Abstract

RASSF1C é uma das principais isoformas do gene RASSF1, e está emergindo como um oncogene. Isto está em contraste com a isoforma RASSF1A, que é um supressor de tumor estabelecido. Nós temos mostrado previamente que RASSF1C promove a proliferação de células de câncer de pulmão e identificaram genes alvo RASSF1C com funções de crescimento promovendo. Aqui, nós relatamos ainda que RASSF1C promove a migração de células do cancro do pulmão e melhora a formação esfera tumor de células do cancro do pulmão. Também mostram que a sobre-expressão RASSF1C reduz os efeitos inibidores de o agente anti-cancro, o ácido betulinico (Ba), na proliferação de células de cancro de pulmão. Em trabalhos anteriores, demonstramos que RASSF1C-se regula

piwil1

expressão genética, que é um gene auto-renovação das células-tronco que é sobre-expressos em vários cancros humanos, incluindo o cancro do pulmão. Aqui, nós relatamos sobre os efeitos da BA no

piwil1

expressão do gene. As células tratadas com BA mostram diminuição

expressão piwil1

. Além disso, a interação de IGFBP-5 com RASSF1C parece prevenir RASSF1C de up-regulação dos níveis de proteína PIWIL1. Estas descobertas sugerem que a IGFBP-5 pode ser um modulador negativo de RASSF1C /PIWIL1 actividades promotoras de crescimento. Além disso, verificou-se que a inibição da via ATM-AMPK up-regula a expressão de genes RASSF1C

Citation:. Reeves ME, Firek M, Chen ST, Amaar YG (2014) A prova de que RASSF1C Estimulação da Cancer Cell Lung proliferação Depende de IGFBP-5 e os níveis de expressão PIWIL1. PLoS ONE 9 (7): e101679. doi: 10.1371 /journal.pone.0101679

editor: Pierlorenzo Pallante, Institute of Experimental Endocrinology and Oncology “G. Salvatore ‘(IEOS), Itália |

Recebido: 10 de junho de 2013; Aceito: 11 de junho de 2014; Publicação: 09 de julho de 2014

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. O trabalho é financiado pela Loma Linda Cancer Center. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O gene RASSF1 desempenha um papel importante no crescimento de células de cancro humano e progressão. Ele codifica várias isoformas, os mais importantes dos quais são RASSF1A e RASSF1C. RASSF1A é o supressor de tumor mais frequentemente inactivado em cancros humanos, principalmente por meio de metilação do promotor específico. Ele inibe o crescimento celular e migração, e promove a apoptose. Por outro lado, a isoforma RASSF1C é bem expressa na maioria dos cancros humanos, e parece funcionar como um oncogene. Em contraste com RASSF1A, que promove a proliferação de células de cancro e migração, e atenua a apoptose [1] – [13]. Assim, o gene RASSF1 parece desempenhar um importante papel no cancro dupla, funcionando alternativamente, como um supressor de tumores e como um oncogene [1] – [15]. Consistente com este conceito, os estudos recentes mostram que a expressão de RASSF1C é sobre-regulada em tecido de carcinoma de pulmão humano em comparação com os tecidos normais correspondentes, e está associada com a progressão do cancro e prognóstico pobre [13]. Além disso, RASSF1C sobre-expressão (mas não RASSF1A sobre-expressão de) em células cancerosas humanas aumenta a acumulação do oncogene β-catenina, um jogador chave na via de sinalização Wnt, levando ao aumento de activação da transcrição e a proliferação de células [16].

Temos demonstrado anteriormente que a sobre-expressão de RASSF1C up-regula (e silenciamento de RASSF1C sub-regula) a expressão de PIWIL1, um gene de células-tronco auto-renovação [12]. A família de genes Piwil é uma subfamília de proteínas Argonaute que desempenha um papel central em células estaminais auto-renovação, a gametogénese, e silenciamento do gene da transcrição numa larga variedade de espécies. As proteínas ligam-se Argonaute pequenos RNAs e eles são caracterizados por terminal amino (N), Paz (Piwil-Argonaute-Zwille), MID (meio), e os domínios piwi [17]. Nos seres humanos, três Piwil (Piwil 1 (também chamado Hiwi), Piwil2, e Piwil3) genes foram identificados. Piwi perfis de expressão de proteína recentemente recebido muita atenção por seu envolvimento funcional potencial na oncogênese em uma variedade de cancros humanos e Piwil1 e Piwil 2 têm se mostrado fatores prognósticos independentes no câncer gástrico [17] – [19]. As proteínas que interagem PIWIL e seus pequenos RNAs (piRNAs) podem desempenhar um papel na tumorigénese através do aumento da metilação de genes e silenciamento dos inibidores de quinase dependentes de ciclina e supressores tumorais. As proteínas que interagem PIWIL e seus pequenos RNAs (piRNAs) podem desempenhar um papel na tumorigénese através do aumento da metilação de genes e silenciamento dos inibidores de quinase dependentes de ciclina e supressores de tumor [17] – [19]. Estudos recentes mostram que a sobre-expressão de PIWIL1 promove sarcomagenesis e sub-regula uma série de supressores tumorais, incluindo o factor de crescimento semelhante a insulina de ligação proteína 5 (IGFBP-5) [20]. A IGFBP-5 é um membro da família de proteínas de ligação a IGF envolvida na regulação dos mitogénios de IGF I e II. IGFBP-5 é extremamente importante no câncer humano progressão [21]; e nós temos mostrado previamente que RASSF1C é um parceiro de ligação de IGFBP-5 [20].

