Abstract

Fundo

Através de regulação negativa da expressão do gene, microRNAs (miRNAs) podem funcionar em cancros como oncosuppressors, e eles podem mostrar expressão alterada em vários tipos de tumores. Aqui nós investigamos tumores de meduloblastoma (MB), que surgem a partir de um comprometimento precoce dos processos de desenvolvimento no cerebelo, onde a sinalização Notch está envolvida em vários estágios de células-determinar-destino. MBs ocorrer bimodal, com o pico de incidência observada entre 3-4 anos e 8-9 anos de idade, embora possa também ocorrer em adultos. Notch regula um subconjunto das células de MB que tenham propriedades de células-tronco do tipo e pode promover o crescimento do tumor. Com base nessas evidências, a hipótese de que miRNAs alvo da via Notch pode regulada estes fenómenos, e pode ser usado em terapias anti-câncer.

Metodologia /Principais Achados

Em uma exibição de linhas celulares MB, a miARN miR-199b-5p foi visto para ser um regulador do caminho do entalhe através do seu direccionamento do factor de transcrição HES1. A regulação negativa da expressão HES1 por miR-199b-5p regula negativamente o crescimento e taxa de proliferação independente de ancoragem de células de MB. MiR-199b-5p sobre-expressão bloqueia a expressão de genes de células-tronco vários câncer, prejudica o potencial de enxerto de células MB no cerebelo de ratos atímicos /nu, e de particular interesse, diminui a MB com células-tronco-like (CD133 +) subpopulação de células. Na nossa análise de 61 doentes com MB, a expressão de miR-199b-5p nos casos não metastáticos era significativamente mais elevada do que nos casos metastáticos (p = 0,001). Correlação com a sobrevida para estes pacientes com altos níveis de expressão de miR-199b mostrou uma tendência positiva para uma melhor sobrevida global do que para os pacientes de baixa expressar. Estes dados mostram a infra-regulação de miR-199b-5p em MBs metastático sugerem um mecanismo de silenciamento potencial através de alterações epigenéticas ou genéticos. Após a indução de de-metilação usando 5-aza-desoxicitidina, menor expressão de miR-199b-5p foi visto num painel de linhas celulares MB, suportado de um mecanismo de regulação epigenética. Além disso, duas linhas celulares (Med8a e UW228) mostrou significante sobre-regulação do miR-199b-5p após tratamento. A infecção com células de MB de um modelo de xenoenxerto induzida no cerebelo de rato e a utilização de um adenovírus transportando o miR-199b-5p indicar um benefício clínico através desta influência negativa de miR-199b-5p no crescimento do tumor e no subconjunto de MB de haste células semelhantes a células, proporcionando mais uma prova de conceito.

Conclusões /Significado

Apesar dos avanços na nossa compreensão da patogênese da MB, um terço destes pacientes permanecem tratamentos incuráveis ​​e atual pode significativamente danos sobreviventes a longo prazo. Aqui nós mostramos que a expressão de miR-199b-5p se correlaciona com metástases spread, a identificação de um novo marcador molecular para uma classe pobre em risco em pacientes com MB. Nós mostram ainda que, em um modelo de xenoenxerto, a carga tumoral MB pode ser reduzida, o que indica a utilização de miR199b-5p como uma terapia adjuvante após a cirurgia, em combinação com radioterapia e quimioterapia, para a melhoria da anti-cancro MB terapias e qualidade paciente de vida. Até o momento, este é o primeiro relatório que a expressão de um miRNA pode esgotar as células-tronco do tumor, indicando uma abordagem terapêutica interessante para a segmentação dessas células em tumores cerebrais

Citation:. Garzia L, Andolfo I, Cusanelli E, Marino N, Petrosino L, De Martino D, et al. (2009) MicroRNA-199b-5p Cancer danifica Stem Cells através de regulação negativa da HES1 em meduloblastoma. PLoS ONE 4 (3): e4998. doi: 10.1371 /journal.pone.0004998

editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Pesquisa Ordway, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de novembro de 2008; Aceito: 23 de fevereiro de 2009; Publicação: 24 de março de 2009

