Humana

Abstract

Fundo

A autofagia é uma via de degradação de proteínas evolutivamente conservada. Um defeito em autofagia pode contribuir para a tumorigénese. indutores autofagia poderia ter uma função potencial na prevenção e tratamento do tumor.

Metodologia /Principais Achados

Nossos resultados mostraram que Rhabdastrellic ácido-A, um triterpen�de isomalabaricane isolado da esponja rhabdastrella globostellata, inibiu a proliferação de linhas de células de cancro humano A549 e Hep3B e morte celular independente de caspase induzida em ambas as linhas celulares. Outras investigações mostraram que Rhabdastrellic ácido-A autofagia de células cancerígenas determinadas pelo pontilhado YFP-LC3 e aumento da LC3-II induzido. O pré-tratamento com inibidor autofagia 3-MA inibiu a morte celular induzida por ácido-A Rhabdastrellic. Knockdown de Atg5 gene relacionado com autofagia inibida induzida por ácido-A morte celular em células A549 Rhabdastrellic. Além disso, fosfo-Akt e seus alvos a jusante diminuiu significativamente após tratamento com ácido Rhabdastrellic-A em ambas as linhas celulares de cancro. Transfecção de constitutiva ativa plasmídeo Akt revogada autofagia e morte celular induzida por Rhabdastrellic ácido-A.

Conclusões /Significado

Estes resultados sugerem que Rhabdastrellic ácido-A pode induzir a morte celular associada a autofagia através do bloqueio Akt em células cancerosas. Ele também fornece a evidência de que Rhabdastrellic ácido-A merece uma investigação mais aprofundada como um anti-cancerígeno em potencial ou agente preventivo do câncer

Citation:. Li DD, Guo JF, Huang JJ, Wang LL, Deng R, Liu JN, et al . (2010) Acid-A Rhabdastrellic morte celular induzida Autophagy-associados, através de bloqueio Akt em células cancerosas humanas. PLoS ONE 5 (8): e12176. doi: 10.1371 /journal.pone.0012176

editor: Gian Maria Fimia, INMI, Itália |

Recebido: 19 de fevereiro de 2010; Aceito: 21 de julho de 2010; Publicação: 17 de agosto de 2010

Direitos de autor: © 2010 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo é apoiada por doações do National Nature Science Foundation da China (30873085, 30972882) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default124.htm). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As esponjas marinhas têm sido provado ser uma fonte particularmente fecunda de terpenóides incomuns [1], [2]. Rhabdastrellic ácido-A (Fig. 1), um triterpen�de isomalabaricane, foi isolado a partir da esponja amarela rhabdastrella globostellata (Carter) coletadas de Mar da China Meridional perto de Hainan Island, República Popular da China. A sua estrutura foi estabelecida com base em UV, IV, EM,

1H-RMN,

13C-RMN e espectrometria de RMN 2D [3], [4]. As estereoquímicas relativas e absolutas foram resolvidos por estudos NOESY e CD, respectivamente. Tem sido relatado que Rhabdastrellic ácido-A pode inibir o crescimento da linha celular de cancro HCT-116. Tasdemir et ai. descobriram que stellettin B e E, a partir de dois terpenóides rhabdastrella globostellata com estrutura semelhante à do ácido Rhabdastrellic-A, preferencialmente inibir p21 – /- de crescimento de células HCT-116 [5]. Outros triterpenóides isomalabaricane foram encontrados para induzir espécies de oxigénio reactivas (ROS), diminuem potencial de membrana mitocondrial, aumentar os níveis de Bax e citocromo c, diminuir os níveis de Bcl-2 e medeiam uma via apoptótica caspases-3, mas os mecanismos moleculares responsáveis ​​pela morte celular induzida por triterpenóides não foram ainda elucidados [5]. Além disso, nossa investigação mostrou que Rhabdastrellic ácido-A apoptose induzida em células HL-60 [4], mas não foi observado o desenvolvimento de características apoptóticos em Hep3B e células A549 após a exposição a Rhabdastrellic ácido-A.

