Abstract

Fundo

epitelial para mesenquimal (EMT) induzida pela hipoxia é uma das principais causas do insucesso do tratamento em diferentes tipos de cancros humanos. NF-kB está intimamente envolvida na progressão da EMT. Comparado com HIF-1α, a correlação entre a NF-kB e EMT durante a hipóxia tem sido menos estudado, e, embora o fenômeno foi observado no passado, os mecanismos moleculares envolvidos ainda não está claro.

Metodologia /Apreciação principais

Aqui, nós relatamos que a hipóxia ou superexpressão de fator-1α hipoxia-inducible (HIF-1α) promove EMT em células de câncer de pâncreas. Por inibição farmacológica molecular ou de NF-kB, células hipóxicas recuperou a expressão de E-caderina, perdeu a expressão de N-caderina, e o seu fenótipo atenuado altamente invasiva e resistentes a fármacos. Apresentando um pcDNA3.0 /HIF-1α em células de câncer de pâncreas em condições de normóxia aumentou a atividade de NF-kB, phenocopying efeitos EMT produzidos pela hipóxia. Por outro lado, a inibição da actividade de NF-kB intensificada nesta configuração atenuou o fenótipo EMT.

Conclusões /Significado

Estes resultados sugerem que a hipoxia ou a sobre-expressão de HIF-1α induz o EMT que é em grande parte dependente na NF-kB em células de câncer de pâncreas

Citation:. Cheng ZX, Sun B, Wang SJ, Gao Y, Zhang YM, Zhou HX, et al. (2011) Nuclear Factor de-kB-Dependent epitelial para mesenquimal Transição induzida pela ativação HIF-1α em células do cancro do pâncreas sob condições hipóxicas. PLoS ONE 6 (8): e23752. doi: 10.1371 /journal.pone.0023752

editor: S. K. Batra, University of Nebraska Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 20 Abril de 2011; Aceite: 23 de julho de 2011; Publicação: 22 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Cheng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações da Fundação New Century Suporte para elitista do Ministério chinês da Educação (NCET-07-0248), a Fundação Científica para Prominent Juventude da Província de Heilongjiang, China (JC200717), o Projeto Científico e Tecnológico da Província de Heilongjiang, China (GC09C407-2) e da Fundação Nacional Natural Científico da China (30571808, 30872987). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas, que é um dos cancros mais agressivos e letais em todo o mundo, é altamente resistente à quimioterapia [1]. Mesmo terapia sistêmica com gemcitabina, uma corrente de tratamento de primeira linha para o câncer de pâncreas avançado oferece apenas modesto benefício devido à chemoresistance intrínseca ou adquirida [2], [3]. Além disso, estudos clínicos recentes indicam que apenas 12% dos pacientes com câncer pancreático avançado têm uma resposta à gemcitabina [4]. A taxa de resposta pobres sugere que o câncer de pâncreas, quer se desenvolve rapidamente ou tem gemcitabina chemoresistance. Os mecanismos pelos quais chemoresistance surge no câncer de pâncreas são desconhecidos; assim uma melhor compreensão de como a resistência surge e quais são as alterações molecular provocar ou correlacionar-se com a resistência é susceptível de conduzir a novas estratégias terapêuticas para o câncer de pâncreas.

A hipoxia é um estímulo ambiental que desempenha um papel fundamental na progressão do desenvolvimento e câncer . hipoxia tumoral ou expressão de HIF-1 (hipoxia-inducible factor-1) tem sido associada a um fenótipo agressivo que se correlaciona com uma baixa resposta a quimioterapia e a sobrevivência global dos doentes com cancro pior [5], [6]. HIF-1 é uma proteína heterodimérica que consiste em HIF-1β, uma subunidade constitutivamente expresso, e HIF-1α, uma subunidade indutível sensível ao oxigénio. Sob condições de normóxia, proteína HIF-1α é hidroxilado por uma família de hidroxilases prolil-dependente de oxigénio (PHD1-3); este segmente para polyubiquitination por um complexo de proteína contendo proteína de von Hippel-Lindau (pvhl) e, em seguida, a degradação. Em condições de hipóxia, hidroxilases prolil são inativados e degradação HIF-1α é bloqueado; isto permite que o HIF-1α a acumular-se e associado com o HIF-1β para formar um complexo de transcrição funcional que desencadeia a transcrição de uma série de genes indutíveis por hipoxia [7].