Direitos de autor: © 2009 Garzia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por gasoduto FP6-EET LSH-CT-2006-037260 (MZ), FP7-Tumic HEALTH-F2-2008-201662 (MZ), Associazione contro la lotta al Neuroblastoma Italiana “Progetto Pensiero” (aI, MZ), a AIRC concessão 2007 (MZ), Progetto AIRC Tumori Pediatrici 2008 (MZ). Associazione Abrir Neuroblastoma (AI), a Scuola Europea di Medicina Molecolare (SEMM-CEINGE) Fellowship (CE), e AIRC-FIRC Fellowships (LG, NM). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os microRNAs (miRNAs) são RNAs de cadeia simples de ± 22 nucleótidos de comprimento, e eles constituem uma nova classe de genes reguladores [1]. Em animais, miRNAs têm efeitos reguladores através da sua ligação a imperfeitos locais complementares dentro das regiões 3 ‘não traduzidas (3’UTRs) de seus alvos de mRNA. expressão alterada de muitas miARNs é visto em diversos tipos de tumores: v.g. linfomas de células B (agrupado miR-17) [2], [3], linfomas malignos (miR-15a, miR-16-1; segmentação BCL2) [4], tumores de glioblastoma (miR-21up-regulação) [5] , neoplasia colorretal (miR-143, miR-145 down-regulamentado) [6], o cancro do pulmão (miR-29) [7], e cancro da mama (miR-10b) [8], com vários outros tipos de tumores em análise.

Aqui, temos focado no mais comum dos tumores cerebrais malignos, meduloblastoma (MB). MBs parecem ter origem a partir de células-tronco e a partir de neurónios de grânulos precursores na camada externa de grânulos do cerebelo [9], ou, alternativamente, a partir de precursores multipotenciais na zona ventricular do cerebelo [10] – [12]. Do ponto de vista clínico, tratamentos multimodais atuais incluem a ressecção cirúrgica radical, seguida por radiação e quimioterapia. Enquanto estes tratamentos podem melhorar a taxa de sobrevivência, MB permanece incurável em cerca de um terço dos pacientes. A principal causa de morte é recorrência associado com disseminação do tumor, pelo qual a corrente do ponto de opções terapêuticas têm pouca eficácia [13]. Estes tratamentos também são tóxicos e podem levar a dificuldades de longa duração [14] – [16]. Consequentemente, existe uma necessidade substancial de novela, eficazes, terapias de baixa toxicidade para crianças com meduloblastoma.

células MB também podem conter subconjuntos funcionalmente importantes de células-tronco com propriedades semelhantes que são exclusivamente capazes de propagar o crescimento de tumores [17], [18]. Estudos recentes demonstraram que ambos os progenitores e células-tronco pode responder à via de Sonic Hedgehog-(Shh) e pode servir como células de origem dos MBs [19].

actividade Notch tem sido demonstrado que regulam o grânulo de células progenitores a partir dos quais surgem MBs, com os números de cópias do gene Notch2 aumentou em 15% dos MBs [12], [20]. expressão persistente de

bHLH HES1

, o principal gene Notch-responsivo, evita que tanto a migração de células progenitoras neurais para fora da zona ventricular e a expressão de marcadores neuronais [21]. Ratos falta

Hes1

mostrar neurogênese prematuro, visto como up-regulação dos fatores de transcrição bHLH neurais, o que resulta em grandes defeitos do tubo neural [22]; células progenitoras derivadas de estes ratos foram auditivos potencial de auto-renovação, com um compromisso com uma linhagem neuronal [23].

Significativamente, a expressão de HES1 em MB tem sido associada com o resultado clínico pior [24]. De nota, uma interacção com Shh no desenvolvimento do precursor de células granulares tem sido postulado [25], como tem conversa cruzada com outras vias, por exemplo o gene grupo Polycomb

BMI-1 | [26].

A nossa abordagem começou com uma busca por miRNAs (Registro miRNA) com genes alvo envolvidas na via Notch, e identificamos miR199b-5p como visando HES1, a efetora Notch. Nós mostramos que a expressão de miR-199b-5p é perdido em doentes metastáticos e postular um mecanismo de regulação seguinte silenciamento epigenético através de processos de metilação que ocorrem durante a carcinogênese, a identificação de um novo marcador molecular para uma classe pobre em risco em pacientes com MB. MiR199b-5p expressão prejudica especificamente o câncer de células-tronco (CD133 +) da população, o que resulta

in vivo

na insuficiência do desenvolvimento do tumor MB no modelo do rato cerebelo xenotransplante, proporcionando assim uma prova de conceito. Como microRNAs foram mostrados recentemente para ser ferramentas úteis para silenciar tipos de câncer, eles podem ser capazes de preencher esta lacuna através do seu controlo de múltiplos genes-alvo. Nós fornecemos aqui evidência para o uso de miRNAs na clínica, com a nossa terapia anti-tumor segmentação de células-tronco do câncer de miR-199b-5p.