Autophagy é uma via de degradação lisossómica que é essencial para a sobrevivência, desenvolvimento e homeostase [6]. Autophagy serve principalmente um papel adaptável para proteger os organismos contra diversas patologias, incluindo infecções, cancro [7], neurodegeneração [8], o envelhecimento e doenças do coração. morte celular autofágica tem características morfológicas e bioquímicas que a distinguem de ambos apoptose e necrose. Na fase inicial de desenvolvimento do tumor, funções autophagy como um supressor tumoral

39. Defeitos na autofagia levar à instabilidade genômica e tumorigênese. No entanto, as células tumorais que estão localizados na área central da massa do tumor sofrer autofagia de sobreviver sob condições de baixa de oxigénio e de nutrientes de baixo. Foi relatado que a autofagia protegido algumas células cancerosas contra os tratamentos anti-cancerígenos através do bloqueio da via apoptótica. Por outro lado, outras células cancerosas poderia sofrer morte celular autofágica seguinte terapias do cancro [9].

O papel da autofagia na mediação da resposta celular ao estresse foi examinado por interferencing a expressão de ortólogos de mamíferos do gene ATG [ ,,,0],10]. Por exemplo, um beclin (BECN1; também conhecido como Atg6) é um componente de um complexo incluindo a classe III fosfatidilinositol-3-quinase que é estimuladora da autofagia. Beclin 1 (ATG6) também é conhecido por interagir com membros da família Bcl-2, Bcl-2 e Bcl-xL, [11], [12]. A indução da expressão beclin 1 pode ser encontrado durante autofagia em vários tipos de células [13]; e Atg5 é necessário para autofagia mas também pode induzir a morte celular por meio da sua interacção com a proteína associada através de Fas domínio de morte [14]; Portanto, os resultados destas importantes experiências não pode no momento ser tomado como uma evidência definitiva para o papel de autofagia quer como um agente ou um agente de melhoria de danos durante o stress, mas mais como uma demonstração das funções importantes seus reguladores desempenham na homeostase celular e tumorigênese [15].

Um número de vias de sinalização estão envolvidos na regulação da autofagia. Um dos reguladores centrais de autofagia é o alvo da rapamicina, RPT-quinase, que é o principal sinal inibitório que suprime autofagia na presença de factores de crescimento e nutrientes abundantes. A classe I de PI3K /Akt moléculas sinalizadoras ligar tirosina-cinases receptoras de activação TOR e assim reprimir autofagia em resposta a sinais do factor de crescimento semelhante a insulina e outros [16]. Algumas das outras moléculas reguladoras que controlam a autofagia incluem proteína quinase 5 ‘-AMP-activada (AMPK), que responde ao baixo consumo de energia; o factor eucariótico de iniciação 2α (eIF2α), que responde ao nutriente fome, ARN de cadeia dupla, e no retículo endoplasmático (ER) o stress [17], [18]. A supressão de morte celular autophagic por caspase-8 em células de mamíferos indicaram que as caspases podem regular tanto a morte celular por apoptose e não apoptóticas [19].

Para as últimas décadas, os investigadores têm incidido sobre o papel central de Akt em muitos cancros humanos [20], [21], [22], [23], [24], [25]. via de sinalização de Akt emergiu como uma rota central para a regulação de vários processos celulares, incluindo a sobrevivência e proliferação de muitos tipos de células. Até à data, muitos cancros humanos mostram hiperactivação das quinases AKT, assim, a inibição da Akt é considerada como uma estratégia promissora para o tratamento do cancro [26], [27], [28], [29], [30], [31],

no presente estudo, nós exploramos que a possibilidade de que Rhabdastrellic ácido-a matou células cancerosas humanas através da indução de autofagia [32].

. Verificou-se que as células Hep3B e A549 tratadas com ácido Rhabdastrellic-morfológico foram submetidos a alterações bioquímicas e consistentes com a indução de autofagia e morte celular. O mecanismo de indução de autofagia por Rhabdastrellic ácido-A está associada com a inibição da Akt.

Resultados

1. Rhabdastrellic ácido-A induzida por caspase-independente de morte celular em células Hep3B e A549

O tratamento de células Hep3B e A549 durante 3 d, com várias concentrações de ácido Rhabdastrellic-A resultou na inibição do crescimento das células em uma dose-dependente maneira. IC

50 valor foi de 0,42 ug /mL e 2,50 ug /mL (Fig. 2A). A inibição do crescimento celular pode ser o resultado da indução da apoptose, autofagia e /ou paragem do ciclo celular. células Hep3B e A549 tratadas com várias concentrações de ácido Rhabdastrellic-A durante 48 h, e analisadas para o ciclo celular por citometria de fluxo. FIG. 2B mostrou que Rhabdastrellic ácido-A não induziu a paragem do ciclo celular em células A549 Hep3B e dentro destas gamas de concentração a 48 h. Desse modo, nós investigamos se Rhabdastrellic ácido-A pode induzir a apoptose ou morte celular associada a autofagia em Hep3B e células A549.