epitelial para mesenquimal (EMT) é a processo pelo qual as células epiteliais aderentes converter a motilidade das células mesenquimais e é essencial para o desenvolvimento embrionário. EMT é agora conhecido por também ocorrer numa variedade de doenças, incluindo a progressão do cancro [8]. No estudo recente, a prova é fornecida sugerindo que condições de hipóxia moderada pode desencadear, como fator independente, um programa EMT levando diferentes células cancerígenas humanas para aumentar significativamente a capacidade de invasão [9]. Enquanto isso, alguns estudos também relataram que a ativação de NF-kB está intimamente envolvida na progressão da EMT [10] – [13]. exames detalhados das múltiplas facetas do programa de EMT revelaram seu envolvimento em mais do que apenas invasão e metástase; Estudos recentes demonstraram que o fenótipo de EMT está associada com quimiorresistência em diversos tumores sólidos [14] – [17]

factor nuclear kappa B (NF-kB) representa uma família de factores de transcrição que modulam a expressão de. genes com funções diversas. A actividade de NF-kB é regulada pela proteína inibidora de NF-kB (IkB), que se liga a e sequestra membros da família NF-kB, no citoplasma. Quando a via de NF-kB é activado, IkB é fosforilada pela cinase IkB (IKK), que fosforila IkB. Fosforilada IkB é submetido a ubiquitinação e degradação mediada por proteassoma, o que resulta na translocação de NF-kB para o núcleo. NF-kB é um factor de transcrição ubíqua regulada por diversos estímulos incluindo hipoxia, citocinas e drogas quimioterapêuticas, e tem emergido recentemente como um alvo para o cancro. O NF-kB é activado constitutivamente na maioria das células de cancro pancreático humano e amostras de tumor primário, mas não em tecidos normais do pâncreas ou linhas de células não tumorigénica [18] – [20]. Alguns estudos recentes mostraram que a hipóxia pode activar NF-kB e induzir a resistência de células de cancro pancreático à gemcitabina [21] – [23]. Anteriormente, nós informamos que o uso de Dihidroartemisinina ou pequeno RNA de interferência (siRNA) inactiva NF-kB e potencia o efeito antitumoral da gemcitabina no cancro do pâncreas tanto in vitro como in vivo [24], [25].

Neste estudo, buscou evidências de que as células de câncer de pâncreas (PANC-1, BxPC3) sob condições de hipóxia se submetem ao processo de EMT e adquirir fenótipos invasivos e resistentes a drogas de uma forma NF-kB-dependente. Aqui, demonstramos que a hipoxia ou a sobre-expressão de HIF-1α activada de NF-kB e promovido EMT em células de cancro pancreático. Por inibição farmacológica molecular ou de NF-kB, células hipóxicas recuperou a expressão de E-caderina, perdeu a expressão de N-caderina, e o seu fenótipo atenuado altamente invasiva e resistentes a fármacos. Apresentando um pcDNA3.0 /HIF-1α em células de câncer de pâncreas em condições de normóxia aumentou a atividade de NF-kB, phenocopying efeitos EMT produzidos pela hipóxia. Por outro lado, a inibição da actividade de NF-kB intensificada nesta configuração invertida do fenótipo EMT. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a hipoxia ou a sobre-expressão de HIF-1α induzir a EMT que é em grande parte dependente de NF-kB em células de câncer de pâncreas.

Resultados

Resultados da hipóxia na morfológica e celular mudanças biológicas características de EMT em células de câncer de pâncreas

para recapitular os efeitos da hipoxia como ocorre em câncer pancreático, expusemos 55-60% de células de câncer de pâncreas confluentes (PANC-1, BxPC-3) para condições de hipoxia (1% de O

2, 5% de CO

2, e 94% de N

2) até 48 h. Observamos diferenças marcantes na morfologia e tendência para formar ninhos celulares ou clusters entre as células de câncer pancreático em condições de hipóxia e os seus homólogos norm�icas (95% de ar e 5% de CO

2). As células normóxicas exibiu uma forma poligonal e folhas de paralelepípedo semelhante, indicativo de um fenótipo epitelial. Em contraste, as células hipóxicas começou a perder contactos celulares, a partir de cachos de células dispersas e adquiriu uma morfologia alongada, fusiforme com processos dendríticos, consistente com um mesenquimal (Fig. 1B).