Resultados

HSA-miR-199b- 5p silêncios HES1 expressão via 3’UTR ligação

o

in silico

análise da miRBase alvo banco de dados [27] foi dirigida para a identificação de miRNAs potencialmente alvo HES1, um efetor da via Notch , um mecanismo fundamental na regulação da proliferação de células de MB. -MiR-199b 5p e miR-199-5p foram os melhores miRNAs de pontuação, e foram previstos para vincular o 3’UTR do ser humano bHLH HES1. Estamos focados em miR-199b-5p devido à sua capacidade de diminuir a expressão HES1 sob transitórias de expressão, em comparação com o miR-199-5p (Texto S1, Fig. S1A, B). MiR-199b-5p é perdida em tumores pulmonares [28] e de ter sido mapeada para uma região genómica suprimido no cancro da bexiga [29]. MiR-199 * (também conhecido como o miR-199-5p, e com uma sequência idêntica a miR-199b-5p) também é reduzido em carcinoma hepatocelular [30] – [32]. A análise da expressão de miR-199b-5p em duas linhas celulares MB, tecido humano adulto e cerebelo do rato, é mostrado em texto S1, Fig. S1C, D e S2A, B.

Para determinar se HES1 é um alvo de miR-199b-5p, o HES1 3’UTR foi clonado a jusante de um vector de gene repórter de luciferase; pré-miR-199b-5p também foi clonado num vector de expressão de mamífero (ver texto S1). As células HEK-293 foram então transfectadas com a actividade de luciferase relativa mostrando que o miR-199b-5P co-transfecção diminuição da actividade do gene repórter, indicando assim ligação com o 3 ‘UTR e a desestabilização da tradução produtiva de ARNm de luciferase (Texto S1, Fig. S1E ). Como controlos, HES1 3’UTR mutado no sítio de ligação de miR-199b-5p não foi afectada por miR-199b-5p (Texto S1, Fig. S1E), e quando um oligorribonucleótido 2-O’-metil (2-OM) complementar a amadurecer o miR-199b-5p foi co-transfectado, que neutralizou os efeitos da transfecção de miR-199b-5p, restaurar a actividade repórter (Texto S1, Fig. S1E). Resultados semelhantes foram obtidos em células Daoy MB (Texto S1, Fig. S1F).

Para determinar o papel de miR-199b-5p em biologia celular MB, a construção de expressão de miR-199b-5p foi transfectado em Daoy foram seleccionados células, e vários clones estáveis ​​que sobre-expressam o miR-199b-5p. A sobre-expressão foi confirmada por PCR em tempo real (Texto S1, Fig. S1G). Três clones demonstraram uma redução níveis de proteína HES1, um dos quais (199bSC1) não mostrou HES1 detectável. Os clones 199bSC1 e 199bMC1 foram selecionados para uma investigação mais aprofundada (Texto S1, Fig. S1H). Estes efeitos de miR-199b-5p na expressão da proteína HES1 não se restringiram aos clones estáveis ​​ou células Daoy, como células D283MED transitoriamente transfectadas com a construção de expressão para miR-199b-5p também mostrou níveis HES1 reduzidas (Texto S1, Fig. S1B ).

para fortalecer estes resultados, o clone 199bSC1 foi transfectada com 2-OM anti-sentido para miR-199b-5p e usado como um controlo negativo (Texto S1, Fig. S1I). Aqui, os níveis HES1 foram restaurados, sugerindo bloco 2-OM de HES1 repressão por miR-199b-5p, proporcionando mais uma confirmação de que as metas de miR-199b-5p HES1 diretamente. Outros alvos potenciais de miR-199b-5p também foram investigados neste caminho (S1 textos, a Fig. S2C, D).