A. As células cancerígenas foram plaqueadas a uma densidade de 8000 células /poço numa placa de 96 poços. O estoque de ácido Rhabdastrellic-A foi adicionada aos poços. As células foram cultivadas durante 3 dias. ensaio de MTT foi realizado. B. Hep3B e células A549 foram tratadas com as concentrações indicadas de ácido Rhabdastrellic-A durante 48 h, e analisadas para o teor de ADN por citometria de fluxo. Os resultados foram representativos de 3 experiências.

Muitos tipos de agentes anti-cancro funcionam para induzir apoptose de células de cancro que se caracteriza pela caspase-3 e PARP de clivagem. Para determinar se a morte celular foi dependente de caspase, que detectada pela primeira vez a clivagem de caspase-3. Utilizando a análise de imunotransf erência, não foi observada a clivagem de caspase-3 em ambas as células de cancro após tratamento com ácido Rhabdastrellic-A. A clivagem da PARP também não era detectável (Fig. 2A). A clivagem de caspase-3 e PARP, também foi detectada em ambas as linhas de células tratadas com adriamicina. Os resultados mostraram que a pró-caspase-3 foi clivada para produzir uma fragmentação KDa 17 e PARP foi clivada em 89 KDa a seguir ao tratamento fragmentação adriamicina (Fig. 3A). Além disso, o inibidor da pan-caspase, z-VAD-fmk, não inibiu Rhabdastrellic ácido-A morte celular induzida (Fig. 3B). Para confirmar ainda que uma ácido-morte celular induzida principalmente Rhabdastrellic não apoptóticas, células Hep3B e A549 expostas a várias concentrações de ácido Rhabdastrellic-A, foram analisados ​​em intervalos de 48 h por ensaio de coloração /PI anexina V-FITC. Como mostrado na Fig. 3C, as taxas mais elevadas apoptóticas foram de 4,4% em células Hep3B e 0,2% em células A549 depois de tratamento. Estes resultados indicam fortemente que Rhabdastrellic ácido-A induziu uma morte celular independente de caspase em Hep3B e células A549.

A. em Hep3B e células A549, os lisados ​​celulares foram preparados a partir de 0,1% de DMSO, 1 ug /mL de ácido Rhabdastrellic-A ou 4 uM adriamicina durante 24 h e 48 h. A análise por Western blot foi realizada com os anticorpos de caspase-3 e PARP. B. As células foram incubadas com várias concentrações de ácido Rhabdastrellic-A na presença ou ausência de 20 uM de Z-VAD-fmk, durante 3 d. ensaio de MTT foi realizado. Os resultados (média ± S.E..) Representam a média de três experiências. C. Hep3B e células A549 foram tratadas com 0 a 4 ug /mL de ácido Rhabdastrellic-A durante 48 h. Após o tratamento, as células foram recolhidas sequencialmente e coradas com Anexina V e PI e analisadas por citometria de fluxo de ensaio.

2. morte celular associada a autofagia induzida por Rhabdastrellic ácido-A em células cancerosas

Rhabdastrellic ácido-A induz a formação de autofagossomas.

A cadeia leve associada a membrana 3 proteínas, LC3 MAP (Atg8) , localiza na membrana e alongamento permanece na membrana até maturação autophagosome. Ele é um marcador de chave para autofagia. Após a indução de autofagia, LC3-I é convertido LC3-II, que é mais provável conjugado com f osf atidiletanolamina (PE) e firmemente ligada às membranas autophagosomal formando estruturas em forma de anel no citoplasma. Para medir a autofagia, as células Hep3B e A549 foram transfectadas com uma construção de expressão para LC3 fundida a proteína fluorescente amarela (YFP-LC3). Nas células de controlo tratadas com DMSO YFP-LC3 estava uniformemente distribuído por todo o citoplasma. Após Rhabdastrellic ácido-A tratamento, estruturas em forma de anel eram detectáveis ​​no citosol, indicando a associação de YFP-LC3 com membranas autophagosomal seguindo uma indução de autofagia (Fig 4A). Análise ultra-estrutural das células A549 tratadas com ácido-A Rhabdastrellic por microscopia eletrônica mostrou grandes vacúolos autofágicos em contraste com células de controlo, onde nenhum desses vacúolos poderia ser detectada (Fig. 4B).

