Abstract

AZD6244 e MK2206 são direcionados drogas de pequenas moléculas que inibem MEK e AKT respectivamente. A eficácia desta combinação no cancro do pulmão é desconhecido. O nosso trabalho anterior demonstrou a importância da AKT activado em mediar a resistência de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) para AZD6244. Assim, a hipótese de que a inibição dupla de ambos MEK e AKT jusante vias iria induzir a atividade antitumoral sinérgica. Neste estudo, foi avaliada a eficácia do AZD6244 e MK2206 individualmente em um grande painel de linhas celulares de cancro do pulmão. Então, nós tratamos 28 linhas celulares de cancro de pulmão humano com uma combinação de AZD6244 e MK2206 em proporções molares de drogas clinicamente aplicáveis. A terapia de combinação AZD6244-MK2206 resultou num efeito sinérgico sobre a inibição do crescimento das células do cancro do pulmão em comparação com os resultados do tratamento único fármaco sozinho. MK2206 aumentada induzida pela sobre-expressão Bim AZD6244 e apoptose em células A549 e H157. Quando testámos a combinação de AZD6244 e MK2206 em razões de 8:01, 4:01, 02:01, e 01:08, verificou-se que o efeito sinergistico da terapia de combinação foi dependente da proporção. A razões de 8:01, 4:01, e 2:01, a combinação de drogas demonstraram consistentemente sinergia, ao passo que a diminuição da razão de 01:08 resultou em uma perda de sinergia e produziu um efeito aditivo ou antagonista na maioria das linhas celulares. Além disso, a terapia de combinação AZD6244-MK2206 mostrou sinergia na supressão do crescimento do tumor A549 e H157 xenoenxerto e aumentou o tempo de sobrevivência dos animais significativo. A terapia de combinação AZD6244-MK2206 resultou em inibição eficaz de ambos p-ERK e a expressão de p-AKT em tecido tumoral. Além disso, um aumento significativo da apoptose foi detectada em tecido de tumor a partir de ratinhos tratados com AZD6244-MK2206 comparada com a do agente único ratinhos tratados. Nosso estudo sugere que a combinação de AZD6244 e MK2206 tem um efeito sinérgico significativo sobre o crescimento tumoral

in vitro

e

in vivo

e leva a taxas de sobrevivência aumentaram em camundongos com tumores de pulmão humanos altamente agressivos.

Citation: Meng J, Dai B, fang B, Bekele BN, Bornmann WG, Sun D, ​​et al. (2010) Combinação de tratamento com MEK e AKT Inibidores é mais eficaz do que cada droga Alone in não-pequenas células do câncer pulmonar humano

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 5 (11): e14124. doi: 10.1371 /journal.pone.0014124

editor: Eric J. Bernhard, National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de junho de 2010; Aceito: 05 de novembro de 2010; Publicação: 29 de novembro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Meng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiado em parte pelos Institutos Nacionais de Saúde, através Grant Cancer Support Center da MD Anderson CA-016672 – Programa Lung, citometria de fluxo e Celular Imagem (FCCI) Facilidade core e Facilidade de Apoio Pesquisa animal, um programa especializado de Investigação Excellence (SPORE) Grant CA-070907 (J. Minna e J. Roth), um R01 Grant CA-124951 (B. fang) eo Cohen-Reinach Família Charitable Foundation. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /Akt e RAS /RAF /proteína quinase ativada por mitógeno (MEK) /extracelular quinase regulada por sinal (ERK) vias, mediar a proliferação e sobrevivência em células de câncer de pulmão humano e partilham várias moléculas a jusante, tais como FOXO3a [1], [2], e Bad [3].

