Abstract

MicroRNAs N-myc, não-codificante 20- 22 nucleótidos ARN de cadeia simples, resultam na repressão translacional ou degradação e silenciamento de genes dos seus genes-alvo, e contribuem significativamente para a regulação da expressão do gene. No estudo actual, que relatam que a expressão de miR-182 foi significativamente regulada positivamente em tecidos de cancro da próstata e quatro linhas de células, em comparação com tecidos hiperplasia benigna da próstata e células epiteliais prostáticas normais (RWPE-1). a sobre-expressão ectópica de miR-182 promove significativamente a proliferação, aumenta a invasão, promove a transição do ciclo celular G1 /S e reduz Apotosis precoce de células PC-3, enquanto a supressão de miR-182 diminuiu a proliferação e invasão, inibe a G1 /S transição do ciclo celular e aumento Apotosis precoce de células PC-3. Além disso, demonstramos que miR-182 poderia regular negativamente a expressão de NDRG1 diretamente pela segmentação do NDRG1 região 3 ‘não traduzida. Em conclusão, os nossos resultados sugerem que o miR-182 desempenha um papel importante na proliferação de células cancerosas humanas da próstata por supressão directa do NDRG1 gene supressor de tumor. Nós descobrimos uma nova regulação epigenética da NDRG1

Citation:. Liu R, Li J, Teng Z, Zhang Z, Xu Y (2013) overexpressed MicroRNA-182 promove a proliferação e invasão No câncer de próstata PC-3 células, Down-Regulação Gene N-myc Downstream Regulado 1 (NDRG1). PLoS ONE 8 (7): e68982. doi: 10.1371 /journal.pone.0068982

editor: Daotai Nie, Faculdade de Medicina da Universidade de Southern Illinois, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de abril de 2013; Aceito: 08 de junho de 2013; Publicação: 16 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (n: 30800226), Tianjin Municipal de Ciência e Tecnologia da Comissão (no: 12ZCDZSY17200) e da segunda Hospital da Universidade de Medicina de Tianjin (Não: y1003). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PCA) continua a ser um dos maiores problemas de saúde para o envelhecimento masculino, com uma estimativa de 238,590 novos casos e 29,720 mortes relacionadas ao câncer esperados em 2013 nos Estados Unidos sozinho [1]. Embora os homens chineses pertencem ao grupo de baixa risco de ter APC, a incidência e mortalidade têm aumentado significativamente devido ao envelhecimento da população, as mudanças nos estilos de vida e outras causas. CaP tornou-se uma das neoplasias mais comuns em homens em todo o mundo, com taxas altamente variáveis ​​de progressão do tumor e as respostas ao tratamento. Se o tumor está confinado à próstata, os pacientes podem ser tratados por remoção cirúrgica do tumor ou por radiação, com elevada eficácia. Por contraste, a terapia de tumores não confinados ainda representa um problema grave. O tratamento padrão para esses pacientes é antiandrogénios para conseguir bloqueio total androgénio [2]. Infelizmente, isso tumores progresso e, assim, contornar o tratamento é um evento muito frequente e não existem tratamentos eficazes para pacientes resistentes PCA (CRPC) castração, embora urologista está tentando usar quimioterápicos. Embora ambos os fatores genéticos e ambientais são considerados os principais fatores, os mecanismos moleculares de desenvolvimento de CaP e progressão permanecem em grande parte unknown.Therefore, entender melhor a patogênese da APC e explorar alvos de intervenção novas para CaP são urgentemente tarefas exigentes.