A. células Hep3B e A549 foram transfectadas com uma construção de expressão para a LC3 fundida com a proteína fluorescente amarela (YFP-LC3) durante 24 h. Em seguida, as células foram tratadas com ou sem 1 ug /ml ou 4 ng /ml de ácido Rhabdastrellic-A durante 36 horas, e visualizados sob um microscópio confocal. micrografia B. eletrônica mostrando vacúolo autofágica de células A549 seguintes 4 mcg /mL Rhabdastrellic ácido Um tratamento. C. ácido Rhabdastrellic-A dependente do tempo induzida a formação de LC3-II, um marcador para autofagia. células Hep3B e A549 foram tratadas com 1 ug /mL de ácido Rhabdastrellic-A durante os tempos indicados. Os lisados ​​foram analisados ​​por immunoblotting com anticorpo LC3.

expressão LC3-II induzida por Rhabdastrellic ácido-A em células cancerosas.

A quantidade de forma PE-conjugado de LC3 (LC3- II) correlaciona-se bem com o número de autofagossomas. Após Rhabdastrellic ácido-tratamento para os tempos indicados, LC3 foi detectada por imunotransferência análise. Os resultados indicaram que a expressão de LC3-II foi gradualmente upregulated (Fig 4C). Isto confirmou os resultados de transfecção YFP-LC3 e indicou que Rhabdastrellic ácido-A poderia induzir a autofagia em células Hep3B e A549.

morte celular associada a autofagia induzida por Rhabdastrellic ácido-A em células cancerosas.

para confirmar que Rhabdastrellic ácido-a morte celular associada a autofagia induzida, as células Hep3B foram tratados com ácido Rhabdastrellic-a e /ou 3-metiladenina (um inibidor de PI3K-C3 comumente utilizado para a inibição específica da autofagia). Em contraste com células de controlo, após Rhabdastrellic ácido-A de tratamento, a maioria das células Hep3B apareceu rodada, alguns foram descoladas a partir da superfície de poços e o número de células foi reduzido (Figura 5A). No entanto, os efeitos de Rhabdastrellic ácido-Um tratamento foram revertidas por 3-MA (Figura 5A). Foi sugerido que a indução da morte celular por Rhabdastrellic ácido-Um tratamento foi bloqueada quando as células foram tratadas em paralelo com inibidor autofagia 3-MA.

. células Hep3B foram tratados com 1 ug /mL de ácido Rhabdastrellic-A e /ou mM de 3-MA 10 durante 36 h, e depois examinadas por microscópio invertido. *, P 0,05 vs. Rhabdastrellic ácido-A- /3-MA-. **, P 0,05 vs. Rhabdastrellic ácido-A + /3-MA-. B. Os lisados ​​de A549-Vetor e células A549-shAtg5 foram analisados ​​por immunoblotting com Atg5 e anticorpos LC3. C. As células A549 do vector e as células A549 foram cultivadas-shAtg5 a 6000 células por poço numa placa de 96 poços, expostas a diferentes concentrações de ácido-Rhabdastrellic Um 0,05-3,2 ug /ml durante 72 h. A inibição do crescimento foi detectada utilizando o ensaio de MTT. Os valores apresentados são a média ± desvio padrão de amostras em triplicado de uma experiência representativa. * P-vlaue 0,05, em comparação com as células tratadas da mesma forma, mas sem transfectadas shRNA. D. Células A549 foram incubadas com 4 ug /mL de ácido Rhabdastrellic-A e /ou mM de 3-MA 10 durante 24 h. A morte celular foi quantificada por citometria de fluxo como ensaio de coloração de PI. O experimento foi repetido 3 vezes.

esgotamento baseados em shRNA de uma proteína essencial autofagia Atg5, efetivamente bloqueou a acumulação de LC3-II induzida por ácido-A Rhabdastrellic (Fig 5B). E a inibição da autofagia pela depleção de Atg5 inibida induzida por ácido-A morte celular em células A549 Rhabdastrellic dentro das gamas de concentração de 0,05-3,2 ug /ml (Figura 5C).

A549 células expostas a 4 fiM Rhabdastrellic ácido-a e /ou 3-MA foram analisadas para a morte celular em 24 h por citometria de fluxo. De iodeto de propídio (PI) positivo foram contadas como células “mortas”. A morte celular induzida por ácido Rhabdastrellic-A foi suprimida quando as células foram tratadas, em combinação com o 3-MA (Fig. 5D).