Assim, queríamos determinar se RASSF1C medeia os seus efeitos sobre as células cancerosas através de interações com IGFBP-5 e PIWIL1. A fim de fazer isso, nós projetamos experimentos para determinar os efeitos de RASSF1C sobre a formação de proliferação de células do cancro do pulmão, a migração ea esfera tumor. Uma vez que o agente anti-cancro, o ácido betulinico (BA), foi mostrado para regular negativamente a expressão do gene PIWIL1 [22], foram estudados os efeitos de BA e RASSF1C /IGFBP-5 interacção sobre a expressão do gene PIWIL1 e os níveis de proteína β-catenina . Descobrimos que RASSF1C promove a formação de migração de células de cancro e esfera do tumor, e reduz a inibição da proliferação por BA. Além disso, a interacção da IGFBP-5 com RASSF1C impedido RASSF1C mediada por sobre-regulação de PIWIL1. Por último, o silenciamento de expressão do gene PIWIL1 diminuiu os níveis de proteína β-catenina, o que indica que PIWIL1 pode contribuir para a sinalização de Wnt. Assim, RASSF1C, IGFBP-5, PIWIL1, e a via Wnt poderia funcionar em conjunto, como um novo eixo que o crescimento de células de cancro do pulmão e impactos progressão.

Materiais e Métodos

cultura celular

As linhas celulares de cancro de pulmão humano NCI-H1299 e A549 foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). A549 é RASSF1A negativo, p16 negativo e p53 positivo enquanto NCI-H1299 é RASSF1A negativo, p16 negativo e negativo p53. A cultura celular foi levada a cabo tal como recomendado pela ATCC.

vectores de expressão do gene

RASSF1C, IGFBP-5, e RASSF1A foram sobre-expressos em células de cancro do pulmão humano utilizando indutível Vírus da Leucemia de Murídeo (MLV) Os vectores retrovirais baseados como previamente descrito [12].

O número de células contagem

células NCI-H1299 estavelmente transduzidas com MLV-espinha dorsal (BB) e MLV-HA-RASSF1C (1C) foram tratados com 1 ug /mL de doxiciclina durante 72 h, e depois as células foram contadas utilizando um hemocitómetro. As experiências foram repetidas pelo menos 3 vezes.

ensaio Alamar Blue

proliferação celular /viabilidade foi medida pelo ensaio Alamar Blue como descrito anteriormente [11], [12]. Os experimentos foram repetidos pelo menos 3 vezes e os dados foram analisados ​​por meio de teste t.

In vitro

invasão celular ensaio

O BD BioCoat Matrigel Invasion Câmara (BD Biosciences, Bedford, MA) foi utilizado para levar a cabo ensaios de invasão de células de cancro de pulmão. NCI-H1299-BB (controlo) ou NCI-H1299-1C (que sobre-expressam RASSF1C) células foram semeadas a uma densidade de 25.000 células nas câmaras de Matrigel e cultivadas em meio RPMI isento de soro-1640 durante 24 h. As câmaras contendo as células NCI-H1299-NCI H1299-1C-BB e foram então transferidos para o meio contendo bem suplementado com soro bovino de vitelo a 10% durante 24 h. As células na superfície inferior da membrana foram fixadas com metanol e coradas com azul de toluidina a 1%. As membranas coradas foram fotografadas através do microscópio e as células foram contadas invasores. Os experimentos foram repetidos pelo menos 3 vezes.

esfera Tumor formação

Um Kit CD133 microbead (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) foi utilizado para isolar a população lado A549 (SP, CD133

