina e tecido de carcinoma de ovário cirurgicamente ressecado foi realizada como descrito anteriormente [18]. anticorpo de rato anti-ALDH1 foi utilizado a uma diluição de 250 vezes. Anti-ABCG2 anticorpo policlonal de coelho (Sigma-Aldrich) foi usado a 5 ug /ml. de cabra marcado com peroxidase de anticorpo policlonal anti-coelho (Nichirei, Tóquio, Japão) foi utilizado como o protocolo do fabricante e visualizados por DAB. Alcalina anticorpo policlonal anti-murganho de cabra marcado com fosfatase (Nichirei) foi utilizado como o protocolo do fabricante e visualizados por Nova Fucsina (Nichirei). coloração marrom membrana foi julgado como coloração positiva para ABCG2 e coloração vermelha citoplasma foi julgado como coloração positiva para ALDH1.

transplante de xenoenxerto

As células seleccionadas foram recolhidas e novamente suspensas em concentrações de 10

2-10

4 células por 50 ul de PBS e, em seguida, misturado com 50 ul de Matrigel (BD Biosciences). A mistura de células-matrigel foi injectado no espaço subcutâneo de /-deficiência imunitária grave diabéticos não obesos combinada (SCID NOD /) ratinhos de 6 semanas de idade (NOD.CB17-Prdkcscid /J, Charles River Laboratory, Yokohama, Japão) sob anestesia. O crescimento do tumor foi monitorado semanalmente, e o volume do tumor foi calculado pela XY

2/2 (X = eixo longo, Y = eixo curto).

Sphere formação de ensaio

ensaio de formação de colónia Spherical foi realizada utilizando CSC completa Recombinan Médio (Cell Systems Corporation, Kirkland, WA, EUA). SP /ALDH

Br, SP /ALDH

Baixo, MP /ALDH

Br e MP /ALDH

células baixos foram colocadas em placas a 10

3 células por poço em 6 poços ultra-baixo placas de fixação (Corning Inc., Corning, NY, 14831) e cultivadas durante 10 dias. A morfologia das células foi avaliada e as fotografias foram tiradas com um microscópio de luz a cada dia. grupos de células redondas maior do que 100 mm foram julgados como esferas.

A viabilidade celular ensaio

Para o ensaio de viabilidade celular, SP /ALDH

Br, SP /ALDH

Baixo, MP /ALDH

Br e MP /ALDH

células baixos foram isolados. Em seguida, as células foram plaqueadas a 1000 células por placa de 96 poços durante 1 dia e depois foram tratados com cisplatina durante 3 dias sob várias concentrações. Subsequentemente, a viabilidade celular foi investigada usando a pré-mistura de WST-1 Proliferação de Células Ensaio Sistema (Takara Bio Inc., Otsu, Japão) de acordo com o protocolo do fabricante.

adipócito diferenciação ensaio

Para adipócito ensaio de diferenciação, SP /ALDH

Br, SP /ALDH

, MP /ALDH

Br e MP /ALDH

células Baixa Baixa foram isolados. As células foram plaqueadas a 10000 células por placa de 24 poços e foram crescidas em soro reduzido RPMI:DMEM (01:01) contendo 0,5 mM de ácido trans-retinóico (Sigma-Aldrich) e 50 nM de insulina (Sigma-Aldrich) durante 2 dias, seguido pela adição do meio de diferenciação adiposo contendo 170 nM de insulina, 2 nM de triiodotironina e rosiglitazona 0,5 mM [19]. As células foram mantidas no meio durante 5 dias e a acumulação de lípido neutro foi detectada em 4% de formaldeído células fixadas utilizando vermelho óleo O (Sigma-Aldrich) coloração. coloração de lipídios foi observada usando microscópio, e as células lipídicas manchado foram contados.

SOX2

mRNA knockdown por siRNA

A

SOX2

gene experimento knockdown foi realizada usando pequena interferência RNA (siRNA). SOX2 siRNA (NM003106) e ARNsi de controlo negativo foram adquiridos de Life Technologies. MCAS células foram semeadas numa placa de 24 poços, e as transfecções foram efectuadas utilizando Lipofectamina ARNi max (Life Technologies) em Opti-MEM de acordo com as instruções do fabricante. Quarenta e oito horas mais tarde, as células foram analisadas para a expressão de

SOX2

,

ALDH1A1

e

ABCG2

por RT-PCR.