3. Rhabdastrellic ácido-A Akt inibida em células Hep3B e A549

Rhabdastrellic ácido-A pode inibir Akt em células HL-60 [4]. Assim, foi interessante testar se era o mesmo em outras células cancerosas. Como mostrado na Fig 6A, Após Rhabdastrellic ácido-tratamento para os tempos indicados ou várias concentrações, Rhabdastrellic ácido-A inibiu a fosforilação de Akt em Hep3B e células A549.

Hep3B e células A549 foram tratadas com ácido Rhabdastrellic -A nas concentrações indicadas, durante 36 h ou tratados com 1 ug /ml ou 4 ng /ml de ácido Rhabdastrellic-a durante os tempos indicados. A. As culas foram recolhidas e lisadas sequencialmente. Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por imunotransferência com anticorpos fosfo-Akt ou Akt. B. mTOR, fosfo-mTOR, FKHR, fosfo-FKHR, STAT3 e fosfo-STAT3 foram analisados ​​por imunotransf erência. O experimento foi realizado 3 vezes.

mTOR, FKHR e STAT3 estão três alvos a jusante importantes da Akt e desempenham papéis fundamentais na autofagia e apoptose [33]. Tal como mostrado nos resultados (Figura 6B), a fosforilação de mTOR, FKHR e STAT3 tiveram diminuição dramática após Rhabdastrellic-ácido a um tratamento num modo dependente do tempo em ambas as linhas celulares. Estes resultados indicaram que a Akt foi inibida por Rhabdastrellic AICD-A em células Hep3B e A549.

4. A indução de autofagia por Rhabdastrellic ácido-A foi anulada pela expressão ectópica Akt activa constitutiva

Rhabdastrellic ácido-A pode inibir Akt e induzir a autofagia em células Hep3B. A fim de confirmar adicionalmente um papel intrínseca de Akt em autofagia induzida por ácido Rhabdastrellic-A, que transfectado nas células Hep3B com plasmídeos MYR-Akt1 (activado) e seleccionada o clone positivo utilizando G418. Em comparação com as células de controlo (células Hep3B transfectadas com o plasmídeo vector), a expressão de Akt exógena aumentou significativamente em Hep3B /células MYR-Akt1 (Fig. 7A). Além disso, o marcador de autofagia foi determinado enquanto expressão Akt activa constitutiva em células Hep3B. Em comparação com as células de controlo, foi observada a indução de autofagia massiva em células Hep3B, indicados por aumento de LC3-II. No entanto, expressando constitutiva Akt ativo bloqueado aumento de LC3-II (Fig 7B). Consistente com a ideia de que alguns população de LC3-II é degradada em lisossomas [34], o tratamento com inibidores da enzima lisossómica Pepstatina A resultou na acumulação de LC3-II em células de cancro (Fig 7c), este fenómeno também foi diminuída, enquanto activa constitutiva expressão ectópica Akt. Além disso, a expressão constitutiva de Akt activo poderia salvar células Hep3B de inibição do crescimento mediada por um ácido sob tratamento Rhabdasterllic de ácido Rhabdastrellic-A (Fig. 7D). Estes resultados mostrados na figura 7 indicou que constitutiva expressão Akt ativa poderia inibir a autofagia Rhabdastrellic ácido-A-mediada.

A. A. o clone positivo expressa estavelmente MYR-Akt1 foram analisados ​​por imunotransferência com anticorpos Akt. B. células Hep3B foram tratados com 1 ug /mL de ácido Rhabdastrellic-A durante 36 horas na ausência ou presença da expressão ectópica Akt activa constitutiva. Em seguida, a expressão de proteínas foi analisada LC3. C. células do cancro foram tratadas com 1 ug /mL de ácido Rhabdastrellic-A e /ou 10 ug /mL de pepstatina A (pepA) durante 36 h, foi analisada Em seguida, a expressão da proteína LC3. D. Após o tratamento, as células viáveis ​​de duas linhas de células foram medidos. *, P . 0,05 vs. Rhabdastrellic ácido-A (vector)

Para investigar se outras vias estão envolvidos na autofagia induzida por Rhabdastrellic ácido-A, foram analisados ​​os níveis de Bip, CHOP, fosfo -EIF2α e fosfo-AMPK em células Hep3B seguinte Rhabdastrellic ácido-Um tratamento. Os resultados mostraram que a fosforilação da AMPK, eIF2a CHOP e aumentou após Rhabdastrellic-ácido a um tratamento num modo dependente da dose em células Hep3B. No entanto, um aumento do BIP não foi detectada (mostrado na Fig. S1). Estes resultados indicaram que múltiplas vias pode estar envolvido na Rhabdastrellic autofagia ácido-induzido-A.