(A) análise de transferência de Western de marcador epitelial (e-caderina) e marcadores mesenquimais (vimentina, N-caderina) e HIF-1α de PANC-1, BxPC-3 células sob normóxica (N) ou hipóxico (h) condições durante 48 h. Uma mancha representativa de três experiências independentes foi mostrado. O histograma mostrou a densidade média de volume corrigido para o controlo de carga (β-actina). *,

p Art 0,05. Análise (B) contraste de fase (aumento original, 100x) de diversas alterações morfológicas em células de cancro do pâncreas sob condições de hipóxia ou de normóxia durante 48 h. (C) Immuofluorescence coloração de E-caderina e vimentina em PANC-1, BxPC-3 de células sob condições de hipóxia ou de normóxia durante 48 h. O verde representa a coloração E-caderina, enquanto que o vermelho representa coloração Vimentin. sinal azul representa coloração DNA nuclear por DAPI. (D) A viabilidade das células foi avaliada por meio do Kit de ensaio de células-8 de contagem e usada para calcular o índice de viabilidade. células PANC-1 e BxPC-3 foram expostos a gemcitabina (0 nmol /L) durante 48 h, como a linha de base. *,

p Art 0,05. (E) A proliferação de células foi medida por ensaio de violeta de cristal. As figuras foram seleccionados como representativos cenas de três experiências independentes. ensaio de invasão (F) Matrigel. Esquerda, fotomicrografias de células que passaram por Matrigel em condições de normóxia ou hipóxia por 48 h (ampliação original, × 100). Certo, quantificação de invasão. *,

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Para confirmar se as células cancerosas do pâncreas EMT submetidos expostos à hipoxia, nós também determinada a expressão de marcadores de células epiteliais e mesenquimais fenótipos por análise de Western blot . Como mostrado na Fig. 1A, as células hipóxicas foram submetidos a um “switch caderina”, na qual manifestaram reduzida expressão da caderina-E e aumento da expressão N-caderina. Além disso, a expressão de HIF-1α, um importante marcador de percurso hipoxia, foi encontrado intensamente expressos sob condições hipóxicas durante 48 h (Fig. 1a). imunofluorescência foi empregado para confirmar ainda mais EMT mudanças fenótipo de células de cancro do pâncreas sob condição hipóxica. Foi mostrado que a expressão de E-caderina diminuiu e o aumento da expressão de vimentina, quando comparado com aqueles em células normóxicas (Fig. 1C).

As células cancerosas que tenham sido submetidos a EMT tendem a apresentar uma maior resistência à droga e invasividade . Como tal, nós examinamos essas propriedades em células norm�icas contra células hipóxica em celular Counting Kit-8 do ensaio, ensaio de violeta cristal e ensaio de invasão Matrigel. Foram observadas diferenças marcantes. Contagem celular Assay Kit-8 foi utilizado para avaliar a taxa de viabilidade celular. células PANC-1 e BxPC-3 foram expostos a doses de gradiente de gemcitabina (0-200 nmol /L) durante 48 h. Os dados são mostrados na Fig. 1D, quando tratados com uma concentração de gemcitabina maior do que 100 nmol /L, células hipóxicas mostraram significativamente maior taxa de viabilidade das células do que as células normóxicas. Estes resultados foram confirmados por ensaio de violeta de cristal (Fig. 1E), quando as células foram tratadas com gemcitabina (10 pmol /L para PANC-1 e 500 nmol /L para BxPC-3) sob hipóxica ou condições de normóxia durante 48 h, hipóxicas células mostraram significativamente maior taxa de viabilidade celular de células normóxicas. ensaio de invasão de Matrigel foi utilizado para avaliar a capacidade de invasão de células. Ambos PANC-1 e BxPC-3 de células sob condições hipóxicas durante 48 h prontamente migraram através da câmara de Matrigel em números relativamente elevados, enquanto que os seus parceiros de normóxia exibiram uma redução acentuada na invasão (Fig. 1F).