Os microRNAs (miRNAs) são um grupo de pequenas (cerca de 20-22 nucleotídeos) RNAs não-codificantes endógenos. miARNs maduro regular negativamente os seus genes-alvo através de emparelhamento imperfeito sequência complementar à região não traduzida a 3 ‘(UTR) de genes alvo que resulta em qualquer degradação do mRNA ou a repressão de translação. Numerosos estudos demonstraram que a expressão aberrante de miARNs está intimamente associada com a proliferação, invasão, metástase e o prognóstico de vários cancros, incluindo o APC, cancro da mama, glioma e de cancro do pulmão [3] – [6]. CaP progressão está associado com alterações na expressão de vários oncogenes e supressores tumorais, e miARN pode potencialmente regulam estes genes; No entanto, a relação entre miARNs CaP e só começou a ser elucidado nos últimos anos [7]. Mais de 50 miARNs são relatados para ser envolvido na APC; no entanto, a maioria dos dados atuais sugerem que apenas um pequeno número de estes se relacionam com a patogênese da [8] CaP. . Mais miARNs devem ser seleccionados e estudados, a fim de melhor compreender a progressão de CaP

Até à data, muitos artigos investigada a expressão em amostras de miARN APC, no entanto, os resultados foram altamente inconsistente [9] – [15]. Nenhum resultado de detecção de miRNA microarray foram relatados a partir de amostras de CaP chineses até agora. No estudo atual, primeiro rastreados os miRNAs relacionadas com CaP por microarrays miRNA, e de acordo com os resultados preliminares, descobrimos que microRNA-182 (miR-182) foi overexpressed em tecidos APC. Estudos mostraram que o miR-182 de melanoma poderia promover metástases através da repressão FOXO3 e factor de transcrição associada-microftalmia [16], por sua vez, o miR-183-96-182 agrupamento foi sobre-expressa no tecido da próstata e poderia regular homeostase de zinco em células da próstata [17]. MiR-182 foi pensado para ser um importante oncomiR. No entanto, miR-182 poderia suppresse tumorigênese pulmonar através da regulação para baixo da expressão RGS17 in vitro [18]. Além disso, um novo estudo mostrou que miR-182 e microRNA-200a podia controlar-13 alfa (GNA13) expressão subunidade G-proteína e invasão celular sinergicamente em células CaP [19]. Estes resultados inconsistentes indicam que a função de miR-182 é complexo e são necessários mais estudos. Neste estudo, demonstrámos que o miR-182 promovida CaP PC-3 células de proliferação e invasão de direccionamento directamente o 3′-UTR de N-myc regulada a jusante do gene 1 (NDRG1, NM_006096.3) ARNm. Nossos resultados sugerem que miR-182 pode desempenhar um papel importante no desenvolvimento e progressão do CaP.

Declaração de Ética Materiais e Métodos

O estudo foi aprovado pela ética conselho de Administração do Hospital segunda Universidade médica Tianjin. Todas as amostras foram obtidas de pacientes que assinaram o consentimento informado, que aprova o uso de seus tecidos para fins de investigação após a operação.

próstata amostras de tecido

Cinco tecidos CaP foram coletadas após prostatectomia radical no departamento de Urologia do hospital entre janeiro de 2010 e dezembro de 2012. Nenhum dos pacientes havia recebido terapia hormonal neoadjuvante antes da operação. Três tecidos hiperplasia prostática benigna (BPH) foram recolhidas após enucleação suprapúbica da próstata. tecidos da próstata frescas foram amostrados directamente após a remoção cirúrgica das amostras gland.These foram imediatamente congeladas em azoto líquido e usada para os experimentos de microarranjos de miARN. A H de diagnóstico . Seção E estava preparado para verificar o conteúdo do tumor e apenas os casos com tecido tumoral mais de 90% foram consideradas para análise posterior

Mirna Análise Microarray

Mirna kits de isolamento (Ambion) foram usado para isolar ARN total com miARNs enriquecidas a partir de amostras de tecidos da próstata. ensaio Microarray foi realizada utilizando um prestador de serviços (LC Ciências, Houston, TX, https://www.lcsciences.com) tal como descrito anteriormente [20]. Aqueles com mudança vezes 2 ou -2 e valores de P 0,05 (teste t) foram considerados como miARNs expressos diferencialmente. Em tempo real de RT-PCR foi utilizada para a confirmação de alguns miARNs expressos diferencialmente.