Discussão

Os resultados descritos aqui demonstram que Rhabdastrellic ácido-A pode induzir autofagia nas linhas celulares de cancro humano . Rhabdastrellic ácido-A poderia bloquear Akt em células Hep3B e A549, e expressão Akt activa constitutiva poderia inibir a autofagia Rhabdastrellic ácido-A-mediada. Estes resultados indicaram que a inibição da via de Akt /mTOR está envolvida em Rhabdastrellic ácido-A induzida autofagia e morte celular.

Autophagy tem sido relatada como sendo um processo pelo qual vacúolos de dupla membrana denominada forma em torno autofagossomas, engolir, e citosol organelas. Embora autofagia foi relatado como para efectuar uma resposta prosurvival, em alguns caso, a citotoxicidade de trióxido de arsénico, imatinib, etc. radiação ionizante para alguns tipos de células é mediada pela indução de autofagia. Nestas condições, a autofagia constitui uma via nonapoptotic para a morte celular programada. Muitos relatórios mostram que triterpenóides têm potencial de citotoxicidade de linhas celulares de cancro [35], [36]. Rhabdastrellic ácido-A é uma das triterpenóides que a morte celular induzida não apoptóticas em células Hep3B e A549. Portanto, nós exploramos se era necessária a indução de autofagia em-Um ácido morte celular Rhabdastrellic mediada nestas duas linhas celulares de cancro. células autofágica ampliar sem permeabilização da membrana plasmática, converter LC3-I para LC-II, mostra pontuada LC3 citoplasmática translocação e desenvolver autophagosome. Neste estudo, as células Hep3B e A549 características morfológicas e bioquímicas que são característicos de células em autofagia exibiu, não apoptose após Rhadastrellic ácido-Um tratamento. Além disso, a inibição do crescimento de ácido Rhabdasterllic-A em células A549 foi mais fraco do que em células Hep3B. Mas Rhabdasterllic ácido-A aumentou mais expressão LC3-II. Conversão de LC3-I lc3-II pode ser observado na iniciação autofagia. Mas parcial LC3-II pode ser degradada quando a maturação autofagia. Apenas expressão LC3-II não poderia indicar a sensibilidade à autofagia.

Estudos anteriores sobre mecanismo subjacente a regulação da autofagia em células cancerosas mostrou que a autofagia foi regulada por múltiplas vias de sinalização tão diversas como a classe III PI 3-quinase , e a protea-quinases da mTOR, ERK e p38. activação aberrante de Akt /mTOR via de sinalização foi implicada numa variedade de malignidade humanas [20], [21], [22], [23], [24], [25], [37]. Akt fosforilada desempenha um papel central em alguns processos fundamentais, incluindo a proliferação celular, morte celular, motilidade /adesão celular, transformação de células, e a neovascularização. Quando activado, Akt actua como um factor de sobrevivência de prevenção da libertação de citocromo c das mitocôndrias e inactivação FKHR que é conhecido por induzir a expressão de factores pró-apoptóticos tais como o ligando Fas [38]. A inibição da mTOR induz apoptose em certos tipos de células tumorais, ao passo que eles provocam autofagia em outras configurações. A rapamicina, um inibidor de mTOR, foi relatado para induzir a morte celular autophagic clássico em células cancerosas. O nosso estudo anterior também mostrou que Rhabdastrellic ácido-A PI3K inibido /Akt e a apoptose induzida na leucemia humana HL-60 as células [4]. Assim, a inibição da Akt pode activar algumas proteínas relacionadas à autofagia e induzir a autofagia. De acordo com esta conclusão, observamos que Rhabdastrellic ácido-A pode inibir a fosforilação de Akt em Hep3B e células A549. A fosforilação de mTOR, FKHR e STAT3 também diminuiu drasticamente após Rhabdastrellic ácido-Um tratamento. Além disso, ectópica expressão Akt activa constitutiva poderia bloquear a autofagia induzida por Rhadastrellic ácido-A. Tomados em conjunto, Rhadastrellic ácido-A autofagia através da inibição da via de Akt /mTOR induzida.