Inverter polimerase transcrição reacção em cadeia (RT-PCR), análise

silenciamento de genes de SOX2 foi confirmada por RT-PCR. Isolamento de ARN e análise de RT-PCR foram realizados como descrito anteriormente [20]. As condições dos ciclos térmicos foram de 94 ° C durante 2 min, seguido de 35 ciclos de 15 seg a 94 ° C, 30 seg a 60 ° C, e 30 seg a 72 ° C. Os pares de iniciadores utilizados para a análise de RT-PCR foram 5′-TGTTAGCTGATGCCGACTTG-3 ‘e 5′-TTCTTAGCCCGCTCAACACT-3’ para

ALDH1A1

com um tamanho de produto de PCR previsto de 154 pares de bases (pb), 5′-CACCTTATTGGCCTCAGGAA -3 ‘e 5’CCTGCTTGGAAGGCTCTATG-3’ para

ABCG2

com um tamanho esperado produto de PCR de 206 bps, 5′-CATGATGGAGACGGAGCTGA-3 ‘e 5′-ACCCCGCTCGCCATGCTATT-3’ para

SOX2

com um tamanho de produto de PCR previsto de 410 pb, 5 ‘-di-GCAGTCAACAGTCGAAGAAGG-3′ e 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘e 5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’ para

da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH)

com um tamanho do produto esperado de 452 bps.

GAPDH foi usada como um controlo interno.

análise de PCR quantitativo em tempo real (qPCR)

quantitativa PCR em tempo real foi realizada utilizando o ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com o protocolo do fabricante.

SOX2

(Hs01053049_s1),

ABCG2

(Hs00184979_m1),

CD44

(Hs01075861_m1),

PROM1

(Hs01009250_m1) e

ABCB1

(Hs00184500_m1) primers e sondas foram concebidos pelo fabricante (ensaios de expressão gênica TaqMan; Applied Biosystems). ciclagem térmica foi realizada utilizando 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos seguido por 60 ° C durante 1 min. Cada experimento foi realizado em triplicado, e normalizada para a

GAPDH

gene como um controlo interno.

Resultados

CSCs /CICs foram enriquecidos em células SP

CSCs ovarianos /CICs foram isolados como células SP a partir de células da linha de cancro do ovário ratos humanos e [11], [21]. Foram analisadas várias linhas celulares caner ginecológicos incluindo linhas humanos ovarianos celulares (MCAS, HTBoA, OVCAR3, OVSAHO) e linha de células de carcinoma endometrial humana (HEC-1) (Figura 1A e Figura S1). células SP pode ser detectado em todas as células da linha de células e a proporção SP foram variou de 1,2% a 2,6%. Como não há relatório descrevendo mucinoso celular linha de adenocarcinoma humano MCAS, que assim ainda analisada células SP derivados do MCAS. CSCs /CICs têm capacidade alta de iniciação tumor [22], que assim injetados números diluídas em série de células SP e células MP para as costas dos três NOD /SCID subcutaneamente para examinar a capacidade de iniciação tumor. Em todos os três ratinhos, os tumores foram iniciados com 10

4 SP células, e tumores foram iniciados com 10

4 células MP em 2 dos 3 ratinhos. Em um rato, um tumor foi iniciado com 10

3 SP células, enquanto 10

3 células MP não iniciou qualquer tumor (Tabela 1). O tamanho dos tumores derivados de células de SP foi significativamente maior do que o de tumores derivados de células MP (Figura 1B). Os níveis de marcadores de células estaminais de expressão foram investigados por qPCR, e células SP derivadas de células MCAS expressaram níveis mais elevados de a haste marcadores de células

SOX2

,

CD44

e

PROM1

eo gene transportador ABC

ABCG2

, enquanto que

ABCB1

não era (Figura 1C). Estes resultados indicam que CSCs /AIC foram enriquecidas em células derivadas de células SP MCAS. Os resultados foram reproduzidos em pelo menos três experiências independentes.