Cultura celular

linhas celulares de CaP humano LNCap, PC-3, DU145, 22Rv1 e normal linha celular epitelial de próstata RWPE-1 foram obtidas de American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA) e mantido no nosso laboratório. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco) suplementado com 10% de vitelo-fetal de soro e penicilina (100 U /ml). As culturas foram mantidas sob uma atmosfera contendo 5% de CO

2.

total Extração de RNA e em tempo real de RT-PCR

O ARN total foi extraído utilizando Trizol Reagent (Invitrogen, CA, EUA ). O ADNc foi sintetizado utilizando M-MLV MicroRNA Transcrição Reversa Kit (Promega, EUA). Em tempo real de RT-PCR foi realizada com SYBR® Premix Ex Taq ™ (Takara, Biotech Co., Ltd, Dalian, China). Iniciador de RT para miR-182 foi 5′- GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTGCACTGGATACGACAGTGTGA -3 ‘, iniciador de PCR para miR-182 foi 5′-TGCGGTTTGGCAATGGTAGAAC-3′ (para a frente), 5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3 ‘(inverso). O nível de expressão foram normalizados para U6. RT primer para U6 foi 5’- GTCGTATCCA GTGCAGGGTCCGAGG TGCACTGGATACGACAAAAT ATGG -3 ‘, iniciador de PCR para U6 foi 5′- TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC -3’ (para a frente), 5’CCAGTGCAGGGTCCGAGGT -3 ‘(reverso). A PCR foi realizada sob as seguintes condições: 94 ° C durante 4 min, seguido de 40 ciclos a 94 ° C durante 30 s, 50 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 40 s. Cada amostra foi corrida em triplicado.

Western Blotting

Western blotting foi realizado para determinar NDRG 1-expressão da proteína. Todas as proteínas foram resolvidas num gel de poliacrilamida de SDS-desnaturado 8% e foram em seguida transferidas para uma membrana de nitrocelulose. As membranas foram incubadas com tampão de bloqueio durante 90 minutos à temperatura ambiente e depois incubadas com um anticorpo contra NDRG-1 ou beta-tubulina com Blotto durante a noite a 4 ° C. As membranas foram lavadas e incubadas com uma peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpo secundário. A expressão proteica foi avaliada por quimioluminescência aumentada e a exposição ao filme quimioluminescente. A aquisição e análise de imagens Labworks software (UVP, LLC) foi utilizado para quantificar intensidades de banda. Todos os anticorpos foram adquiridos a Saier Biotecnologia (Tianjin, China).

transfecção celular

As transfecções foram efectuadas utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, as células PC-3 foram plaqueadas em placas de seis poços e cultivados sem antibióticos para 60-80% de confluência. Cada poço recebeu 10 ml de reagente de lipofectamina e 50 pmol de sintéticos miR-182 imita (GenePharma Co., Ltd, Xangai, China), miRNAs sintéticos negativos de controle (miR-182 imita-NC), sequência de miR-182 inibidor sintético ou sintética miR-182 inibidor de controle negativo (miR-182 inibidor-NC). Sequências de miR-182 imita, de miR-182 imita-NC, o miR-182 e miR-inibidor-182 inibidor-nc foram apresentados na tabela 1. Todos os imitadores e inibidores foram marcadas com FAM (carboxifluoresceína). Seis horas após a transfecção, as células PC-3 foram observadas utilizando microscopia de fluorescência e meio isento de soro foi mudado para meio completo.

Ensaio MTT

células PC-3 transfectadas com miR- 182 imita ou miR-182 imita-NC, ou o miR-182 e miR-inibidor-182 inibidor-NC foram plaqueadas em placas de 96 poços a 1 × 10

4 células /poço. As células viáveis ​​foram medidos 1, 2, 3, 4 e 5 dias após o plaqueamento. Após incubação com cloreto de 3- (4, 5- 2-dimetiltiazolil) -2, brometo de 5-difeniltetrazólio (MTT), as células foram lisadas em 150 ml de 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) e a absorvância de UV-visível foi lida a 490 nm usando o leitor de placas de 96 poços. Cada amostra foi executado em triplicado.