Actualmente, uma grande variedade de pequenas moléculas inibidoras de tirosina-quinase que alvo vias de sinalização tenham sido desenvolvidos caspase-9 , e dois desses agentes estão actualmente a ser avaliada em testes clínicos. AZD6244 é um inibidor alostérico dos /2 quinases MEK1 que não compete com a actividade de ligação de adenosina-trifosfato (ATP) [4]. Este composto liga-se a MEK1 /2 e induz várias mudanças conformacionais não fosforilados nas MEK1 /2 enzimas, inibindo a sua actividade catalítica, o que resulta numa inibição da activação de ERK e um bloqueio das vias de transdução de sinal. MK2206 é um inibidor altamente selectivo não-competitivo do ATP alostérico de AKT com IC

50 na gama de nM e tem uma ampla actividade anti-tumor pré-clínico. É também em ensaios clínicos de fase precoce e está a ser avaliado para o tratamento de pacientes com cancro do pulmão. No entanto, a eficácia potencial de uma combinação de AZD6244 e MK2206 no tratamento de cancro do pulmão é desconhecido. Neste estudo, investigou o efeito da combinação de AZD6244 e MK2206 em matar linhas celulares de cancro de pulmão humano e descobriram que esta combinação era altamente sinérgica

In vitro

e muito eficaz no tratamento de xenoenxertos de cancro de pulmão. Nós também explorado o mecanismo de sinergismo para estes dois compostos. Nossos resultados pré-clínicos apoiar investigações clínicas de terapia de combinação AZD6244 e MK2206 em pacientes com câncer de pulmão.

Materiais e Métodos

Materiais

AZD6244 e MK2206, sintetizado no Dr. William G. laboratório do Bornmann na Universidade do Texas MD Anderson Cancer Center, foram dissolvidos a concentrações de 25 mM e 20 mM, respectivamente, em dimetilsulfóxido e armazenada a -80 ° C. Os anticorpos contra ERK e AKT total e fosforilada foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Os anticorpos contra o Bim foram obtidos de Calbiochem (San Diego, CA). cocktail inibidor de protease, o anticorpo β-actina, e sulfo-rodamina B foram obtidos a partir de Sigma Chemical Corporation (St. Louis, MO). materiais de ensaio de proteínas foram adquiridos de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). Deadend ™ Flurometic Sistema TUNEL foi adquirido de Promega (Madison, WI).

cultura celular

Todas as linhas de células de câncer de pulmão humanos foram fornecidos por um ou outro Dr. John V. Heymach no MD Anderson Cancer centro ou Drs. Adi Gazdar e John D. Minna no The University of Texas Southwestern Medical Center em Dallas. As linhas de células foram mantidas em meio RPMI 1640 ou alta concentração de glicose meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), suplementado com 10% de soro fetal de bovino, 100 ug /ml de ampicilina, e 0,1 mg /mL de estreptomicina; as células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2 e 95% de ar.

A viabilidade celular ensaio

Os efeitos inibidores de AZD6244, MK2206, eo combinação de AZD6244 e MK2206 no crescimento celular foram determinados utilizando o ensaio de sulforrodamina B, tal como descrito anteriormente [5]. Cada experiência foi realizada em quadruplicado e repetidos pelo menos três vezes. A viabilidade celular relativa (%) foi calculada usando a equação OD

T /OD

C × 100% (onde OD

T representa o absorvância do grupo de tratamento e OD

C representa a absorvância o grupo de controlo). A concentração inibidora média (IC

50) Os valores foram determinados utilizando o software CurveExpert 1.3 e representada graficamente em curvas de dose-resposta.

análise Western blot

lisados ​​de células inteiras foram preparados por lavagem da as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e submetendo-os a lise com tampão de amostra de Laemmli suplementado com o cocktail de inibidores de protease. Após os lisados ​​foram sonicadas durante 15 s, as concentrações de proteína foram quantificadas utilizando o kit de ensaio de proteína Bio-Rad. quantidades equivalentes de proteína foram carregadas cada, separadas por 10% ou electroforese em gel de 12% de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida, e, em seguida, transferido para fluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas a 80 V durante 2 horas. As membranas foram bloqueadas durante 1 h com 5% de leite seco sem gordura em tampão PBS contendo 0,1% de Tween-20 (PBST) e sondadas com anticorpo primário diluído a 4 ° C durante a noite. As membranas foram então lavadas três vezes no tampão PBST e sondadas com anticorpos secundários marcados com corante de infravermelhos; as bandas imunorreactivas foram visualizadas com o Imager Odyssey (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).

ciclo celular e ensaios de apoptose

As células foram recolhidas por tripsinização, lavadas duas vezes em PBS frio, fixa com gelo frio metanol 70%, e incubou-se a 4 ° C durante a noite. As células foram então lavadas com PBS e incubadas com 25 ug /mL de iodeto de propídio contendo 30 ug /mL de ribonuclease durante 30 min à temperatura ambiente. As células foram analisadas em um perfil de fluxo EPICS citómetro II (Coulter Corp., Hialeah, FL) utilizando o software Multicycle AV (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). Os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes.