Tomados em conjunto , nossos dados indicam alterações na morfologia, padrão de crescimento, a expressão da proteína, resistência aos medicamentos e invasão apoiar a noção de que a hipóxia leva a EMT em células de câncer de pâncreas.

células cancerosas do pâncreas em condições de hipóxia exposição aumentou a atividade de NF-kB

Alguns estudos têm mostrado previamente que os resultados de hipoxia na activação de NF-kB [19], [20]. Assim, buscou-se determinar se a EMT observada em células de câncer de pâncreas em condições de hipóxia foi atribuível à elevada atividade de NF-kB. Em primeiro lugar, nós documentado que as proteínas p65 de NF-kB e a actividade de ligação de NF-kB de ADN foram mesmo aumentado em células de cancro do pâncreas hipóxicas em comparação com os homólogos de normóxia como determinado por análise de Western blot e EMSA. Enquanto isso, o HIF-1α foi também analisada por análise de transferência de Western (Fig. 2A). células PANC-1 e BxPC-3 foram incubadas sob condições de hipóxia para diferentes períodos de tempo (24 h, 48 h, 72 h). Após cada período de incubação indicado, as células foram recolhidas, e as proteínas totais foram extraídas ou nucleares. Como mostrado na Fig. 2A e B, NF-kB p65 proteínas e actividade de ligação de NF-kB de ADN foram aumentados de 24 h após o início da hipoxia e manter níveis elevados. A especificidade de bandas deslocou-gel no EMSA foi documentada por experiências de competição a frio, em que o excesso de frio de tipo selvagem mas não frio kB sonda mutante anulou os sinais a partir das bandas desviadas

PANC-1 e BxPC-. 3 As células foram cultivadas sob normóxica (N) ou condições de hipóxia (h) para vários períodos (24 h, 48 h, 72 h). Após cada período de incubação indicado, as células foram recolhidas. extractos nucleares e extratos de proteínas totais foram preparados. (A) NF-kB p65 e HIF-1α foram analisados ​​por análise de Western blot a partir de homogeneizado de células respectivos. O histograma mostrou a densidade média de volume corrigido para o controlo de carga (β-actina). *,

p Art 0,05. (B) EMSA para NF-kB atividade DNA vinculativo sobre respectivos extractos nucleares. ensaio competitivo confirmou a especificidade de ligação de NF-kB para o ADN (ver Materiais e métodos para detalhes). Direita duas pistas, em peso, de tipo selvagem; m, mutante. (C) O VEGF foi analisado por análise de Western blot a partir de homogeneizado de células respectivos. O histograma mostrou a densidade média de volume corrigido para o controlo de carga (β-actina). *,

p Art 0,05. (D) Análise de mancha de Western. Efeitos da p65 siRNA de NF-kB na expressão de VEGF de PANC-1 e BxPC-3 de células sob condições hipóxicas durante 48 h. O histograma mostrou a densidade média de volume corrigido para o controlo de carga (β-actina). *,

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Enquanto isso, HIF-1α também foi analisada por análise de Western blot. Como demonstrado por transferência de Western (Fig. 2A), níveis de proteína HIF-1α em células de cancro pancreático foram sobre-regulado durante a hipóxia. O aumento do nível de proteína HIF-1α foi possivelmente devido a efeitos de estabilidade da proteína, como anteriormente estudados [7]. Uma vez que a expressão de HIF-1α gene alvo de VEGF, um factor de crescimento que podem promover EMT, é mediado por NF-kB, que também determinar se a expressão de VEGF estimula a hipóxia. Como mostrado na Fig. 2C, transferência de Western mostraram que a expressão da proteína VEGF aumentou significativamente depois de 24 horas de hipóxia e mantidos níveis elevados. Em contraste, a sobre-regulação de VEGF foi suprimido por silenciamento de expressão p65 de NF-kB em células de cancro do pâncreas hipóxicas utilizando o siRNA específicos de p65 de NF-kB, ao passo que nenhum efeito foi observado em células transfectadas com o ARNsi de controlo (Fig. 2D) .

a inibição da actividade de NF-kB em células de câncer de pâncreas em condições de hipóxia medeia EMT