Em resumo, os estudos actuais mostram que o ácido Rhabdastrellic-A mata Hep3B e células A549 através da indução de autofagia. A inibição da via de Akt /mTOR desempenha um papel fundamental na autofagia Rhabdastrellic ácido-A-mediada. Como as células tumorais frequentemente adquirem defeitos de autofagia em comparação com as células normais, ativação farmacológica da autofagia através da inibição da Akt /mTOR pode matar células cancerosas e tumorigênese limite, especialmente em cancros com defeitos de apoptose. Nosso estudo também fornece a evidência de que Rhabdastrellic ácido-A merece uma investigação mais aprofundada como um potencial agente anti-cancerígeno ou agente preventivo do câncer.

Materiais e Métodos

Drogas e reagentes

Rhabdastrellic ácido -A foi isolado a partir da esponja rhabdastrella globostellata e inicialmente dissolvidos em 100% Dimethylsulfoxid (DMSO) e armazenada a -20 ° C. brometo Methylthiazolyldiphenyl-tetrazólio (MTT) e 3-metiladenina (3-MA) ​​foram adquiridos à Sigma Co. (Sigma Aldrich, M2128). Meio RPMI 1640 foram adquiridos a partir de Invitrogen (Invitrogen, 11875).

linhas de células e cultura celular

A linha de células de carcinoma hepatocelular humano Hep3B [39] e o adenocarcinoma do pulmão linha celular epitelial A549 humano [40] foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro inactivado por calor fetal de bovino, penicilina (50 U /ml) e estreptomicina (50 ug /mL). As células foram incubadas a 37 ° C em CO2 a 5% humidificada.

Ensaio MTT

As células foram plaqueadas em placas de 96 poços. O estoque de ácido Rhabdastrellic-A foi diluído, adicionado aos poços para a concentração de ensaio final desejada. Depois de 3 dias de exposição a ácido Rhabdastrellic-A, 10 ul de MTT (5 mg /L) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante mais quatro horas, em seguida, o líquido nos poços foi evaporado. 100 mL de DMSO foi adicionado a cada poço. A absorvência foi detectada no leitor de microplacas modelo 550 com comprimento de onda de 565 nm (Bio-Rad Co., 17024). A inibição do crescimento foi calculada e IC

50 valor foi determinado usando o Software Bliss.

anexina V-FITC /PI ensaio de coloração

As células com diferentes tratamentos foram recolhidas, ressuspensas com 10% de 1640 meio, ajustada a concentração de suspensão de células a cerca de 1 × 10

6 células /ml, e transferidos 0,5 ml de suspensão de células para um tubo de microcentrífuga. Depois adicionaram-se 10 ul meios de ligação do reagente e 1,25 ul de anexina V-FITC, as células foram incubadas à temperatura ambiente durante 15 min no escuro meios, depois centrifugada e removido. amostras Quando ressuspensas em 0,5 ml de frio 1 × tampão de ligação (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 2,5 mM, MgCl2 a 1 mM, 20% de BSA a pH 7,4), foram adicionadas células iodeto de propídio 10 ul (30 ug /ml), colocando em gelo e ao abrigo da luz. A apoptose foi analisada por citometria de fluxo ((Beckman Coulter, Fullerton, CA) no comprimento de onda de 488 nm imediatamente.

detecção ciclo celular

As células foram recolhidas, ressuspensas em 1 ml de etanol a 70% pré-arrefecido , e fixados em 4 ° C durante a noite. etanol Depois de removido e adicionou-se 0,5 ml de solução de coloração (50 ug /ml de IP, 100 ug /ml de ARNase, 0,2% de Triton-100), as células foram incubadas em 37 ° C durante 30 min no sombrio. distribuição do ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo ((Beckman Coulter, Fullerton, CA) no comprimento de onda de 488 nm imediatamente.

coloração PI ensaio

as células foram tripsinizadas com 0,5 ml de 0,25% tripsina durante 3 minutos, recolhidas e ressuspensas em 1 ml pré-arrefecido PBS. Depois adicionou-se 0,5 ml de solução de coloração (50 ug /PI ml, 100 ug /ml de ARNase, 0,2% de Triton-100), as células foram incubadas em 37 ° C durante 30 min na morte celular escuro. foi detectada por citometria de fluxo ((Beckman Coulter, Fullerton, CA).

a microscopia confocal e imunofluorescência indirecta

as células foram cultivadas em lamelas de vidro e transfectadas com pYFP-LC3 para Hep3B e células A549. 36 h após a transfecção as células foram tratadas com ácido Rhabdastrellic-A e analisadas após 36 h adicionais. As células foram fixadas com paraformaldeído a 4% em PBS durante 30 min à temperatura ambiente, as lâminas foram montadas em anti-desvanecimento solução e armazenado a 4 ° C. As lamelas foram visualizados com um microscópio de varredura a laser confocal (Olympus, FV-1000).