Os estudos em animais

Todos os experimentos em animais foram realizados após aprovação pelo conselho de revisão institucional MD Anderson (11-03-09932) e foram realizados de acordo com as Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório publicado pelo National Institutes of Health.

fêmea BALB /c ratos nus foram adquiridos de Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Os ratinhos foram alojados em câmaras de fluxo laminar em condições específicas isentas de patogénios e foram utilizados quando tinham 6 a 8 semanas de idade. Um total de 3 × 10

6 H157 ou células A549 foram inoculadas subcutaneamente nos flancos dorsais direito dos ratinhos nus. Quando os tumores atingiram um volume médio de cerca de 0,1 cm

3, os ratos foram divididos aleatoriamente em grupos de controlo e de tratamento (

n

= 5 animais por grupo). Para os ratinhos portadores de H157, foram administradas a grupos de tratamento de 20 mg /kg de AZD6244, 10 mg /kg de MK2206, ou combinação AZD6244-MK2206 a 20 mg /kg-10 mg /kg, todos os quais haviam sido solubilizados num meio contendo 0,5% hidroxipropilmetilcelulose e tampão de polissorbato a 0,1%. Nos ratinhos portadores de A549, foram administrados aos grupos de tratamento de 24 mg /kg de AZD6244, 6 mg /kg de MK2206, ou AZD6244-MK2206 combinação de 24 mg /kg, 6 mg /kg, todos os quais haviam sido solubilizados num meio contendo 0,5% hidroxipropilmetilcelulose e tampão de polissorbato a 0,1%. Todos os fármacos foram dissolvidos em tampão 100 ul de veículo para cada rato. Todas as drogas administradas duas vezes por dia por gavagem oral. O grupo controle recebeu o buffer veículo sozinho. A duração do tratamento foi de 20 d. O tamanho do tumor, medido por pinças, foi registado cada cinco d. O volume do tumor foi calculado, tomando o comprimento a ser o diâmetro mais longo entre o tumor e a largura a ser o diâmetro perpendicular correspondente, utilizando a seguinte fórmula: comprimento x largura

2 × 0,52. A taxa de inibição do crescimento do tumor foi calculado como 100% x (tamanho do tumor

tratados tamanho /tumoral

controlo) em cada dia de medição. ratinhos portadores de tumor continuaram o tratamento, tal como indicado acima após 20 d. Os ratos foram autorizados a viver até sua morte natural ou foram sacrificados quando o volume do tumor foi maior do que 2.000 milímetros

3. curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram tabulados e analisados ​​estatisticamente. peso do corpo do animal foi medido e registado cada cinco d durante o tratamento.

Para o estudo farmacológico, os tumores foram estabelecidos como descrito acima e foram deixadas a crescer a um tamanho de 0.5-0.8cm

3 antes do tratamento começou. Os ratinhos portadores s.c. tumores A549 foram então administradas diariamente veículo, AZD6244, MK2206 ou AZD6244-MK2206 nas mesmas concentrações acima mencionadas (

n

= 5 animais por grupo) durante 3 dias. Quatro horas após a última dose, os animais foram sacrificados e os tumores foram ressecados, fixadas com paraformaldeído a 4% e para a coloração imuno-histoquímica e ensaio TUNEL embebidos em parafina.

A imuno-histoquímica

Os cortes foram desparafinados em xileno e diluições de etanol série. Os antigénios foram recuperadas e a actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogénio a 0,3% durante 10 min. As secções foram então tratadas com soro de cabra ou cavalo normal a 10% durante 30 min. Após incubação durante a noite com anticorpos primários, incluindo p-AKT (diluição 1:100) e p-ERK (diluição 1:100), as secções foram sondadas com anticorpos secundários biotinilados e, em seguida, incubadas com estreptavidina-biotina (Lab Vision, Fremont , CA). As secções foram então coradas com uma solução de tetracloridrato de 3,3-diaminobenzidina (DAB; Lab Vision, Fremont, CA), contrastadas com hematoxilina de Mayer (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA), desidratadas e montadas