. A detecção de células de SP de células MCAS. MCAS células de adenocarcinoma mucinoso ovarianos foram corados com Hoechst 33342 dye e analisados. A percentagem representa a proporção de células de SP. B. iniciação do tumor de células derivadas de células SP MCAS. 10

3 e 10

4 e SP células derivadas de células MP MCAS foram inoculados subcutaneamente no dorso de ratinhos NOD /SCID, e o crescimento do tumor foi medido semanalmente. Os dados representam médias ± DP. As diferenças entre SP e células MP foram examinados para significância estatística usando o teste t de Student. * Os valores de P. C. qPCR de marcadores CSC /CIC em células MCAS SP e MP. Os dados representam médias ± DP. Os asteriscos indicam diferença significativa. * P 0,05. t-teste.

CSCs /CICs foram enriquecidos em ALDH

células Br

CSCs /CICs poderia ser isolados como ALDH

células Br pela ALDEFLUOR ensaio [23]. Nós, portanto, examinar se CSCs /CICs pode ser isolado com sucesso pelo ensaio ALDEFLUOR. MCAS, HTBoA, OVCAR3, OVSAHO e células HEC-1 foram analisadas pelo ensaio de ALDEFLUOR e verificou-se que a proporção de ALDH

Br células foi de 8,1% para 11,3% (Figura 2A e Figura S1). ALDH

células Br e ALDH

células de baixa derivados de MCAS foram ordenados e injetado nas costas dos cinco NOD /SCID para examinar a capacidade de iniciação tumor. Em todos os cinco ratos, os tumores foram iniciados com 10

4 ALDH

células BR, enquanto os tumores foram iniciados com 10

4 ALDH

células de baixa em apenas 2 dos 5 ratos (Tabela 1). O tamanho dos tumores derivados de ALDH

Br células foi significativamente maior do que o de tumores derivados de ALDH

células de baixo (Figura 2B). Os níveis de marcadores de células-tronco de expressão foram investigados por qPCR. células ALDH

br derivadas de células MCAS expressaram níveis mais elevados de a haste marcadores de células

SOX2

,

CD44 Comprar e

PROM1

, ALDH1A1, e que o transportador ABC gene

ABCG2

e

ABCB1

(Figura 1C). Estes resultados indicam que CSCs /AIC também foram enriquecidas em ALDH

l de células derivadas de células MCAS. Os resultados foram reproduzidos em pelo menos três experiências independentes.

. Detecção de células ALDH

Br de células MCAS. MCAS células de adenocarcinoma mucinoso ovarianos foram coradas com BAAA e analisados. A percentagem representa a proporção de ALDH

células Br. Inibidor indicam inibidor ALDH1 (dietilamino benzaldeído (DEAB)). B. iniciação do tumor de ALDH

células Br derivadas de células MCAS. 10

4 ALDH

Br e ALDH

células de baixa derivadas de células MCAS foram inoculados subcutaneamente nas costas de NOD /SCID, e o crescimento do tumor foi medido semanalmente. Os dados representam médias ± DP. As diferenças entre ALDH

Br e ALDH

células baixos foram examinados para significância estatística usando o teste t de Student. * Os valores de P. C. qPCR de marcadores CSC /CIC em células MCAS SP e MP. Os dados representam médias ± DP. Os asteriscos indicam diferença significativa. * P 0,05. t-teste.

SP e ALDEFLUOR análise dupla

células SP e ALDH

células Br mostram maior efluxo de Hoechst 33342 dye e maior nível de dehydrogenese aldeído expressão, que são diferentes fenótipos e células-tronco hematopoiéticas foram isolados como um SP e da população ALDH

Br em um estudo anterior [24]. Por isso, investigou a população sobreposição de células SP e células ALDH

Br. Após a coloração as células MCAS com corante Hoechst 33342, as células foram lavadas e em seguida coradas com reagente ALDEFLUOR e analisados. Nesta experiência, a proporção de células de SP, foi de 5,3% e o rácio de ALDH

Br células foi de 14,4%. 7,1% da ALDH

células Br mostrou população SP, e 6,9% de ALDH

Mid células mostraram população SP, e apenas 3,7% da ALDH

células Low mostrou população SP (Figura 3A). células ALDH

br exibiu sobreposição parcial, e apenas 1,0% do total de células (7,1% da população 14,4%) expressa tanto SP fenótipo celular e ALDH

Br fenótipo (Figura 3A).