Cell Cycle Analysis

células transfectadas tanto com miR-182 imita ou miR-182 imita-NC, ou miR-182-inibidor e miR- PC-3 182 inibidor-NC foram colhidas 72 h após a transfecção, lavou-se com solução salina de fosfato tamponada fria (PBS), e fixadas em 1 ml de etanol a 70%. Após incubação durante a noite a 4 ° C em etanol, as células foram lavadas em PBS e suspensas em 500 ml propidine iodeto de (PI), 30 min antes da citometria de fluxo. Populações em G0-G1, S e fase G2-M foram medidos por citometria de fluxo (BD Biosciences, EUA) e os dados foram analisados ​​usando o Ciclo Celular Multicycle-DNA analisado software.The medição foi realizada em triplicado.

detecção de celular precoce apoptose

PC-3 transfectadas com tanto miR-182 imita ou miR-182 imita-NC, ou miR-182-inibidor e miR-182 inibidor-NC foram recolhidos e fixados com 70% de etanol para a detecção de apoptose precoce. O tingimento de células foi realizada de acordo com as instruções do kit de detecção de apoptose celular Anexina V-R-PE (SouthernBiotech, EUA). A citometria de fluxo (BD Biosciences, EUA) foi utilizado para detectar a percentagem de apoptose precoce. A medição foi realizada em triplicado.

Transwell celular Invasão Ensaio

células transfectadas com miR-182 ou imita o miR-182 imita-NC, ou o miR-182 e miR-inibidor de PC-3 -182 inibidor-NC foram recolhidos. 5 × 10

4 células PC-3 foram colocados na câmara superior de cada pastilha revestida com 50 ul de 2 mg /ml de Matrigel (factor de crescimento reduzida matriz BD MatrigelTM), e 600μl de meio RPMI 1640 com 20% de FBS foi adicionado ao a parte inferior da câmara. Após incubação durante 24 horas, as câmaras foram desmontados, e as membranas foram coradas com uma solução violeta de cristal a 2% durante 15 minutos e colocada numa lâmina de vidro. Em seguida, as células que tinham migrado através da membrana foram contadas em cinco campos aleatórios visuais utilizando um microscópio óptico. Todos os ensaios foram realizados três vezes independentes em triplicado.

miRNA Alvos Previsão

Os alvos miRNA putativos foram previstos usando o TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_50/), miRBase (https://www.mirbase.org/index.shtml) e PicTar (http: //pictar.mdc – berlin.de/). algoritmos

plasmídeo Construção

PmirGLO- vector repórter de dual-luciferase (7350 pb, Promega, Madison, WI, EUA) foi usada para confirmar a função do sítio de ligação putativo do miR-182 na NDRG1 3′-UTR. De acordo com o potencial sequência de ligação de miR-182 da NDRG1 3′-UTR, um duplo – sequência de cadeia foi obtida por emparelhamento com dois single-fios NDRG1-Top, (NheI) 5′-CTAGCTAGCGGCCGCTAGT CCTC AGAGAC ACCAAACTGCCAAAAG- 3 ‘; NDRG1-Bot (Sall) 5’-TCGACTTTTGGCA GTTTGGTGTC TCTGAGG ACTAGCGGCCGCTAG- 3 ‘, e, em seguida clonado nos locais NheI /SalI do vector repórter pmirGLO-Dual-luciferase. O recozimento foi realizada como: 95 ° C durante 5 min e à temperatura ambiente durante 2 h. O plasmídeo reconstruído foi confirmada por restrição digestão endonuclease e sequenciamento, e foi nomeado pmirGLO /NDRG1-UTR.

dupla de luciferase Reporter Gene Assay

PC-3 células foram divididos em cinco grupos de acordo com diferentes conteúdos de transfecção: a: (em branco) pmirGLO /NDRG1-UTR; b: pmirGLO /NDRG1-UTR + miR-182 inibidor-NC; C: pmirGLO /NDRG1-UTR + miR-182-inibidor; d: pmirGLO /NDRG1-UTR + miR-182 imita-NC; E: pmirGLO /NDRG1-UTR + miR-182 imita. Células PC-3 foram semeadas em triplicado em placas de 96 cavidades, deixou-se assentar durante 24 h e, em seguida, co-transfectadas com diferentes conteúdos utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, CA, EUA). Luciferase e a actividade de Renilla foram medidos 48 h após a transfecção usando o Kit de Ensaio duplo LuciferaseReporter (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. Três experiências independentes foram realizados e os dados são apresentados como a média ± DP. valores de atividade da luciferase normalizada para a actividade Renilla como unidade de luz relativa (RLU)