A sobre-expressão de miR-199b-5p reduz a proliferação celular e prejudica o potencial clonogénico de linhas celulares MB

os clones 199bSC1 e 199bMC1, redução nas taxas de proliferação sob condições de cultura convencionais, quando comparado com o clone de controlo. Assim, nós olhamos para os potenciais alterações do ciclo celular nestes clones. A análise FACS em 199bSC1 o clone revelou uma diminuição de 31% em fracções de fase S e um aumento nas células em G0-G1, de 15%, quando comparado com o clone de vector vazio (Fig. 1A). Isto sugeriu que saem do ciclo celular tem um papel na taxa de proliferação reduzida de células do clone 199bSC1 Daoy. Em contraste, o clone 199bMC1 não mostraram alterações significativas no seu ciclo celular. Acreditamos que essas descobertas para ser devido a uma menor eficiência global da 199bMC1 para reduzir os níveis de proteína HES1. Estes fenótipos do ciclo celular traduzidas em taxas de proliferação diminuição

in vitro

, avaliada pelo

in-vitro

ensaios de proliferação comparando os clones 199bSC1 e 199bMC1 com um clone empty-vector e uma transfectante transiente para 2-OM concebidos contra o miR-199b-5p (Fig. 1B). Tanto o 199bMC1 e os clones apresentaram 1999SC1 marcadamente reduzida taxa de proliferação. A transfecção deste anti-sentido 2-OM induzida por um aumento marcante na proliferação do clone 199bSC1 estável, de acordo com os níveis de expressão restaurada de HES1. Estes resultados sobre a proliferação celular Daoy foram confirmados também com D283 e ONS76 células (Texto S1, Fig. S2F). Os efeitos de miR-199b-2-OM específica também foram confirmados em células Daoy de tipo selvagem, em que potencialmente actua sobre o endógena miR-199b (Texto S1, Fig. S2G).

A) representativas FACS análise com iodeto de propídeo mostrando uma diminuição nas percentagens de células em fase S e um aumento na G0-G1 para a 199bSC1 clone estável. A ausência de sinais de ombro com o pico vermelho G0-G1 nos clones 199bSC1 e 199bMC1 exclui processos apoptóticos. B) Proliferação ensaios de 3-4,5-dimetiltiazol-2-il-5-3-carboximetoxifenil-2-4-sulf of enil-2H-tetrazólio (MTS), que mostra a diminuição da taxa de proliferação do clone 199bSC1 estável (triângulos vermelhos) e o clone 199bMC1 (cruzes verdes), em comparação com o clone estável com o vector vazio sozinho (diamante azul). Este efeito de miR-199b-5p sobre-expressão foi reduzido por 2-OM transfecção (quadrados rosa). Os dados apresentados são médias ± DP de duas experiências independentes, cada uma realizada em triplicado. C) a expressão de ARNm Rapresentative de diferenciação (por exemplo Mash1, MATH3 e neurogenin 2) e a proliferação (por exemplo c-myc, a ciclina D1) marcadores de cima do miR-199b-5p sobre-expressão, como revelado por PCR em tempo real, comparando o 199bSC1 estável e clones 199bMC1 com o clone de vector vazio. D) O clone 199bSC1 estável para miR-199b-5p mostra a formação de colónias prejudicada em ensaios de agar mole. A trama mostra colônias contadas como médias ± DP de três experiências independentes, cada uma realizada em triplicado. E) de transferência de Western utilizando anticorpos representativas D1 anti-ciclina anti-c-myc e mostram estas duas proteínas a ser sub-regulada no clone 199bSC1 estável; veja também a análise densitométrica no painel da direita. F) Tal como para E, mostrando proteínas GABRA6 e MATH3-reguladas após expressão miR-199b, o que sugere a indução de diferenciação. Os anticorpos anti-laminina-p foram usadas para expressão nuclear normalizada proteína c-Myc e ciclina D1. Os anticorpos anti-β-actina foram usadas para GABRA6 citoplasmática normalizada e MATH3 proteínas expressão.

Os efeitos da indução de miR-199b-5p foram avaliados nos marcadores moleculares da proliferação e diferenciação de uma real abordagem de tempo. Como ilustrado na Fig. 1C, MAP2, que é principalmente expressa em neurônios maduros [33], foi regulada nos clones 199bSC1 e 199bMC1 estáveis. Do mesmo modo, células Daoy foram relatados para expressar a GFAP após a diferenciação com fenilbutirato [34], e no clone 199bSC1 estáveis, os níveis de GFAP foram aumentadas. No geral, a imagem da expressão do gene em nossa linha celular estável sobre-expressão de miR-199b-5p está de acordo com o fenótipo que foi visto no cérebro do

Hes1 – /-

rato [23]. Entre os outros genes, GABRA6, um marcador de diferenciação de células de grânulos de cerebelo, também foi significativamente sobre-expressa nos clones estáveis ​​(Fig. 1C).