TUNEL. ensaio

as secções foram desparafinadas e o ensaio TUNEL foi realizada seguindo as instruções do fabricante de um kit disponível comercialmente (Fluorometric deadend ™ Sistema de TUNEL) da Promega. As células apoptóticas exibem uma forte fluorescência verde nuclear que pode ser detectada usando um filtro de fluoresceína padrão. Todas as células coradas com DAPI exibem uma forte fluorescência nuclear azul. As lâminas foram observadas sob microscopia de fluorescência com células em apoptose relativas determinadas pela contagem de células TUNEL-positivos em cinco campos aleatórios (pelo × 100 ampliação) para cada amostra.

A análise estatística

O

citotoxicidade in vitro

experiências foram realizadas em triplicado para cada ponto de tempo e concentração. O significado do

in vitro

dados foi determinada utilizando o estudante

t

de teste (2 caudas). Os valores de p inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

O gene mutações das linhas de células foram obtidas a partir do banco de dados on-line (https://www.sanger.ac.uk/genetics/CGP/CellLines/). As correlações da

in vitro

resposta a AZD6244 ou MK2206 (IC

50) e mutações genéticas foram avaliadas por meio do teste de Wilcoxon e de regressão logística.

Para o

in vivo

estudos, os volumes dos tumores foram calculados como média ± desvio padrão. teste de Wilcoxon e Kruskal-Wallis foram usados ​​para comparar diferenças de tratamento. Coeficiente de correlação de Spearman foi utilizado para estimar a correlação entre duas variáveis ​​contínuas. As diferenças de tratamento no que diz respeito à sobrevivência foram avaliados através do teste log-rank. Todos os testes foram em frente e verso. Os valores de p inferior a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. software estatístico SAS 9.1.3 e S-PLUS 8.0 foram utilizados para todas as análises.

Resultados

Efeitos do AZD6244 ou MK2206 único tratamento com a droga em linhas celulares de cancro do pulmão

Antes de avaliar os efeitos da terapia de combinação, testou-se o efeito anti-proliferativo de AZD6244 e MK2206 como terapias de agente único num painel de 47 linhas celulares de cancro de pulmão humano (Figura 1). A resposta a AZD6244 variou muito, de alta sensibilidade (IC

50 0,2? M) a altamente resistente (IC

50 150? M), entre as linhas celulares. O intervalo de resposta à dose de MK2206 foi mais consistente, com o CI

50 variando desde 0,4 uM a 25 uM. Encontrámos algumas linhas de células eram sensíveis à AZD6244 mas resistente à MK2206 (tais como Calu-6, HCC1171, e H1993), enquanto que outras linhas de células eram resistentes à AZD6244 mas sensível a MK2206 (tais como H522, H1395, e Calu-3) . Não foi observada nenhuma correlação entre a sensibilidade a estes dois compostos. Comparando os resultados de dose-resposta e o banco de dados de mutação genética em linha, nenhuma correlação foi encontrada entre o EGFR, KRAS, BRAF ou mutações genéticas PI3K eo IC

50 de AZD6244 ou MK2206. Nós também não observamos correlações entre mutações no gene EGFR /KRAS /BRAF globais e do IC

50 de AZD6244 ou EGFR /mutações globais de genes de PI3K e do IC

50 de MK2206 (Tabela 1 e 2).

As linhas celulares indicadas foram tratadas com diferentes concentrações de quer AZD6244 ou MK2206 durante 96 h. A viabilidade celular foi determinada utilizando sulforhodamina B, e IC

50 foi calculado de acordo com a curva dose-resposta.

Efeitos da combinação AZD6244-MK2206 variam entre câncer de pulmão linhas celulares

a partir das linhas de células 47, 28, escolheu para testar os efeitos antitumorais da terapia de combinação AZD6244 e MK2206. As linhas celulares foram seleccionadas para representar uma gama de sensibilidade para uma ou ambas as drogas. O IC

50 foi 5uM tanto para AZD6244 e MK2206 para 21 das 28 linhas de células. Para as outras linhas celulares do IC