Análise Estatística

O bicaudal teste t de Student foi utilizado para avaliar a significância das diferenças entre os dois grupos.;

P

valores . 0,05 foram considerados significativos

Resultados

miR-182 foi regulada em ACP tecidos

Após a análise miRNA microarray primário, em tecidos CaP , cinco miRNAs (miR-345, miR-145, miR-221, miR-27b e miR-378) foram regulados negativamente e vinte e dois miRNAs foram regulados positivamente (Figura 1). MiR-182 foi regulada com a mudança vezes de 6,14 e ainda confirmada por real-time RT-PCR com a mudança vezes de 5,70. Como os mais significativos miRNA diferencialmente expressos entre os tecidos APC e BPH, miR-182 foi escolhido para um estudo mais aprofundado. Todos os miRNAs diferencialmente expressos foram vistos na Tabela S1.

Em tecidos APC, cinco miRNAs foram regulados negativamente e vinte e dois miRNAs foram up-regulada. miRNA-182 foi regulado para cima com a mudança vezes de 3,07 e ainda confirmada por real-time RT-PCR com a mudança vezes de 2,85.

miR-182 foi regulada em ACP celular Lines

análise em tempo real de RT-PCR revelou que a expressão de miR-182 foi significativamente aumentada em quatro linhas comuns de CaP de células testadas (PC-3, DU145, 22Rv1 e LNCaP), em comparação com epitelial de próstata normal,-1 RWPE célula, indicando que o miR -182 é regulada positivamente em linhas celulares de APC e PC-3 tem o mais alto nível de expressão (Figura 2). Em seguida, as células PC-3 foram escolhidos para posterior estudo.

em tempo real de RT-PCR indicam que o nível de expressão relativa de células PC-3 é o maior em quatro linhas celulares de cancro da próstata e RWPE-1 tem o menor nível de expressão. Os valores representam as médias de três experiências separadas e barras de erro representam o SD.

miR-182 Nível de expressão é significativamente alterada após a transfecção com Imita ou inibidores

-182 MiR nível de expressão foi detectada por em tempo real de RT-PCR após a transfecção com imita ou inibidores em células PC-3. Os resultados mostraram que imita ou inibidores foram eficientemente transfectadas (Figura 3) e o nível de expressão é mais elevada no grupo de miR-182 imita e menor no grupo inibidor de miR-182 (Figura 4). Estes resultados indicaram que estes imita ou inibidores podem mimetizar ou inibir o miR-182 de forma eficaz.

Os resultados mostram que a taxa de transfecção é mais do que 80%. Imagens representativas e campos selecionados aleatoriamente são mostrados.

presentes em branco controlo em branco. Os resultados mostram que o nível de expressão é mais elevada no grupo de miR-182 imita e menor no grupo inibidor de miR-182. Os valores representam as médias de três experiências separadas e barras de erro representam o SD.

A superexpressão de miR-182 promove a proliferação de células PC-3

A fim de investigar a função de miR- 182 na APC, nós transfectadas miR-182 imita ou inhibitros em células CaP 3 PC-e proliferação da célula medida. Utilizando ensaios MTT, observou-se que a taxa de crescimento de células que sobre-expressam o miR-182 foi dramaticamente aumentada, em comparação com o miR-182 imita -NC células transfectadas (

P

0,05). Pelo contrário, após a regulação negativa de miR-182 por um inhiobitor, a taxa de crescimento de células PC-3 foi drasticamente diminuída em comparação com as células de miR-182 inibidor -NC-transfectadas (

P

0,05) (figura 5). Estes resultados demonstraram que a sobre-regulação de miR-182 promove a proliferação de células PC-3.

presentes em branco de controlo em branco. absorvância no UV-visível foi medida a 490 nm. A absorvância relativa foi significativamente diferente de 3 dias após a transfecção (

P

0,05). Os valores representam as médias de três experiências separadas.