Uma cascata de ajuste entre a factores de transcrição bHLH positivos e negativos é central para a neurogênese, com genes tais como

Mash1

,

MATH3

e

NGN2

induzir neurogênese, e os ratos HES1 mutantes que mostram aumento da regulação destes bHLHs do tipo ativador [ ,,,0],35]. Ambos os clones estáveis ​​miR-199b-5p mostrou aumentos na expressão de bHLH pró-neural. De acordo com a sua redução na taxa de proliferação, os marcadores de proliferação de c-Myc e ciclina D1 foram diminuídos. Dos dois clones analisados, 199bSC1 apresentaram o fenótipo mais consistente; vamos explicar esses resultados pelo silenciamento HES1 mais eficiente neste clone.

Uma vez que o clone 199bSC1 estável miR-199b-5p mostrou um fenótipo mais forte e mais consistente, o próximo examinou-o em um ensaio clonogênica padrão, para determinar se o crescimento independente da ancoragem foi afectada por miR-199b-5p. Aqui, houve uma redução de 80% no potencial de formação de colónias, em comparação com o clone do vector vazio (Fig. 1D). De acordo com esta redução na taxa de proliferação, os marcadores de proliferação de c-Myc e ciclina D1 foram reduzidos (Fig. 1E). Nós também confirmado a nível proteína que GABRA6 e MATH3 foram regulados positivamente no clone 199bSC1 (Fig 1F.); o último é conhecido por ser reprimido directamente por HES1 [35].

miR-199b-5p esgota o compartimento população lado na linha de células Daoy, e regula negativamente a populações de células-tronco tumorais MB

a via de Notch tem sido associada com a fracção de células tumorais MB que abrigam os marcadores de células estaminais precursoras [36], e HES1 tem um papel na auto-renovação de células progenitoras multipotentes [23]. Esta população lateral (SP) de células de tumor tem um papel no enxerto de um tumor em modelos animais [37]. Temos, assim examinada a influência de miR-199b-5p na população de células de tumor que excluem o corante Hoechst 33342, uma estratégia para identificar essas células SP. Isto foi determinado por citometria de fluxo na linha de células Daoy, a SP de qual é responsável por um máximo de 4,9% das células, em comparação com as células tratadas com verapamilo (o controlo negativo) (Texto S1, Fig. S3A, B). Este tratamento verapamil foi baseada na inibição de verapamil do ião-bombas responsável pela Hoechst 33342 exclusão de corante, possibilitando assim que as células SP para ser visto [38]. Coloração de células 199bSC1 e 199bMC1 indicou que o SP foi ablação, como havia perto de não haver diferenças entre a amostra tratada Hoechst ea Hoechst além de amostras verapamil (Texto S1, Fig. S3C-F).

também é conhecido que as células estaminais tumor do sistema nervoso central expressar o antigénio CD133, e que estas células são exclusivamente capazes de formação de tumores em ratinhos NOD-SCID [18], [39]. Além disso, a via de Notch tem um papel central no processo de auto-renovação, com a sua inibição conduz à depleção de células CD133-positivo (CD133 +) Daoy através da indução de apoptose de células progenitoras semelhantes a [36]. Recentemente, foi demonstrado que as células CD133 + Daoy promover o crescimento do tumor no flanco de ratinhos nus, enquanto que as células não CD133- [40]. Por estas razões, foi avaliada a positividade CD133 de células Daoy, em comparação com os 199bSC1 estáveis ​​e 199bMC1 clones (Fig. 2). Aqui, as células do tipo selvagem foram de 14,8% CD133 +, enquanto que nos clones estáveis ​​199bMC1 199bSC1 e esta foi reduzida para 2,4% e 6,5% CD133 +, respectivamente (Fig. 2C-F). Isto demonstrou, assim, um papel para miR-199b-5p na regulação negativa da fracção de células tumorais de iniciação.

A-F) análises representativas por FACS do 199bSC1 estável (D) e os clones 199bMC1 (F) mostrou uma diminuição na percentagem de células que eram positivas para o marcador de células estaminais CD133 (B); A, C e E são controlos negativos (sem anticorpos).