A microscopia eletrônica

As células foram fixadas por imersão em uma mistura de glutaraldeído 2,5%, 2,5% de paraformaldeído e ácido pícrico a 0,05% em tampão de cacodilato de 0.067M (pH 7,4). Postfixation foi realizada em 1% de tetróxido de ósmio, seguido por uma imersão durante a noite com 0,3% uranylacetate dissolvido em 50 mM de tampão de maleato de (pH 5,0). foram empregados procedimentos padrão para a desidratação e incorporação em Epon. lâminas delgadas foram ainda coradas com citrato de chumbo, e foram examinados em um microscópio eletrônico (Philip, CN10).

Western blot análise

Os lisados ​​foram preparados a partir de 4 × 10

5 células por dissolução de peletes de células em 100 uL de tampão de lise (na 20 mM

2 PO?

4 (pH 7,4), NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, 1% de aprotinina, fluoreto de phenymethysulfonyl 1 mM, 10 mg /mL leupeptina, NaF 100 mM, e 2 mM de Na

3VO

4). Os lisados ​​foram centrifugados a 12000 rpm durante 10 min. O sobrenadante foi recolhido. O teor de proteína foi determinada utilizando o ensaio de proteína Bio-Rad. de tampão de amostra de SDS-PAGE (10 mM Tris-HCl, pH 6,8, SDS a 2%, glicerol 10%, DTT 0,2 M) foi adicionado em lisados. Os lisados ​​foram aquecidos a 100 ° C durante 5 min, e 40 ug de proteína foi carregada em cada poço de um gel SDS-PAGE a 4-20%. proteínas resolvidas foram transferidas electroforeticamente para nitrocelulose e incubadas sequencialmente com anticorpo primário e peroxidase de rábano conjugada com IgG de cabra anti-rato (Santa Cruz, sc-2005) ou anticorpo de cabra anti-coelho-IgG (Santa Cruz, sc-2004). Após a lavagem, o complexo anticorpo ligado foi detectado usando reagente de LumiGLO (Cell Signaling Technology, # 7003) e filme XAR (Kodak, XBT-1), como descrito pelos fabricantes. Foram utilizados os seguintes anticorpos primários: anticorpo de caspase-3 (Santa Cruz, sc-7272), anticorpo de PARP (Santa Cruz, sc-7150), gliceraldeído anticorpo 3-fosfato desidrogenase (Santa Cruz, SC-47724), o anticorpo LC3 (Novus Biologicals, NB100-2220), anticorpo Atg5 (Cell Signaling Technology, # 2630), fosfo-Akt1 /2/3 (Ser473) anticorpo (Santa Cruz, SC-7985-R), anticorpo Akt1 (Santa Cruz, sc-1618) , Phospho-mTOR (ser2448) anticorpo (Cell Signaling Technology, # 2971), anticorpo mTOR (Cell Signaling Technology, # 2972), Phospho-FKHR (ser256) anticorpo (Cell Signaling Technology, # 9461), anticorpo FKHR (tecnologia de sinalização celular , # 9462), Phospho-STAT3 (ser727) anticorpo (Santa Cruz, o anticorpo STAT3 sc-8001-R), (Cell Signaling Technology, # 9132).

Plasmids e transfecção

myr -Akt1 (# 21-151 activado) ou vazio plasmídeo (pUSEamp (+) # 21-147) foram adquiridos a partir de células Hep3B do norte do estado Co. foram semeadas em placas de 6 poços um dia antes da transfecção. As transfecções de MYR-Akt1 (activada) ou o plasmídeo vazio (vector) foram realizadas com Lipofectamina 2000 (Invitrogen, 11668019) de acordo com o protocolo sugerido pelo fabricante. Após 48 h de transfeco, os clones positivos foram seleccionados sob a G418 (1000 ug /mL).

construtos, Retroviral infecção e RNA de interferência

Para a expressão estável Atg5 siRNA, o vector retroviral ( pSUPER. puro, um presente do professor Musheng Zeng, Cancer Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou, China) seqüências de RNA que codificam hairpin foi construído. A sequências distintas curto RN hairpin (shRNA) contra Atg5 (shATG5) foram gerados e clonado no vector de expressão.