+, non-SP (CD133

-tronco do câncer células) e – células) utilizando uma citometria de fluxo de protocolo do fornecedor. As células foram isoladas a partir de SP A549 transduzidas com qualquer controle MLV-espinha dorsal (A549-BB) ou MLV-HA-RASSF1C (A549-1C). células SP e não-SP foram em seguida incubadas em meio isento de soro suplementado com EFG (20 ng /ml) e de FGF (10 ng /mL) para promover as células SP para formar esferas de tumores durante três semanas. esferas de tumor foram fotografadas, recolhido, e plaqueadas em meio suplementado com soro de vitelo a 10%, e as células foram cultivadas até 70% de confluência. Em seguida, as células foram usadas para análise de Western blot para verificar a expressão de HA-RASSF1C exógeno.

Isolamento de ARN e análise de RT-PCR

O ARN total a partir de linhas celulares de cancro do pulmão humano foi isolado a partir de culturas e transcriptase inversa (RT) -PCR foi realizada usando iniciadores específicos de gene PIWIL1 como previamente descrito [12]. A PCR foi realizada utilizando a mistura principal HotStart (Qiagen, Valencia, CA), e as reacções de PCR foram realizadas com as seguintes condições: 95 ° C durante 15 min, 95 ° C durante 1 min, 60 ° C durante 30 seg, e 72 ° C durante 30 seg durante 35 ciclos. A amplificação de cyclophyllin utilizando iniciadores de PCR específicos do gene foi utilizado como um controlo de carga. As reacções de RT-PCR foram realizadas em triplicado e a mudança de dobragem foi calculada utilizando a 2

método -ΔΔCT [23]. As corridas de RT-PCR foram repetidas pelo menos 3 vezes.

O ácido betulinico (BA) Tratamento

BA (Enzo Life Sciences, Nova Iorque, NY) foi dissolvido em DMSO a 5 mg /ml . As células A549 e NCI-H1299 foram plaqueadas a 5000 células /poço em placas de 96 poços. No dia seguinte, as células foram tratadas com 25 ug /ml BA durante 24 h. A proliferação celular foi então testada utilizando o ensaio Alamar Blue. As experiências foram repetidas pelo menos 3 vezes.

silenciamento de expressão Piwil1 em células de cancro do pulmão

células de cancro do pulmão (NCI-H1299) foram plaqueadas a 5000 /poço em placas de 96 poços 24 hr . antes da infecção e as células foram infectadas com a missão não-alvo shRNA Controle de Transdução de Partículas ou com múltiplos Missão lentivirais shRNA Transdução de Partículas (NMID: NM_004764) para silenciar RASSF1C (Sigma, St. Louis, MO), como descrito anteriormente [14]. As células foram tratadas com polibreno (Sigma, St. Louis, MO) durante duas horas antes da adição de partículas de Lentivirus a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 5. knockdown de validação

piwil1

expressão foi avaliada por Western blot e qRT -PCR utilizando o anticorpo RASSF1C e RASSF1C iniciadores específicos, respectivamente. As experiências foram repetidas pelo menos 3 vezes.

análise Western blot

análise de Western blot foi efectuada utilizando o Sistema Odyssey Infrared (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) e anti-β- catenina anticorpo # 9582 (Cell Signaling, Danvers, MA), anti-PIWIL1 anticorpo ab12337 (Abcam, Cambridge, MA), anti-HA clone de anticorpo 16B12 (Covance, Berkeley, CA), anticorpo de beta actina monoclonal AC-74 (Sigma, St. Louis, MO), e anticorpos secundários fluorescente-etiquetados IRDye 680RD Infrared Dye (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). As experiências foram repetidas pelo menos 3 vezes. Os níveis de proteína foram normalizados para níveis de actina (O controle de carga) com desvios-padrão.

transcriptoma PCR tela de matriz

Matriz SureFind transcriptoma PCR foi obtido de Qiagen (Catalog No. 336611. Ela consistia de 90 amostras de cDNA derivadas da linhagem celular MCF7 do cancro da mama tratadas com 90 inibidores químicos diferentes que regulam várias vias de sinalização. a matriz de PCR foi exibido com primers específicos de genes RASSF1C. a análise dos dados foi realizada por importar os valores Ct obtidos para o arranjo de dados SureFind transcriptoma PCR Software de análise de https://www.sabiosciences.com/tpadataanalysis.php (Qiagen). Os produtos químicos identificados como reguladores de expressão de genes RASSF1C foram usadas para o tratamento de células de cancro do pulmão para confirmar os seus efeitos sobre a expressão do gene RASSF1C utilizando RT-PCR.