HES1 sobre-expressão resgata o clone fenótipo miR-199b-5p

Para confirmar que o fenótipo celular está directamente correlacionada com a regulação negativa da HES1, foi realizada

in vitro

experimentos com células-resgate. Nós escolhemos para resgatar o fenótipo mais consistente, mostrado pelo clone 199bSC1 estável. Quando HES1 ADNc de comprimento completo foi clonado e transfectado para o clone de células Daoy 199bSC1 estável, expressão HES1 foi restaurada, como avaliada por imunotransf erência (Fig. 3A). Notamos também a re-expressão da ciclina D1, que foi regulada para baixo no clone 199bSC1 estável. HES1 expressão restaurada também reverteu os efeitos de miR-199b-5p sobre a proliferação celular (Fig. 3B). Ao mesmo tempo, a transfecção de ADNc no clone HES1 199bSC1 diminuiu a indução de bHLHs pró-neurais e marcadores de diferenciação, e o aumento dos níveis de genes de proliferação (Fig. 3C). Além disso, a transfecção transiente de ADNc no clone HES1 199bSC1 estável conduziu a um aumento na percentagem de células em fase S, e uma remoção do bloco na fase G0-G1 (Fig. 3D). Este foi oposta aos efeitos observados no clone 199bSC1 estável que sobre-expressam o miR-199b-5p (ver Fig. 1C e a Fig. 3C). Os efeitos de expressão restaurada de HES1 na SP do clone 199bSC1 estáveis ​​também foram avaliados. Quando as células transfectadas HES1 (GFP positivo) foram avaliados quanto à sua capacidade de excluir corante Hoechst, eles mostraram um aumento mínimo no SP, de até 1,3%. Embora maior do que o medido para os clones estáveis ​​199b (Fig. 3E-H), esta ainda estava abaixo do nível de células SP para as células do tipo selvagem (Texto S1, Fig. S3). Isto é provavelmente devido ao curto tempo de re-expressão de HES1 após a transfecção transiente, o que pode não ser suficiente para permitir que para o salvamento fenótipo completo. Em seguida, tentou resgatar os efeitos sobre o compartimento de CD133; no entanto, a transfecção transiente de HES1 no clone 199bSC1 não resultou num aumento significativo em células CD133 +. Acreditamos que este é devido ao tempo de transfecção transiente curto, o que não permite uma re-organização da hierarquia de células Daoy.

A) Western blot Representante e análise densitométrica mostrando que o resgate de expressão HES1 por excesso expressão de ADNc HES1 na 199bSC1 clone estável restaura a expressão da ciclina D1. B) Ensaio de Proliferação por 3-4,5-dimetiltiazol-2-il-5-3-carboximetoxifenil-2-4-sulf of enil-2H-tetrazólio (MTS), mostrando aumento da taxa de proliferação do clone de expressão estável com 199bSC1 HES1 (escuro quadrados azuis), comparado com o clone 199bSC1 estável sozinho (a luz diamantes azuis). Os dados apresentados são médias ± DP de duas experiências independentes, cada uma realizada em triplicado. C) a expressão de ARNm Rapresentative de diferenciação (por exemplo Mash1, MATH3 e neurogenin 2) e a proliferação (por exemplo c-myc, a ciclina D1) marcadores sobre células-salvamento com HES1 na 199bSC1 clone estável, em comparação com as células de tipo selvagem, como revelado pela PCR em tempo real. A expressão de Gabra 6 e MAP2 são regulados negativamente no experimento de resgate. D) representativas análise FACS do clone 199bSC1 estável HES1-expressando mostra um aumento na fracção de células em fase S, e uma diminuição no G1, em relação ao clone 199bSC1 estável por si só. E-H) O efeito da expressão de miR-199b-5p na SP de células Daoy é invertida por HES1 re-expressão. 199bSC1 clone estável foi transfectada com ADNc HES1 e um plasmídeo codificante de GFP, depois tratou-se depois de 48 horas com Hoechst e verapamil (E-F) ou a Hoechst sozinha (G-H) e analisadas por FACS. As células positivas para GFP (P5) de porta, painel E e G, foram analisados ​​para a presença de corante-excluindo-células (M-H, P6 portão). As células negativas GFP não transfectadas (porta P3), não foram analisados.