50 foi 5uM para AZD6244 ou MK2206 ou ambos. Para determinar se os efeitos antitumorais obtidos com diferentes combinações de AZD6244 e MK2206 foram sinérgica, calculou-se o índice de combinação (IC) de acordo com o método de Chou-Talalay usando software Calculsyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido). (CI 1,1, o antagonismo; IC = 0,9-1,1, efeito aditivo; IC = 0,2-0,9, sinergismo; CI 0,2 forte sinergismo). Desde que o modelo Chou-Talalay apela a agentes citotóxicos para ser usado em uma proporção de dose fixa, optamos por utilizar AZD6244 e MK2206 numa razão molar 05:01. Após o tratamento com várias concentrações de AZD6244 (0,024-100 fiM), MK2206 (0,005-20 uM) e AZD6244 /MK2206 (0,024 /0,005-100/20? M), que estão na gama de concentrações alcançadas no soro de doentes que recebem AZD6244 oral e MK2206, o índice de combinação (IC) foi medido em cada linha celular. Em 67% das linhas celulares, incluindo H2023, H2347, HCC827, H23 e mostrados na Figura 2, o tratamento de combinação produziu um efeito sinérgico forte. O tratamento combinado produzido um efeito aditivo ou antagonista apenas em 11% das linhas de células (Tabela 3).

linhas celulares de cancro de pulmão foram tratados com várias concentrações de AZD6244 (0,024-100 fiM), MK2206 (0.005- 20 uM) e AZD6244 /MK2206 (0,024 /0,005-100/20? M) durante 96 h. As curvas de efeito-dose da combinação e de cada agente por si só são apresentados para comparação. linhas celulares representativas que demonstram os fortes efeitos sinérgicos da terapia de combinação são mostrados.

Efeito sinérgico de AZD6244-MK2006 terapia de combinação é

As relações fixas de drogas dependente da relação foram expandidas para 7 linhas celulares (H1792, H157, A549, H515, H1693, H1703 e H3122), que foram sensíveis à combinação de AZD6244 e MK2206 para 08:01, 04:01, 02:01, 01:02 1:, 4, e 01:08. Descobrimos que o sinergismo consistente resultou quando as 8:1, 4:01, e 2:1 proporções foram usadas (Figura 2, Tabela 4), enquanto que a diminuição da razão de 1:08 AZD6244:MK2206 resultou em uma perda de sinergia e produzido um efeito aditivo ou antagonista na maioria das linhas de células (Tabela 4). Nós também descobrimos que cada linha celular tinha a sua própria razão de droga ideal. Por exemplo, H1703 mostrou o maior nível de sinergismo com uma relação de 08:01 AZD6244:MK2206; H1693 e A549 foi maior em 04:01 (Figura 3A, à esquerda); e H157 foi mais elevada a 02:01 (Figura 3A, direita).

(A) A549 e H157 foram tratados com AZD6244, MK2206, ou uma combinação destes dois compostos, nas concentrações indicadas, durante 48 h. (B) as amostras de proteína foram colhidas e AKT, p-AKT, ERK, p-ERK e expressão Bim foram detectados com a análise de Western blot. (C) As células foram tratadas com tripsina e fixo, e o ciclo celular foi medida com a citometria de fluxo. Os números representam percentagens de

células em apoptose sub-G 1-fase. Os dados representam uma das três experiências independentes, com resultados semelhantes.

Colunas

, média;

bar

, SD *,

P Art .. 0,05, em comparação com os únicos tratamentos agente

MK2206 aumenta a apoptose induzida por AZD6244

Para determinar se MK2206 tinha um efeito sobre a apoptose induzida por AZD6244, testou-se a expressão de AKT, p-AKT, ERK, p-ERK, e Bim e quantificada células apoptóticas após o tratamento com agentes individuais e combinadas. AZD6244 é conhecido por regular a expressão de Bim, uma proteína somente de BH3, levando a uma activação da via mitocondrial e apoptose, mediada por FOXO3a [6]. Além disso, também pode fosforilar AKT FOXO3a, e inibição de AKT pode aumentar a activação FOXO3a por desfosforilação. Percebemos que o tratamento com AZD6244 sozinho levou a uma sobre-expressão relativamente moderada de Bim às 48 h. Embora nós não detectar uma alteração evidente da expressão Bim após o tratamento com MK2206, quando MK2206 foi combinado com AZD6244, Bim expressão aumentada para um nível mais elevado do que a induzida por AZD6244 sozinho (Figura 3B). Nós também descobrimos que a combinação de 2 drogas resultou em mais células em apoptose do que qualquer um dos tratamentos de droga única sozinho. Uma vez combinados com MK2206, a apoptose induzida por AZD6244 aumentou de 14,4% para 29,8% na linha de células A549 e de 6,0% para 27,0% na linha celular H157 (

P

0,05, Figura 3C). Estes resultados indicam que MK2206 melhorar eficazmente a ativação induzida por AZD6244 de apoptose mitocondrial.