Tendo estabelecido que a hipoxia resulta em elevada atividade de NF-kB em células de câncer de pâncreas, o próximo investigou o potencial de inibição de NF-kB para atenuar as características mesenquimais de células hipóxicas. Para este fim, utilizou-se ambos os meios moleculares e farmacológicos da inibição de NF-kB nestas células hipóxicas e, em seguida, em comparação com o fenótipo resultante células tratadas com controlo. inibição molecular foi conseguida por siRNA para regular negativamente a subunidade p65 de NF-kB. Nós também usamos um bloco a atividade de NF-kB IKK inibidor BAY 11-7082 para farmacologicamente disponível no mercado. A inibição da actividade de NF-kB tanto pelo siARN p65 de NF-kB ou BAY 11-7082 sob condições hipóxicas durante 48 h resultou numa mudança na expressão de proteínas, caracterizada pelo aumento da E-caderina e reduzida expressão de N-caderina, tal como determinado por análise de Western blot (Fig. 3A), consistente com a reversão para um fenótipo epitelial. Importante, a inibição do NF-kB por qualquer siRNA p65 de NF-kB ou BAY 11-7082 levou a uma diminuição acentuada na invasividade de células hipóxicas em comparação com células de controlo tratadas no ensaio de invasão de Matrigel sob condições hipóxicas durante 48 h (Fig. 3B) . Quando as células foram tratadas com gemcitabina (10 pmol /L para PANC-1 e 500 nmol /L para BxPC-3) durante 48 h, com a inibição da actividade de NF-kB por qualquer siRNA p65 de NF-kB ou inibidor de IKK sob condições hipóxicas, eles também mostraram significativamente menor taxa de viabilidade do que seus respectivos controles em ensaio de violeta de cristal (Fig. 3C) e Cell Counting Kit-8 ensaio (Fig. 3D). Apesar destas mudanças na expressão de proteínas, invasão e resistência às drogas atribuíveis ao bloqueio NF-kB, não observamos quaisquer alterações profundas na morfologia ou crescimento padrões de células de câncer de pâncreas em condições de hipóxia, uma observação que implica eventos bioquímicos NF-kB-independentes que também contribuem para o fenótipo de EMT em células de cancro do pâncreas hipóxicas.

(a) análise de transferência de Western. Efeitos do siARN p65 de NF-kB e IKK inibidor BAY 11-7082 em N-caderina e E-caderina de PANC-1 e BxPC-3 de células sob condições hipóxicas durante 48 h. O histograma mostrou a densidade média de volume corrigido para o controlo de carga (β-actina). *,

p Art 0,05. ensaios de invasão (B) Matrigel. À esquerda, microfotografias depois que as células foram tratadas com NF-kB siRNA p65 ou BAY 11-7082 (10 mmol /L) ou respectivos controles apropriados. ampliação original, × 100. Certo, quantificação do ensaio de invasão. *,

p Art 0,05. (C) A proliferação de células foi medida por ensaio de violeta de cristal. As figuras foram seleccionados como representativos cenas de três experiências independentes. (D) A viabilidade das células foi avaliada por meio do Kit de ensaio de células-8 de contagem e usada para calcular o índice de viabilidade. *,

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células cancerosas do pâncreas sob regulação positiva condições hipóxica exposição NF-kB-dependente de Twist, reguladores de transcrição do programa EMT

o programa de expressão do gene que medeia EMT é regulada por um ou mais factores de transcrição, incluindo torção, Zeb1, Zeb2, e caracol [26]. Estes factores de transcrição influenciar a expressão de caderinas e metaloproteinases, entre outras proteínas envolvidas na EMT. Que estes factores de transcrição são transcricionalmente induzida por vias de sinalização a montante, incluindo NF-kB [26], levou-nos a observar a sua expressão diferencial em células de câncer de pâncreas em condições de hipóxia versus condições norm�icas por análise de Western blot. pancreáticas células cancerosas hipóxicas exibiu regulação positiva substancial de Twist, Caracol, Zeb1 e Zeb2, em comparação com células norm�icas (Fig. 4a). a inibição farmacológica de IKK pelo BAY 11-7082 em células hipóxicas resultou em uma diminuição dependente da dose na expressão torção mas não há mudanças notáveis ​​na Zeb1, Zeb2 ou expressão Caracol, uma descoberta que indicia o elevado estado de NF-kB como uma força bioquímica etiológico superexpressão torção subjacente em células de cancro do pâncreas, sob condições hipóxicas (Fig. 4B). Estes resultados indicam que a expressão aumentada de torção que ocorre na configuração de células de cancro do pâncreas, sob condições hipóxicas é mediada por elevada actividade de NF-kB.