A superexpressão de miR-182 promove a transição de ciclo celular G1 /S em células PC-3

Além disso, investigamos o efeito de miR-182 na proliferação utilizando citometria de fluxo. Células PC-3 de miR-182 que sobre-expressam teve uma percentagem significativamente inferior de células na fase G0 /G1 e aumento da percentagem de células na fase S, em comparação com o miR-182 imita-NC- células transfectadas. Pelo contrário, após a regulação negativa de miR-182 por um inhiobitor, células PC-3 tinha uma percentagem significativamente mais elevada de células na fase G0 /G1 e diminuiu percentagem de células na fase S, em comparação com o miR-182 inibidor-NC- As células transfectadas (Figura 6). Este dados sugerem que a superexpressão de miR-182 poderia promover a transição ciclo /célula G1 S, e pode, por conseguinte, aumentar a proliferação de células PC-3.

presentes em branco de controlo em branco. Os valores representam as médias de três experiências separadas e as barras de erro representam o SD. (*

P Art 0,05).

A superexpressão de miR-182 Reduz precoce Apotosis de células PC-3

Para investigar o possível envolvimento regulador do miR -182, apoptose precoce de células PC-3 foram detectados após a transfecção. Os resultados mostraram que a taxa de apoptose precoce de células que sobre-expressam o miR-182 foi drasticamente diminuída, em comparação com o miR-182 células mimetiza-NC-transfectadas. Pelo contrário, após a regulação negativa de miR-182 por um inhiobitor, a taxa de apoptose precoce de células PC-3 foi significativamente aumentada em comparação com o miR-182 células inibidor-NC-transfectadas (Figura 7). Estes resultados demonstraram que a sobre-regulação de miR-182 reduz a ocorrência precoce de apoptose de células PC-3.

presentes em branco de controlo em branco. Os resultados mostram que a taxa de apoptose precoce é mais baixo em miR-182 grupo imita e mais alta no grupo inibidor de miR-182 (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01) . Imagens representativas foram mostrados e as células da apoptose primeiros foram indicados no Q4 área (LR).

A superexpressão de miR-182 Aumenta Invasion em células PC-3

A superexpressão de miR-182 significativamente aumento do potencial invasivo de células PC-3 quando transfectada com miR-182 imita em comparação com células de controlo em ensaio Transwell com Matrigel e células transfectadas com miR-182 resultou em um inibidor significativamente decresed potencial invasivo (Figura 8). Estes dados sugerem que miR-182 aumenta a invasão no PC-3 células

in vitro

.

ensaios de invasão foram realizados com células PC-3 transfectadas com miR-182 imita ou inibidores. Em branco apresenta controlo em branco. Imagens representativas e campos selecionados aleatoriamente são mostradas (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01).

Identificação de miR-182 Encadernação Sites em NDRG1 3′-UTR Region of

Depois de previsão com miRNA on-line Alvos ferramentas, muitos genes putativos foram previstos. Os genes relacionados com a proliferação celular, apoptose, invasão e metástase foram seleccionados, incluindo NDRG1. Além disso, verificou-se que era NDRG1 um gene supressor de metástase [21] – gene de [25] ou supressor de tumores [26], e NDRG1 era necessária para a apoptose dependente de p53 [27]. O nosso estudo mostrou também que NDRG1 foi regulada negativamente nos tecidos APC e células PC-3 comparados com tecidos e células BPH RWPE-1 (dados não mostrados). Finalmente, NDRG1 foi seleccionado para um estudo mais aprofundado. Em seguida, verificou-se que a região NDRG1 3′-UTR tem apenas uma locais de ligação de miR-182 altamente conservados (Figura 9).