Efeito sinérgico

in vivo

A resposta ao tratamento combinado AZD6244-MK2206

in vivo

foi avaliada em tumores subcutâneos geradas por injecção de células A549 ou H157 nos flancos de ratinhos nus BALB /c. Os ratinhos com tumores estabelecidos de flanco de volumes iguais foram tratados com veículo, uma única administração de AZD6244, uma única administração MK2206, ou a combinação de AZD6244-MK2206. Em ambos os A549 e mouse modelos de xenotransplante subcutânea H157, camundongos que receberam a combinação de AZD6244 e MK2206 apresentou um volume médio do tumor significativamente reduzido (135 ± 120 e 188 ± 107 milímetros

3) em comparação com ratinhos que receberam AZD6244 sozinho (848 ± 302 e 669 ± 154 mm

3), MK2206 sozinho (1497 ± 380 e 858 ± 125 mm

3), ou tratamento de controlo (2666 ± 275 e 1437 ± 217 mm

3) por dia 20 (

P

0,01 para todas as três comparações; Figura 4A). Este resultado indica que a supressão da AKT com MK2206 aumento da sensibilidade dos A549 e H157 células “para AZD6244

in vivo

. Além disso, verificou-se que o tempo de sobrevivência dos animais eram mais longos nos grupos que receberam a combinação de 2 drogas do que nos grupos que receberam compostos por agente único ou tratamento de controlo (Figura 4B). O tempo médio de sobrevivência dos animais tratados com a combinação de AZD6244-MK2206 aumentou significativamente (

P

0,01, Figura 4B). No modelo de xenoenxerto A549, os ratinhos tratados com AZD6244-MK2206 tinha um tempo médio de sobrevivência de 50 d, enquanto aqueles tratados com AZD6244 sozinho, MK2206 sozinho, e veículo de controlo tinham tempos de sobrevivência média de 32 d, 23 d, e 17 d, respectivamente (

P

0,01 para todas as três comparações). Tivemos resultados semelhantes no modelo de xenoenxerto de H157: os tempos de sobrevivência mediana para a terapia de combinação marcadamente aumentada para 45 d enquanto para AZD6244-alone, MK2206-alone, e tratamentos de controle foram de 33,5 d, 33 d, e 26,5 d, respectivamente (

P

0,01 para todas as três comparações). Além disso, 20% dos ratinhos portadores de tumores H157 e 40% dos ratinhos portadores de tumores A549 que receberam o tratamento combinado sobreviveram após 55 d e não têm tumores na última observação. Além disso, não foram encontradas diferenças significativas no peso corporal do rato entre os quatro grupos seguintes do tratamento de 20 d, e não houve toxicidades evidentes a partir da combinação de drogas (dados não mostrados). Juntos, estes resultados sugerem que a combinação de AZD6244 e MK2206 tem um efeito terapêutico sinergético sobre o crescimento de células de cancro de pulmão humano num painel de linhas celulares de NSCLC

in vitro

, e em A549 e linhas de células H157

em vivo

.

tumores do flanco foram estabelecidos em ratinhos nus e tratados com veículo, AZD6244, MK2206, ou a combinação AZD6244-MK2206 terapia por via oral duas vezes por dia em doses indicadas. Os volumes dos tumores (A). diferenças gerais entre os tratamentos foram estatisticamente significativas (

P Art 0,001; Kruskal-Wallis). Observou-se estatisticamente significativos efeitos tempo-a-tratamento quando comparado controle vs. A (

P Art 0,05); Controle vs M (

P Art 0,05); Controle vs A + M (

P Art 0,05); A vs M (

P

= 0,05); A vs A + M (

P

= 0,05) e M vs A + M (

P Art 0,05) para A549; os resultados foram semelhantes, excepto que para H157 A vs M não foi estatisticamente significativa. vezes (B) a sobrevivência. diferenças gerais entre os tratamentos foram estatisticamente significativas (