A. Resumo de SP e ALDEFLUOR ensaio duplo. MCAS células foram coradas pelo corante Hoechst 33342 e depois coradas por BAAA e analisados. As células foram divididas em três grupos de acordo com a intensidade de ALDH (ALDH

Br (ALDH brilhante), ALDH

Mid (média ALDH), ALDH

Baixa (ALDH baixo)), em seguida, analisados ​​pelo ensaio SP. A proporção de ALDH

células Br foi de 14,4%, ea proporção de células SP foi de 5,3%. As proporções de células SP em ALDH

células BR, ALDH

células de idade e ALDH

células baixos foram de 7,1%, 6,9% e 3,7%, respectivamente. A relação de SP /células ALDH

Br em células totais foi de 1,0%. B. iniciação do tumor de SP /ALDH

BR, SP e ALDH células

Br. 10

2 e 10

3 SP /ALDH

Br, SP e ALDH

células Br derivadas de células MCAS foram inoculados subcutaneamente nas costas de NOD /SCID, e o crescimento do tumor foi medido semanalmente. Os dados representam médias ± DP. As diferenças entre SP /ALDH

Br e células SP ou células ALDH

Br foram examinados para significância estatística usando o teste t de Student. * Os valores de P. Punhais indicam ratos morte devido a tumor. coloração imuno-histoquímica de C. ABCG2 e ALDH1. tecido de carcinoma do ovário foi corada pelo anticorpo anti-ABCG2 e anticorpo anti-ALDH1. coloração da membrana Brown indica ABCG2 e coloração rosa citoplasma indica ALDH1. Asterisco indica embarcação, e setas indicam ABCG2 e células de carcinoma de ovário double-positivos ALDH1. Ampliação, × 400.

SP e ALDH

células br têm alta capacidade de iniciação tumor

A capacidade de SP e ALDH

Br-iniciando tumor (SP /células ALDH

Br) foi examinado pela injeção de 10

3 e 10

2 células, respectivamente, em NOD /SCID. Surpreendentemente, os tumores foram iniciados com 10

células 3 SP /ALDH Br e com tão poucos como 10

2 SP /células ALDH

Br em todos os ratos (Tabela 1). Além disso, tumores derivados de SP /ALDH

células Br apresentou crescimento significativamente mais rápido do que a de tumores derivados de células SP e células ALDH

Br (Figura 3B). Estes resultados indicam que

células Br SP /ALDH são extremamente enriquecida com CICS /CSCs.

Foi realizada coloração imuno-histoquímica para detectar SP /população ALDH

Br em tecido de carcinoma de ovário humano primário. Utilizou-se anticorpo anti-ABCG2 para detectar células de SP, uma vez que as células SP são conhecidos por expressar um nível mais elevado de ABCG2. Como mostrado na Figura 3C, as células cancerosas do ovário positivas (ABCG2-positivos e ALDH1-positivo) dupla eram detectáveis ​​no tecido de carcinoma de ovário. Curiosamente, existem algumas células de dupla positiva próxima aos navios, pode estar indicando CSCs ovarianos /CICs existe no nicho vascular. células SP /ALDH

Br foram detectados também a partir de outras células do ovário serosas linha de adenocarcinoma (OVSAHO, OVCAR3 e HTBoA) e uma linha de células do endométrio (HEC-1), e as proporções de SP /ALDH

células Br foram 0,1 % para 0,8% (figura S1).

SP /ALDH

Br células têm-tronco fenótipos celulares

o SP /ALDH população

Br foi comparado com outras populações pela esfera formando ensaio. SP /ALDH

Br, SP /ALDH

Baixo, MP /ALDH

Br e MP /ALDH

células baixos foram isolados a partir de células do MCAS e cultivadas em uma condição ultra-low anexo para a esfera formando ensaio. células SP /ALDH

br exibiu maior eficiência formação esfera do que a de MP /ALDH

células Br e MP /ALDH

células baixos (Figura 4A). A diferença entre SP /ALDH

células BR e SP /ALDH

células de baixa não foi significativa; No entanto, as células SP /ALDH

br tendem a ter maior eficiência formação esfera do que a SP /ALDH

células baixos.