Dorsomorphin Tricostatina a e tratamento

células de cancro do pulmão H1299 foram tratados com Dorsomorphin, também conhecido como o composto C (10 uM) ou tricostatina a (10 mM) em meio isento de soro durante 24 h antes de células foram coletadas para isolamento de RNA. As células de controlo foram tratadas com dimetilsulfóxido (DMSO). análise de RT-PCR utilizando RASSF1C, PIWIL1, e o gene cyclophyllin iniciadores específicos foi efectuado tal como mencionado acima. Dorsomorphin foi obtido a partir de Phoenix Pharmaceutical, Inc. (Burlingame, CA) e a Tricostatina A foi obtido a partir de reagentes directa (Encinitas, CA). Os experimentos foram repetidos pelo menos 3 vezes.

Análise Estatística

O t-teste foi usado para calcular a relevância dos dados.

Resultados

RASSF1C sobre-expressão aumenta o cancro do pulmão de células migração

a linha de células de cancro do pulmão NCI-H1299 foi transduzida com um vector retroviral como descrito anteriormente [12], [13] para criar uma linha celular estável que sobre-expressa RASSF1C. Descobrimos que RASSF1C estável sobre-expressão, não só aumentou a proliferação de células do cancro do pulmão (Figura 1), o que é consistente com as nossas descobertas anteriores usando transiente sobre-expressão de RASSF1C [11], mas também promoveu a migração de células (Figura 2).

células NCI-H1299 estavelmente transduzidas com MLV-espinha dorsal (BB) ou MLV-HA-RASSF1C (1C) foram tratados com 1 ug /ml de doxiciclina durante 72 h, e, em seguida, as células foram contadas. RASSF1C sobre-expressão (1C) aumentou a proliferação de células de 2,5 vezes, em comparação com o controlo (BB). Os dados são representativos de pelo menos 3 experiências independentes, e os valores representam a média ± SEM. * P . 0,05

. RASSF1C promove a migração de células do cancro do pulmão. (A) O BD BioCoat Matrigel Invasão câmara foi usada para avaliar a invasão de células /migração das células NCI-H1299 estavelmente transduzidas com vazio MLV-espinha dorsal (BB) ou MLV-HA-RASSF1C (1C). As células tratadas com doxiciclina em 1 ug /ml foram co-incubadas com meio contendo soro. Após 24 h, os lados inferiores dos filtros foram fixadas e coradas, as células em quatro campos microscópicos foram contadas. A contagem média de número de células foi representada graficamente. células (B) NCI-H1299 que sobre-expressam RASSF1C mostraram um maior número de células invasoras da câmara de Matrigel e migram para o outro lado do filtro em comparação com células de controlo NCI-H1299-BB. Os dados são representativos de pelo menos 3 experiências independentes, e os valores representam a média de contagem de colónias de células. * P . 0,05, como determinado pelo teste t de

RASSF1C melhora a formação de tumor de pulmão esfera

Tem sido demonstrado que as células CD133-positivos a partir da linha de células A549 pode dar origem a esferas de tumor e pode actuar como células tumorais de iniciação [24], [25]. Assim, quisemos avaliar o efeito da RASSF1C sobre-expressão no câncer de pulmão formação esfera tumor. Nós isolado população lado A549 (SP, CD133

+ células), o que exibir-tronco características semelhantes a células, e não-SP CD133

– células usando CD133 citometria de fluxo [24], [25]. As células foram isoladas a partir de SP A549 transduzidas com ambos os MLV-espinha dorsal (A549-BB) ou MLV-HA-RASSF1C (A549-1C). As células foram cultivadas em meio livre de soro suplementado com EFG e FGF para fazer com que células SP para formar esferas de tumor (Figura 3A). RASSF1C-SP-CD133

+ células formaram esferas mais e maior do tumor comparada com o controle BB-SP-CD133

+ células (Figura 3A). A fim de mostrar que a esfera de tumor progenitura ainda sobre-expresso RASSF1C, esferas de tumor foram isoladas, cultivadas e utilizadas para análise de Western blot. células SP fez RASSF1C fato sobre-expresso (Figura 3B). Tudo isso sugere que RASSF1C pode aumentar a proliferação de células estaminais do cancro do pulmão, e é possível que isso aconteça através de aumento da regulação do gene PIWIL1, um gene de células-tronco auto-renovação [12].