NDRG1 região 3′-UTR tem apenas uma locais de ligação de miR-182 altamente conservadas após bioinformática análise.

miR-182 visa diretamente a metástase Supressor Gene NDRG1 em células PC-3

resultados da Western Blotting mostrou que a sobre-expressão de miR-182 em células PC-3 diminuiu significativamente o Os níveis de expressão de proteína de NDRG1 após a transfecção com o miR-182 mimetiza, em comparação com o miR-182 imita células -NC-transfectadas. Pelo contrário, após a regulação negativa de miR-182 por um inhiobitor, os níveis de NDRG1was expressão de proteínas aumentaram dramaticamente em comparação com o miR-182 células inibidor-NC-transfectadas (Figura 10), indicando que NDRG1 é um potencial gene alvo de miR-182.

presentes em branco controlo em branco. A sobre-expressão de miR-182 diminuiu de forma significativa os níveis de expressão de proteína de NDRG1 e regulação negativa de miR-182 aumentou dramaticamente os níveis de expressão de proteína NDRG1 (*

P

0,05, **

P 0,01). Os valores representam as médias de três experiências independentes e as barras de erro representam o SD

Para confirmar a função do sítio de ligação putativo do miR-182 na NDRG1 3′-UTR, sintetizamos o dobro -. Sequência de cadeia que inclui o local de ligação de miR-182 e clonado no plasmídeo repórter de luciferase. A actividade da luciferase do pmirGLO /NDRG1-UTR foi drasticamente inibida por sobre-expressão de miR-182 com co-transfecção com o miR-182 imita e significativamente aumentado por regulação negativa de miR-182 com co-transfecção com inibidores de miR-182, em células PC-3, em comparação com o plasmídeos de controlo (Figura 11), sugerindo que o miR-182 tem como alvo especificamente o NDRG1 3′-UTR.

a actividade da luciferase do pmirGLO /NDRG1-UTR foi drasticamente inibida em miR-182 e imita grupo significativamente aumentados em miR grupo -182 inibidores, em comparação com os grupos de controlo (*

P Art 0,05, **

P Art 0,01).

Discussão

ao longo dos últimos anos, centenas de miARNs ter sido demonstrado que desempenham papéis importantes na regulação da expressão de genes através da degradação de ARNm ou repressão da tradução em uma variedade de sistemas de modelo [28] – [29]. A evidência sugere que miARN pode funcionar como uma nova classe de ambos os genes tumorigénicas e supressora de tumores [30]. Neste estudo, preparado pela primeira vez dez amostras APC e dez amostras de BPH, no entanto, apenas cinco amostras APC e três amostras BPH encontrou o padrão de triagem de teste de microarray. Após análise de microarray miARN e em tempo real de RT-PCR de confirmação, que demonstrou que o miR-182 é regulado positivamente em tecidos de CaP chineses, em comparação com os tecidos de BPH. O resultado a regulação positiva de miR-182 foi consistente com o estudo de Schaefer A et al [14]. Em seguida, revelou que a expressão de miR-182 foi significativamente aumentada em quatro linhas comuns de CaP de células testadas (PC-3, DU145, 22Rv1 e LNCaP), em comparação com epitelial de próstata normal,-1 RWPE célula, indicando que o miR-182 é regulada positivamente em células CaP linhas e PC-3 tem o nível de expressão mais elevado. Em seguida, as células PC-3 foram escolhidos para posterior estudo. Em seguida, provar que o miR-182 tem como alvo especificamente o NDRG1 3′-UTR em células PC-3.

Estudos anteriores revelaram que NDRG1 era um gene supressor de metástases de gene supressor de tumor ou de CaP [21], [24] , [25]. O nosso estudo mostrou também que NDRG1 foi regulada negativamente nos tecidos APC e células PC-3 comparados com tecidos e células BPH RWPE-1 (dados não mostrados). Noutra experiência funcional mostrou que a regulação negativa da NDRG1 poderia aumentar a proliferação e invasão de células PC-3, e a regulação positiva de NDRG1 poderia diminuir a proliferação e invasão de células PC-3 (dados não mostrados). Estudos mostraram que a regulação molecular de NDRG1 invovles PTEN [21], [26], P21 [22], Wnt-β-catenina [23], o factor de activação de transcrição 3 [24], ATF3-NF kappaB complexo [25] e p53 [27]. No entanto, não houve relato sobre NDRG1 regulada por microRNA em CaP para promover a proliferação de forma clara e ainda diretamente. É o primeiro para nós para descobrir a nova relação de regulação da NDRG1 e microRNA em CaP. Observou-se que o miR-182 foi significativamente sobre-expresso em linhas celulares de APC, em comparação com RWPE-1. Além disso, a sobre-expressão ectópica de miR-182 promove significativamente a proliferação, aumenta a invasão, promove a transição do ciclo celular G1 /S e reduz Apotosis precoce de células PC-3, enquanto a supressão de miR-182 diminuiu a proliferação e invasão, inibe a G1 /S transição do ciclo celular e aumento Apotosis precoce de células PC-3. A fim de explorar o mecanismo de miR-182, identificou-se NDRG1 como um gene alvo putativo miR-182 usando análise bioinformática, e confirmou que NDRG1 é um alvo directo de miR-182 por ensaio de gene repórter da luciferase dupla. Estes resultados mostraram que o miR-182 aumenta a proliferação e invasão de células PC-3 CaP por direccionamento directamente a NDRG1 3′-UTR para regular negativamente NDRG1.