A. ensaio de formação de esfera. O número de colónias de quatro frações (SP /ALDH

Br, SP /ALDH

Baixo, MP /ALDH

Br e MP /ALDH

Menor) foram avaliados no dia 7. Os dados representam significa ± SD. As diferenças foram examinadas para significância estatística usando o teste t de Student. * Os valores de P. Imagens representativas de esferas são mostrados (100 ×). B. adipócito ensaio de diferenciação. As células foram cultivadas sob existência de ácido trans-retinóico, seguido por meio de diferenciação de adipócito. adipócitos Oli Vermelho O-positivas foram contadas. Os dados representam médias ± DP. As diferenças foram examinadas para significância estatística usando o teste t de Student. * Os valores de P. Imagens representativas de Oil Red O-coloração são mostrados (200 ×). Red-coloração indicam diferenciação dos adipócitos.

CSCs /CICs foram descritos ter pluripotência [25], foram analisados, assim, a capacidade de diferenciação dos adipócitos SP /ALDH

células Br (Figura 4B). SP Isolated /ALDH

Br, SP /ALDH

Baixo, MPALDH

Br e MP /ALDH

Baixa população foram cultivadas em uma condição de diferenciação adypocyte.

células Br SP /ALDH derivadas de células MCAS revelaram maior capacidade de diferenciação dos adipócitos em comparação com o SP /ALDH

Baixo, MP /ALDH

Br e MP /ALDH

células de baixa derivadas de células MCAS.

CSCs /CICs são resistentes à quimioterapia [4], foram analisados, assim, a resistência aos medicamentos de SP /ALDH

células Br. Desde cisplatina é um medicamento chave para a quimioterapia carcinoma de ovário, foi utilizado cisplatina. SP Isolated /ALDH

Br, SP /ALDH

Baixo, MPALDH

Br e MP /ALDH

Baixa população foram cultivadas em uma existência de cisplatina. SP /células ALDH

br significativamente maior resistência à cisplatina em comparação com o SP /ALDH

células Baixos, MP /ALDH

células Br e MP /ALDH

células baixos. E, MP /ALDH

células de baixa exibiu maior sensibilidade à cisplatina (Figura 5A).

A. ensaio de viabilidade celular. As células foram cultivadas sob existência de cisplatina diluídos em série. As células viáveis ​​foram analisadas através de WST-1 Kit. Eixo Y indica a viabilidade das células. Os dados representam médias ± DP. As diferenças foram examinadas para significância estatística usando o teste t de Student. * Os valores de P. análise B. qPCR. A expressão de marcadores de células-tronco foi examinada usando SP /ALDH

Br, SP /ALDH

, MP /ALDH

Br e MP /ALDH

células Baixa Baixa. Os dados representam médias ± DP. Os asteriscos indicam diferença significativa. * P 0,05. t-teste. C.

SOX2

knockdown suprimir as expressões de

ALDH1A1

e

ABCG2

.

SOX2

mRNA foi derrubado por siRNA. Dois dias após a transfecção de SOX2 siRNA, as expressões de

ALDH1A1

e

ABCG2

foram investigados por RT-PCR.

GAPDH

foi usado como um controlo interno. ARNsi de controlo (SI-Cont) células transfectadas foram usadas como controlo negativo. D. SOX2 derrubar suprimir o tumor-iniciação.

SOX2

mRNA foi derrubado por siRNA. Dez mil Si-SOX2 e ARNsi de controlo (CONT) Si-células transfectadas foram inoculadas subcutaneamente no dorso de ratinhos NOD /SCID, e o crescimento do tumor foi medido semanalmente. Os dados representam médias ± DP. Diferenças foram examinadas para a significância estatística usando o teste t de Student. * P valores.

Para analisar as características moleculares do SP /ALDH

população Br, foi realizada qPCR (Figura 5B).

ABCG2

mRNA foi preferencialmente expresso em SP /ALDH

células BR e SP /ALDH

células baixos.

ALDH1A1

foi expressa em SP /ALDH

células Br e células MP /ALDH

Br. Estes perfis de expressão são consistentes com o facto de que o fenótipo das células SP depende da expressão de

ABCG2

e o fenótipo celular ALDH

Br depende da expressão de

ALDH1A1

.