P Art 0,001; teste log-rank).

modulação alvo no modelo do rato A549 xenotransplante

No estudo farmacodinâmica , quatro horas após a dose final no dia 3, os animais foram sacrificados e os tecidos tumores foram excisados ​​e analisados ​​quanto a p-ERK e P-Akt por coloração imuno-histoquímica. A inibição da expressão de p-ERK foi observada em tumores de ratos tratados com AZD6244 isoladamente ou a combinação AZD6244-MK2206. A inibição de p-AKT foi observada em tumores de ratos tratados com MK2206 por si só ou a combinação AZD6244-MK2206 (Figura 5A). Os resultados indicaram que p-ERK e p-AKT foram efetivamente inibida com AZD6244 e MK2206

in vivo

. A combinação de AZD6244 e MK2206 pode também inibir os alvos de forma eficaz. O ensaio de TUNEL demonstrou que MK2206 aumentou significativamente a apoptose induzida por AZD6244 (

P

0,05). A partir de 2,6% para 11,2% no tecido de tumor de xenoenxerto (figura 5B)

Os modelos de rato foram xerograft controlo tratado com veículo, AZD6244 (24 mg /kg), MK2206 (6 mg /kg) ou AZD6244-MK2206 (24 mg /kg, 6 mg /kg) durante 3 dias combinação. Quatro horas após a última dose, os tumores foram ressecados, fixa e incluídos em parafina. (A) As secções foram analisadas por imuno-histoquímica utilizando p-ERK e anticorpos de p-AKT e as fotografias representativas de secções de tumor são mostradas. (B) As secções foram submetidas a coloração TUNEL e DAPI. As células apoptóticas relativos foram determinados por contagem de TUNEL positivos células em cinco campos aleatórios (em 100 vezes) de cada amostra.

Colunas

, média;

bar

, SD. *,

P Art 0,05, em comparação com os únicos tratamentos agente. As fotografias representativas em secções de tumor são mostrados.

Discussão

Neste estudo, relatam que a terapia de combinação de MEK inibidor AZD6244 e inibidor AKT MK2206 pode induzir dramática inibição sinérgica do crescimento do tumor

in vitro

e

in vivo

. Anteriormente estudos têm observado que a resistência à AZD6244 em células de cancro do pulmão é mediada pela activação AKT [5], [7]. O ciclo de realimentação de RAS /RAF /MEK /ERK e PI3K /AKT nos levou à hipótese de que a supressão destes dois caminhos podem superar a resistência à AZD6244 e agir sinergicamente para inibir o crescimento do câncer de pulmão. Neste estudo, mostraram que a terapia com um único agente ou com AZD6244 ou MK2206 tem um efeito inibidor modesto, sobre linhas de células de cancro do pulmão. Porque certas mutações genéticas podem estar implicados em resposta a estes agentes, também verificou o estado mutacional de BRAF, KRAS, EGFR e PI3K nestas linhas celulares. A mutação BRAF V600E foi relatado para ser correlacionados com sensibilidade a inibidores de MEK [8], [9] e foi utilizado como um critério importante para o recrutamento de pacientes num ensaio clínico de inibidores de MEK em pacientes com melanoma. mutação (s) KRAS, BRAF /KRAS e LKB /KRAS estão correlacionados com sensibilidade a inibidores de MEK no cancro do ovário [10], o cancro colorectal [11], e NSCLC [12], respectivamente. No entanto, não detectamos uma correlação evidente entre a expressão mutacional de EGFR, BRAF, PI3KI ou KRAS e sensibilidade para AZD6244 ou MK2206 nas linhas de câncer de pulmão que testamos. Isto pode ser devido aos efeitos de diferentes mutações em tipos histológicos específicos de cancro ou em vias de linhas celulares específicas. Por exemplo, para câncer de mama e de pulmão, a expressão do gene associado com sensibilidade diferencial para AZD6244 incluiu muitos genes que não estavam em comum para ambos os histologia [13]. Outra possível explicação para a discrepância dos resultados e estudos anteriores pode ser devido a várias freqüências de mutações genéticas em diferentes tipos de câncer. Por exemplo, BRAF mutante é em muitos cancros, incluindo melanoma maligno (27-70%), cancro papilar da tiróide (36-53%), cancro dos ovários (cerca de 30%), e o cancro colo-rectal (5-22%). No entanto, mutações BRAF são detectados apenas em 1-2% dos pacientes com câncer de pulmão. Seria difícil para mostrar as relações estatisticamente significativas com esses eventos de baixa frequência.