(A) análise de transferência de Western da expressão da linha de base de EMT-mediar a transcrição fatores: twist, Caracol, Zeb1 e Zeb2 em células de câncer de pâncreas sob normóxica (N) versus hipóxica (H) condições para 48 h. O histograma mostrou a densidade média de volume corrigido para o controlo de carga (β-actina). *,

p Art 0,05. (B) Análise de transferência de Western. os efeitos dose-dependentes de uma exposição de 48 h da IKK inibidor BAY 11-7082 na expressão de Twist, Caracol, Zeb1 e Zeb2 em condições de hipóxia. Uma mancha representativa de três experiências independentes foi mostrado. O histograma mostrou a densidade média do volume corrigido para o controle de carga (β-actina).

A superexpressão de HIF-1α em células de câncer de pâncreas em condições de normóxia induz forma EMT na NF-kB-dependente

relatórios recentes têm estabelecido uma ligação causal entre a expressão de HIF-1α à supressão da e-caderina e aquisição de um fenótipo mesenquimal [27]. Assim, a hipótese de que o EMT que as células cancerígenas pancreáticas submeter em resposta à expressão de HIF-1α ocorre, pelo menos em parte, devido à activação mediada pelo HIF-1α da via NF-kB. Primeiro, transitoriamente introduziu um pcDNA3.0 /HIF-1α em PANC-1 sob condições de normóxia (HIF-1a

+ /N), utilizando um LipofectamineTM 2000. Considerando HIF-1α foi quase indetectável no PANC-1 sob condições de normóxia transduzidas com controle de vetor vazio (pcDNA3.0 /N), os níveis de HIF-1α em HIF-1α

células + /N eram comparáveis ​​com os das células sob condições de hipóxia para 48 h (Fig. 5a). Em seguida, confirmou-se que a atividade de NF-kB fez no aumento fato nestes HIF-1α células

+ /N do que as células pcDNA3.0 /N. Com efeito, o HIF-1α

+ /N células exibiram elevada actividade de NF-kB, tal como determinado por análise de transferência de Western e a EMSA (Fig. 5A e B).

(A) análise de transferência de Western de NF-kB p65 e HIF-1α expressão de células PANC-1 sob condições hipóxicas durante 48 h (h /48 h), as células PANC-1 transduzidas com pcDNA3.0 vector vazio (pcDNA3.0 /N) e pcDNA3.0 /HIF-1α (HIF-1α

+ /N) sob condições de normóxia por 48 h. O histograma mostrou a densidade média de volume corrigido para o controlo de carga (β-actina). *,

p Art 0,05. (B) EMSAs para actividade NF-kB de ADN de ligação em H /48 H, HIF-1α

+ /N, e pcDNA3.0 /N PANC-1 de células. Direita duas pistas, competição frio EMSA.

Tendo estabelecido que HIF-1α

aumentou a atividade de NF-kB células + /N manifesto, o próximo avaliada estas células para a evidência de EMT. Comparado com pcDNA3.0 /N células, HIF-1α

+ /N células exibiram um aumento na expressão de N-caderina e supressão da E-caderina em condições de normóxia durante 48 horas tal como determinado por análise de transferência de Western (Fig. 6A) . imunofluorescência foi empregue para confirmar adicionalmente um EMT induzida por HIF-1α sob condições de normóxia, a expressão de E-caderina diminuiu e vimentina aumento na HIF-1α

+ /N células em comparação com células de pcDNA3.0 /N sob normóxica condições durante 48 horas (Fig. 6B). Este interruptor caderina também foi associado com o aumento Twist, Caracol, Zeb1, e expressão Zeb2 (Fig. 6A), achados que são uma reminiscência daqueles observados em células de câncer de pâncreas em condições de hipóxia (Fig. 4a). O papel do NF-kB na modulação destas alterações de expressão de proteínas foi ilustrado pelos efeitos da inibição de NF-kB em HIF-1α

+ células /N em caso de exposição ao inibidor de IKK BAY 11-7082 (0-10 umol /L), que reverteu o fenômeno de comutação caderina, bem como reduziu a expressão de torção de forma dose-dependente, mas não há mudanças notáveis ​​na Zeb1, Zeb2 ou expressão Snail (Fig. 6C). Invasão e gemcitabina resistência do HIF-1α

células + /N e sua dependência de elevada actividade de NF-kB foram avaliadas em ensaio de invasão Matrigel, Crystal ensaio de violeta e contagem celular Kit-8 de ensaio. Por exemplo, a invasividade de HIF-1α