SOX2

mRNA foi expressa ao mais alto nível em células /ALDH

br SP, mas não no SP /ALDH

células Baixos, MP /ALDH

células Br ou MP /ALDH

Baixa células (Figura 5B), indicando que a SP /população ALDH

Br incluem preferencialmente uma população de células estaminais. Desde SOX2 tem um papel na manutenção de pulmão CSCs /CICs [26], foi investigada a relação de

SOX2 Comprar e expressões de

ABCG2

e

ALDH1A1

. As expressões de

ABCG2

e

ALDH1A1

foram reduzidas em

SOX2

mRNA derrubado células (Figura 5C). Além disso, SOX2 derrubado células de tumor mostrou inferior-iniciação do que a de células transfectadas siRNA MCAS de controlo (Figura 5D). Portanto, esses resultados sugerem que a SP /ALDH

Br população expressam alto nível de gene de células-tronco

SOX2

, o que pode ter um papel na manutenção da CSCs /CICs e expressões de

ABCG2

e

ALDH1A1

.

Os níveis de CD44, um marcador representativo para CSCs ovarianos expressão /CICs [27], [28], foi semelhante em todas as populações (Figura 5B). Por isso, investigou a relação de células SP,

células Br e CD44-positivas (CD44

+) células ALDH. A proporção de CD44

+ células foi de 8,0%. A proporção de SP /CD44

+ população sobreposição foi de 0,9%, ea proporção de ALDH

Br /CD44

+ sobreposição população foi de 3,3%. Além disso, a relação de SP /ALDH

Br /CD44

+ população sobreposição era de 0,4% (Figura 6).

MCAS células foram coradas pelo corante Hoechst 33342, BAAA e anticorpo anti-CD44, e analisados. Os rácios de SP, ALDH

Br, CD44

+, SP /ALDH

Br, SP /CD44

+, ALDH

Br /CD44

+ e SP /ALDH

br /CD44

+ células foram de 5,3%, 14,4%, 8,0%, 1,0%, 0,9%, 3,3% e 0,4%, respectivamente.

Discussão

A conceito de CSCs /CICs foi proposto há muito tempo [29]. células estaminais leucemia foram isolados a partir de células de leucemia aguda [30], [31], e a primeira população CSC /CIC foi isolado a partir de carcinoma da mama com a combinação de CD44 e a expressão de CD24 [32]. Nos seguintes obras, CSCs /CICs foram isoladas com sucesso em várias doenças malignas. No entanto, desde os mecanismos moleculares de CSCs /CICs ainda são indescritíveis, marcadores precisos para CSCs /CICs são ainda desconhecidos. Portanto, melhorias nos métodos para isolamento de CSCs /CICs ainda são necessários.

métodos de combinação com marcadores duplos ou triplos e com marcadores e ensaio ALDEFLUOR foram relatados. As populações de ALDH

Br e CD44

+ /CD24

– células exibiram uma acumulação parcial, eo ALDH

Br /CD44

+ /CD24

– A população apresentou maior de iniciação tumor capacidade do que a da ALDH

Br população ou CD44

+ /CD24

– população [17]. O ALDH

Br /CD44

+ população e ALDH

Br /CD133

+ população derivada de carcinoma do cólon primário humano apresentaram maior capacidade de iniciação do tumor do que a de ALDH

Br, CD44

+ e CD133

+ populações [33]. Estes resultados indicam que a expressão de marcadores CSC /CIC são parcialmente sobrepostas e que a população sobreposto é altamente enriquecido com CSCs /AIC. De fato, nossos resultados também mostraram sobreposição semelhante de ALDH

células Br e células SP, ea população sobreposição apresentaram maior capacidade de iniciação tumor. Em um estudo do cancro do ovário, células ALDH

br eram mais enriquecido em CD44

+ células do que no uso dos

células CD133 + [23], mas a ALDH

Br e CD44

+ sobreposição era parcial. Identificamos SP /ALDH

Br /CD44

+ população se sobrepõem a partir de células do MCAS (Figura 6). Portanto, o uso da população sobreposição de SP /ALDH

Br /CD44

+ células pode ser uma melhor abordagem para identificar populações CSC /CIC.

células-tronco glioma têm sido descritas de se diferenciar em endotelial células [34]. células estaminais methotelioma maligno foram descritos para se diferenciarem em células endoteliais, células neurais e adipócitos [25]. Neste estudo, constatou-se que as células SP /ALDH

br têm maior capacidade de diferenciação dos adipócitos.