O crescimento do tumor é reduzido em xenotransplantes derivados do estábulo 199SC1 clone

Os resultados aqui indicaram que miR-199b- 5p é um potencial inibidor da formação de tumores. Por conseguinte, para investigar o papel de miR-199b-5p num

In vivo

modelo de tumor, que estabilizou a 199bSC1 e controlar Daoy clones com um vector de expressão portador do cDNA de luciferase. Os clones obtidos foram testados para os níveis de expressão de luciferase e também validado para a retenção do fenótipo parental, tanto em termos de HES1 e expressão de miR-199b-5p (ver texto S1, Fig. S4A-D). Estes clones 199B-Luc1 e CTL-Luc-4 Daoy estáveis ​​foram então injectada nos flancos esquerdo e direito, respectivamente, de cinco ratinhos nus /nus atímicos. O crescimento do tumor foi avaliada por semana

in-vivo

bioluminescência imagem (BLI) de camundongos injetados. Aos oito semanas, todos os ratinhos apresentaram massas visíveis em cada flanco de controlo, enquanto apenas três flancos injectados com 199b-Luc1 mostrou enxerto do tumor. Em geral, uma diferença significativa no volume do tumor entre os flancos de controlo e flancos miR-199b-5p foi observada (Fig. 4A). As medições de bioluminescência mostraram reduções significativas das emissões para os lados de miR-199b-5p durante o crescimento do tumor, em comparação com os lados de controlo (por exemplo, rato # 4, Fig. 4B). Depois de nove semanas, quatro dos cinco ratos mostraram diferenças estatisticamente significativas nestes sinais de bioluminescência entre os lados de controle e os lados contra miR-199b-5p (Fig. 4C). Tomados em conjunto, estes dados mostram que miR-199b-5p pode prejudicar a formação de tumores

in vivo

em ratinhos nus /nus atímicos. Os tumores de xenoenxerto de mouse # 5 e mouse # 4 foram explantados e analisadas para miR-199b-5p e expressão HES1 e avaliados histopatologicamente (Texto S1, Fig. S4E-H).

A) experimento Xenoenxerto mais de nove semanas, seguindo SC injeção de cinco ratos com células controle Daoy (laterais CTR) e células Daoy sobre-expressão de miR-199b-5p (lado 199b). Com células CTR, os tumores eram detectáveis ​​macroscopicamente em 5/5 ratos; com as células que sobre-expressam, em 3/5 ratinhos. Diferença total de volume de tumor entre a CTR e 199b injetado lados depois de nove semanas de crescimento foi estatisticamente significativa, como indicado (média ± SD). B) por emissão de fóton de mouse # 4 após nove semanas de crescimento do tumor. O lado 199b (199bLuc-1) tinha uma emissão de fotões consistentemente mais baixa do que o lado de controlo (CTL-Luc-4). As comparações das dimensões do tumor também são mostrados. C) quando a emissão de fotões (ver B) foi convertido no número de células; um dos cinco ratos não apresentaram diferenças significativas (médias ± SD) (bicaudal não pareado

t

teste). D) por emissão de fóton de 3 ratos injectados no quarto ventrículo, com respectivamente: 199bLuc-1, Ctl-Luc-4 infectadas com AdV5 simulada, e CTL-Luc-4 infectado com um miR-199b-5p AdV5. E) do cérebro inteiro do animal e do local da injeção (seta branca). coloração com hematoxilina /eosina de cerebelo; seta preta, local de início de tumorigênese. F) BLI de ratinhos injectados como em D, após um mês de crescimento do tumor. As diferenças entre os grupos são estatisticamente significativas. G) BLI de dois camundongos selecionados mostrando desenvolvimento de carga tumoral com CTL-Luc4-AdV5-Mock # 7, e redução com CTL-Luc4-AdV5-199b nº 3 ao longo do tempo (0-8 semanas). H) coloração de hematoxilina-eosina de cerebelo de AdV5-Mock # 2 e # 3 AdV5-199b animais com 10 semanas de injeção de pós ortotópico, mostrando células tumorais vizinhas camada granular externa e dentro do ventrículo IV (estrela branca). Em azul, coloração DAPY, juntamente com detecção de GFP. Ampliação como indicado.