+ /N células através de uma câmara de Matrigel foi significativamente maior do que a de células de pcDNA3.0 /N sob condições de normóxia durante 48 h (Fig. 6D). Do mesmo modo, quando as células foram tratadas com gemcitabina (10 umol /L) durante 48 h sob condições de normóxia, significativamente mais elevada taxa de viabilidade celular foi mostrado em HIF-1α

+ /N células em comparação com células de pcDNA3.0 /N, como determinado por ensaio de violeta cristal (Fig. 6E) e Cell Counting ensaio Kit-8 (Fig. 6F). A invasão e gemcitabina resistência aumentada de HIF-1α

+ /N células foram revogados pelo bloqueio de NF-kB por meio de exposição ao inibidor de IKK BAY 11-7082 (10 umol /L) sob condições de normóxia durante 48 h (Fig . 6D, e e F). Assim, o aumento na capacidade de invasão e resistência gemcitabina em PANC-1 que são tipificados por hipoxia ocorre como resultado da activação da via NF-kB induzida pelo HIF-1α.

(A) análise de transferência de Western dos níveis de proteínas indicados em células PANC-1 transduzidas com vector vazio pcDNA3.0 (pcDNA3.0 /N) e pcDNA3.0 /HIF-1α (HIF-1α

+ /N) sob condições de normóxia durante 48 h. O histograma mostrou a densidade média de volume corrigido para o controlo de carga (β-actina). *,

p Art 0,05. (B) mudanças fenótipo de EMT foi confirmada com Immuofluorescence microscopia de coloração de E-caderina e vimentina. O verde representa a coloração E-caderina, enquanto que o vermelho representa coloração Vimentin. sinal azul representa coloração DNA nuclear por DAPI. (C) análise de transferência de Western. os efeitos dose-dependentes de uma 48-h de exposição ao inibidor de IKK BAY 11-7082 sobre as proteínas indicadas. O histograma mostrou a densidade média de volume corrigido para o controlo de carga (β-actina). ensaios de invasão (D) Matrigel. Efeitos de uma 48-h BAY 11-7082 (10 umol /L) na invasão de células PANC-1, sob condições de normóxia. À esquerda, fotomicrografias com aumento original de × 100; Certo, histograma para ilustrar os resultados do ensaio de invasão. *,

p Art 0,05. ensaio de violeta (E) Cristal. Efeitos de um 48 h BAY 11-7082 (10 mmol /L) na susceptibilidade gemcitabina de células PANC-1 sob condições de normóxia. As figuras foram seleccionados como representativos cenas de três experiências independentes. (F) Os efeitos de inibidor de IKK na susceptibilidade gemcitabina de células PANC-1 sob condições normóxicas também foi medida por contagem celular Kit-8 de ensaio e utilizada para calcular o índice de viabilidade. *,

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Discussão

Nos últimos anos, tornou-se cada vez mais claro que a EMT desempenha um papel importante na progressão do câncer e é também responsável pelo fenótipo de resistência das células cancerosas a agentes quimioterapêuticos convencionais [8]. Diversos factores, incluindo a hipóxia, foram indiciados como induzir este fenómeno através da indução de Twist, Caracol, Zeb1 e Zeb2 dependendo dos contextos celulares [11], [26] – [28]. A microambiente hipóxico é comumente encontrado na região central de tumores sólidos. A conexão entre hipóxia e EMT tem sido relatado anteriormente, e HIF-1α foi indiciado como mediar este fenómeno. No entanto, as bases moleculares da regulação para cima de HIF-induzida por 1α destes factores de transcrição de indução de EMT ter sido em grande parte indefinido, embora a evidência em apoio da capacidade de HIF-1α para induzir directamente a transcrição de torção tem sido descrito recentemente em células de rim embrionárias humanas [27].