Nossa investigação mostrou que o dual-agente de terapia de combinação AZD6244-MK2206 mostrou um efeito sinérgico no crescimento do tumor em relação a qualquer dos agentes isolados. Como uma terapia de agente único, AZD6244 foi ineficaz contra algumas linhas celulares de cancro de pulmão (como Calu-1, H460 e H661). No entanto, quando combinado com MK2206, estas linhas de células resistentes foram sensíveis a tratamento de combinação. De acordo com métodos de Chou-Talalay [14], foi utilizada uma relação droga fixo para testar um efeito sinérgico. Em ensaios clínicos, a terapia de combinação será dada aos pacientes em ciclos repetitivos de 28 d. A dose de partida planeado de MK2206 é de 45 mg /kg a cada dois dias (a mais elevada uma vez que todos os outros dia dose de MK2206 será de 45 mg /kg) ou 90 mg /kg uma vez por semana e aumentando a tanto quanto 250 mg /kg uma vez por semana ; A dose inicial de AZD6244 planeado é de 75 mg /kg duas vezes por dia (https://clinicaltrials.gov/). Nós selecionamos uma relação droga de 05:01 AZD6244:MK2206 que é nesta faixa para o nosso estudo inicial

in vitro

. Os nossos resultados mostraram que AZD6244:MK2206 pode induzir efeitos sinérgicos entre linhas de células de 89%. Para obter uma análise mais quantitativa, ampliamos os rácios de drogas para identificar a gama mais eficaz e a relação sinérgica ideal. Descobrimos que essas duas drogas apresentaram efeitos sinérgicos de forma consistente em 8:01, 4:01, e 2:1 proporções de AZD6244 para MK2206, enquanto diminuir essa proporção de 01:08 resultou em uma perda de sinergia ea presença de apenas efeitos aditivos ou mesmo antagonismo na maioria das linhas celulares. Nós, então, selecionou dois KRAS mutado linhas celulares, A549 e H157, para investigar o efeito da combinação AZD6244-MK2206

in vivo

. O crescimento tumoral foi inibido de forma significativa com o tratamento combinado em relação ao tratamento com agente único. Os efeitos farmacodinâmicos em xerografts A549 mostrou que o nível de p-ERK e p-AKT expressão foram suprimidos suficientemente com AZD6244 e MK2206 respectivamente. A combinação de AZD6244 e MK2206 inibiu ambos p-ERK e p-AKT eficazmente. O ensaio de TUNEL demonstrou que o tratamento de combinação induziu apoptose muito mais células de tumor do que as drogas individuais. Estes resultados sugerem fortemente que AZD6244 e MK2206 sinergicamente induzir apoptose por dupla inibição da fosforilação de ERK e AKT.

Estudos anteriores têm mostrado que se combinações de drogas anti-cancro ou interagem sinergisticamente de forma antagonista pode depender da relação dos agentes combinados [15 ], [16]. A falta de controlo proporções de droga devido a mecanismos não coordenados ou farmacocinética podia, portanto, conduzir a resistência aos fármacos se as células tumorais são expostas a rácios de drogas antagonistas. É possível que as proporções precisas descrito

In vitro

pode não ser obtido no tumor de um paciente devido à distribuição diferencial e do metabolismo destes dois compostos. No entanto, descobrimos que os efeitos sinergéticos ocorreram ao longo de uma ampla gama de concentrações da droga que torna provável que um efeito terapêutico será alcançado.

No nosso mecanicista e

in vivo

estudos, foi utilizado A549 e linhas de células H157 porque ambos abrigar mutações KRAS. As mutações no KRAS foram encontrados em 20% a 30% dos cancros do pulmão e acredita-se desempenhar um papel fundamental neste malignidade [17]. A presença de um gene mutado KRAS é supostamente associada com resistência primária a todas as terapias orientadas [18].