Para investigar ainda mais a capacidade de miR-199b-5p para regular o crescimento MB, injetamos o clone estável 199bSC1 ortotopicamente para o quarto ventrículo de ratos sem pêlo de 5 semanas de idade (Fig . 4D, E). Depois de quatro semanas de

In vivo

monitorização do crescimento do tumor não-invasivo pela BLI, em ratinhos injectados com a 199bSC1 clonar o crescimento do tumor foi consideravelmente inferior do que a observada no controlo (CTL) lado -cells-injectado. Como confirmação destes efeitos, nós também injetaram as células CTL infectados com uma codificação adenovírus para miR-199b-5p: de acordo com os achados anteriores, estes ratos também mostraram redução BLI após 4 semanas (Fig 4F.). Mais aquisições BLI após 8 semanas de implantação das células são mostradas na Figura 4G. Nesta altura, dois ratos foram sacrificados e posteriormente analisados ​​para histopatologia. coloração hematoxilina-eosina de tecidos congelados mostrou massa tumoral no cerebelo de AdV5-Mock # 2 e # 3 AdV5-199b injetado animais. secções histológicas congeladas paralelas em série foram examinadas por microscopia de fluorescência para a proteína endógena de fluorescência verde (GFP), expressa por células infectadas com adenovírus. Em seguida, avaliou-se a expressão da proteína por coloração imuno-histoquímica HES1 de outros tecidos embebidos em parafina, utilizando um anticorpo anti-HES1. Em geral, foram avaliados os níveis de persistência da expressão de adenovirus em células infectadas, como a regulação negativa da expressão HES1 devido à miR199b transportando a expressão de adenovírus, a seguir, assim, o crescimento do tumor ao longo do tempo por BLI ver Figura 4G-H, e anticorpos coloração Figura S4L -M (Hes1, Ki67, GABRA6, Nestin, Math-3, ver detalhes no texto informações S1). Em seguida, dois ratinhos nus adicionais (AdV5-Mock # 7; AdV5-199b # 5) foram submetidos a estudos PET-CT em 12 semanas após a injecção, para avaliar a atividade proliferativa do tumor (Fig. 5A, B). BLI de dados adicionais em conjunto com os dois filmes (Filme S1 e S2 do filme) que mostra a reconstrução em 3D do enxerto ortotópica são descritos no texto de informação S1 e mostrou na Figura S6. Estas análises mostraram redução significativa da massa tumoral no animal AdV5-199b # 5, em comparação com os ratos de controle # 7 AdV5-Mock, com PET-CT análises também fornecer volumes tumorais (0,024 cm

3 contra 0,044 cm

3, respectivamente), tal como descrito no texto S1. No geral, estes dados indicam um efeito benéfico da sobre-expressão de miR199b-5p, como um regulador negativo do crescimento do tumor de células MB neste modelo nude-rato xenotransplante ortotópico.

imagens de fusão PET-CT de AdV5- Mock # 7 (a) e AdV5-199b # 5 (B) ratos com 12 semanas de cirurgia e injecção, com renderização de volume 3D e exibição simultânea de áreas de FLT captação (azul-verde, setas brancas). Um defeito ósseo mais ampla na porção occipito-parietal do crânio é aparente no nº 7 do mouse AdV5-Mock. Abaixo:. Tabela de medidas (cm

3) de tumor em massa realizadas com aquisição PET-CT (como descrito no texto S1)

A expressão de miR-199b-5p em tumores de meduloblastoma humanos

para determinar se o miR-199b-5p é eficazmente expresso em cerebelos pediátrica humano saudável, utilizou-se 13 amostras de controlo obtidas a partir do tecido cerebral e NICHD Banco para alteração do desenvolvimento, da Universidade de Maryland, EUA. Nós medimos a expressão de miR-199b-5p, comparando cinco amostras cerebelo obtidos de crianças 0-1 anos de idade, com seis de crianças 13-16 anos de idade (Fig. 6A). MiR-199b-5p apresentou maior expressão nos explantes dos controles saudáveis ​​mais jovens (teste de Mann-Whitney,

P

= 0,006).

A) Box-plot dos níveis de miR- expressão 199b-5p no cerebelo humano saudável nas duas faixas etárias indicadas. MiR-199b-5p mostrou maior expressão em explantes de controles mais jovens (teste de Mann-Whitney,

P

= 0,006). B) miR-199b-5p altamente expressar casos são na sua maioria M0

P

= 0,001 (teste de Pearson Chi-Square). estimativas C) de Kaplan-Meier de sobrevida comparando pacientes com baixos níveis de

contra

alta (em relação à mediana) de expressão de miR-199b-5p (45 pacientes com dados de acompanhamento disponíveis). D) expressão miR-199b-5p por PCR em tempo real em um painel de linhas de células não tratadas ou cinco MB tratados com 5-Aza-C (DAC – /+); Como mostrado na Fig.