Nos últimos anos, NDRG1 tem sido descrito como um potencial supressor tumoral de genes em vários cancros humanos, e pode ser associado com a agressividade do tumor e metástases [31] – [34]. No entanto, o machanism silenciamento de NDRG1 ainda não está claro. Uma maneira pela qual as células cancerosas silenciar tumor expressão do gene supressor são alterações epigenéticas, que incluem hipermetilação DNA do promotor ilhas CpG e /ou mudanças nas histonas modificações pós-translacionais associadas que levam à repressão da transcrição [35]. O promotor de NDRG1 contém uma grande ilha CpG, levantando a possibilidade de que poderia ser silenciados por hipermetilação do ADN em cancro. Portanto, os pesquisadores começam a estudar a regulação epigenética da NDRG1 recentemente. Angst et al [36] estudo mostraram que a expressão NDRG1 pode ser regulado através da inibição farmacológica da metilação do DNA e a desacetilação das histonas em células de cancro pancreático. No entanto, nenhuma metilação da ilha CpG do promotor NDRG1 foi encontrado em células de cancro do pâncreas, sugerindo um mecanismo indirecto para NDRG1 de-repressão por estes tratamentos. Li e Chen [37], estudo mostraram que o silenciamento de NDRG1 em linhas celulares de cancro do cólon SW620 e SW480 foi devido a modificações das histonas, outras do que a hipermetilação do promotor. No entanto, Chang et al [38] estudo mostrou que a diminuição da expressão de ARNm e proteína NDRG1 em linhas celulares de cancro gástrico e tecidos foi devido a metilação do promotor do gene NDRG1. Estes estudos sugerem que a regulação epigenética da NDRG1 é diferente em diferentes tipos de células cancerosas. Neste estudo mostramos que NDRG1 poderia ser directamente objecto de miR-182 e descobriu uma nova regulação epigenética de NDRG1, sugerindo que a sobre-regulação de miR-182 pode fornecer um mecanismo alternativo para a redução da expressão de proteína supressora de tumor NDRG1 em células CaP .

Mais pesquisas ainda é obrigado a examinar se outros miRNAs ou vias de sinalização pode regular NDRG1 em APC, porque não podia excluir que possa haver outros microRNAs, ainda não foram encontrados, a desempenhar um papel importante na regulação NDRG1 em APC, e se miR-182 pode alvejar outros membros da família NDRG1. Por exemplo, seria de interesse para saber se outras vias estão envolvidos no efeito anti-proliferativo de NDRG1 e investigar o que os outros componentes do fenótipo maligno são determinados por NDRG1 e miARNs em células APC, e estes problemas estão actualmente sob investigação no nosso laboratório.

Conclusões

Em resumo, a principal conclusão do estudo é que o miR-182 pode aumentar a proliferação de linhas de células CaP, visando NDRG1. Estes dados indicam que o miR-182 desempenha um papel essencial na regulação da proliferação de células APC e pode funcionar como um onco-miARN. MiR-182 pode cortar como um novo alvo terapêutico para o tratamento de CaP.

Informações de Apoio

Tabela S1.

diferencialmente expressos miRNAs entre tecidos APC e BPH. miRs negrito foram reprimidos miRs em tecidos CaP

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068982.s001

(DOC)