estudo anterior mostrou que a hipoxia chumbo para a activação de NF-kB e activação tal foi mediada pela fosforilação de resíduos de tirosina no IκBα [28]. activação de NF-kB é um componente crítico na resposta transcripcional hipoxia. Os nossos dados aqui apresentados indicam que a activação de NF-kB é aumentada em condições de hipoxia, bem como transientemente transfectadas com um pcDNA3.0 /HIF-1α em células de cancro do pâncreas, sob condições de normóxia. Enquanto isso, a actividade de NF-kB aumentada em condições de hipoxia é inibida pelo inibidor de IKK BAY-11-7082, que pode inibir a fosforilação e a degradação de IκBα, e previne a translocação de p65 /p50. Ambos os nossos dados e estudos anteriores demonstraram que as vias bioquímicas que conduzem à activação de NF-kB convergiram para o complexo IKK sob condições hipóxicas. Recentemente, relatou-se que o NF-kB induz a transcrição HIF-1α expressão em macrófagos de ratinho, o fígado e cérebro [29]. Nós também descobrimos que a inibição farmacológica de NF-kB, IKK inibidor BAY-11-7082, resultou em expressão reduzida de HIF-1α em ambas as células PANC-1 e BxPC-3, sob condições hipóxicas (dados não mostrados). Estes resultados sugerem a existência de um lacete bioquímica, por meio de que o HIF-1α activa NF-kB, e vice-versa. A interrupção deste ciclo em células de cancro do pâncreas em um ou mais dos muitos passos bioquímicos que ligam o HIF-1α de NF-kB é susceptível de ter um efeito significativo sobre o crescimento do cancro do pâncreas. No entanto, a relação entre o HIF-1α e NF-kB, no processo de desenvolvimento do tumor é particularmente complexo e requer uma maior exploração. Além disso, mostrámos que o programa EMT atribuível a hipoxia ou a sobre-expressão de HIF-1α é largly impulsionado por activação da via clássica do NF-kB. Este programa EMT é caracterizada pela expressão de vimentina e N-caderina e E-caderina de supressão, golpeando alterações morfológicas, um fenótipo mesenquimal altamente invasiva e gemcitabina-resistente.

O estudo recente mostrou que a expressão de alvo de HIF-1α do gene de VEGF, um factor de crescimento que podem promover EMT no cancro da próstata [30]. Neste estudo, os dados também mostraram que a expressão da proteína de VEGF aumentou significativamente em células de cancro do pâncreas sob condições hipóxicas e a sobre-regulação de VEGF, induzida por hipoxia, foi abolida por NF-kB p65 siARN. Nós também descobrimos que estas células foram incubadas sob condições de hipóxia ou transfectadas com pcDNA3.0 /HIF-1α sob condições de normóxia exibem elevada actividade de NF-kB, a inibição de que resulta na reversão do interruptor caderina ao de um fenótipo epitelial tipificadas pela redução invasão e aumento da sensibilidade gemcitabina, resultados que implicam NF-kB como principal mediador do programa EMT HIF-induzida por 1α em células de câncer de pâncreas em condições de hipóxia.

Outros estudos têm identificado previamente Zeb1, Zeb2 e Caracol como reguladores centrais de supressão de e-caderina e EMT em células de cancro pancreático [11], [31]. No entanto, a expressão de torção não foi detectada sob condições de normóxia e o gene de torção foi activado após exposição a hipoxia em cinco linhas de células de cancro pancreático [32]. Neste estudo mostramos que o EMT induzida por hipoxia ou a sobre-expressão de HIF-1α foi associada com o aumento da torção, expressão de Snail, Zeb1, ou Zeb2. Nós também descobrimos que a inibição farmacológica de IKK pelo BAY 11-7082 em células hipóxicas resultou em uma diminuição dependente da dose na expressão torção mas não há mudanças notáveis ​​na Zeb1, Zeb2 ou expressão do caracol, o que sugere que os fatores de transcrição específicos que regulam EMT dependem do contexto celular e do estado específico de células. Esta transformação mesenquimais pode em grande parte ser atenuado através da inibição de NF-kB, quer através de abordagens moleculares ou farmacológicos, embora bloqueio de NF-kB não promove uma completa reversão para um fenótipo epitelial, como evidenciado pela manutenção do caracol, Zeb1, ou expressão Zeb2 na cara de NF-kB p65 siRNA ou inibição IKK. Esta última descoberta sugere a existência de NF-kB-independente EMT vias reguladoras em células de cancro do pâncreas sob condições hipóxicas que continuam a ser definida.