(A) Não -SP-1C CD133

-, SP-BB CD133

+, e SP-1C CD133

+ células isoladas a partir da linha celular de cancro do pulmão A549 foram cultivadas em meio isento de soro suplementado com 10 ng /ml de EGF e 20 ng /ml de FGF para promover a formação de tumor esfera de três semanas. células (B) A549 repopulated de esferas tumorais foram verificadas para a expressão de HA-HA-RASSF1C utilizando anticorpo. Como esperado, a SP-1C CD133- e CD133 + expressa HA-RASSF1C, enquanto as células SP-BB não o fez. Dados são representativos de pelo menos 3 experiências independentes.

RASSF1C reduz a sensibilidade das células de câncer de pulmão ao anti-câncer de ácido betulínico agente

O ácido betulinico (BA) é um anti-inflamatório e agente anti-cancro que tem sido demonstrado que promovem a apoptose e inibir a proliferação celular e migração. Ele faz isso, pelo menos em parte, pela-se regulando PIWILI, ciclina B1, ciclina D1, BCL2 e up-regulação da expressão do gene Bax, em vários tipos de células cancerosas, incluindo A549 [22], [26], [27]. Foi anteriormente demonstrado que a sobre-expressão RASSF1C-regula a expressão do gene PIWIL1 e, assim, queríamos determinar se RASSF1C sobre-expressão reduziria os efeitos anti-proliferativos de BA em células cancerígenas do pulmão. As nossas experiências mostraram que as células A549 e NCI-H1299 que sobre-expressam RASSF1C foram menos sensíveis a Ba efeitos anti-proliferativos em comparação com células de controlo (Figura 4), apoiando ainda um papel para promover o crescimento RASSF1C em células de cancro de pulmão.

A549 (a) e NCI-H1299 (B) células de cancro do pulmão que sobre-expressam RASSF1C foram tratadas com ácido betulínico (BA) durante 24 h. As células foram então ensaiadas quanto à viabilidade celular /proliferação. RASSF1C sobre-expressão reduziu significativamente a sensibilidade das células à BA. Os dados são representativos de pelo menos 3 experiências independentes, e os valores representam a média ± SEM. * P 0,05; porque 1C em comparação com BB

Efeitos da BA na expressão PIWIL1 em ​​células de câncer de pulmão

Tem sido relatado que o tratamento de células BA AGS adenocarcinoma gástrico humanos para baixo. a expressão do gene -regulates PIWIL1 [26]. Por isso, queríamos avaliar o efeito da BA sobre a expressão gênica PIWIL1 em ​​células de câncer de pulmão. dados RT-PCR (Figura 5) mostram que

piwil1

níveis de mRNA foram diminuídos em A549 e as células H1299 após tratamento BA. O efeito de regulação para baixo da BA em

piwil1

mRNA níveis em células de câncer de pulmão é consistente com o observado em células AGS adenocarcinoma gástrico [26].

Piwil1

expressão de mRNA foi avaliada na presença e na ausência de soro e BA no cancro do pulmão linhas celulares A549 (a) e NCI-H1299 (B). dados mostram RT-PCR que

piwil1

expressão foi regulada pela BA na ausência e presença de soro. As reacções de PCR foram estabelecidas em triplicados e ciclofilina foi utilizado como um controlo de carga interno e usado para normalizar os níveis de expressão relativa, utilizando o método 2

-ΔΔ (26). reação de RT-PCR foram executados em três vezes independentes.

PIWIL1 knock-down leva à redução da expressão β-catenina

RASSF1C foi previamente ligado à via de sinalização Wnt, como RASSF1C sobre-expressão aumenta e silenciamento ou RASSF1C diminui a acumulação de β-catenina em células de câncer de pulmão [16]. Temos anteriormente demonstrado que knock-down dos resultados de expressão RASSF1C em infra-regulação da expressão do gene PIWIL1 [12]. Assim que queríamos para determinar se PIWIL1 gene knock-down irá afetar a expressão β-catenina. Knock-down da expressão do gene PIWIL1 utilizando um vector lentiviral shRNA-resultou em níveis mais baixos de β-catenina ARNm e proteína (Figura 6). Nossos resultados sugerem que PIWIL1 pode modular os níveis de β-catenina, e que RASSF1C e PIWIL1 pode desempenhar um papel-chave na via de sinalização Wnt para promover tumorigênese.

Knock-down de

piwil1

expressão resultou em uma redução dos níveis de mRNA e proteína β-catenina. (A) Análise de Western blot de células de câncer de pulmão H1299 infectadas com partículas Missão Lentivirus-shRNA-controle (shRNA-cont) e Missão de Lentivirus-shRNA-

piwil1

(shRNA-

piwil1

) para endógena silêncio

piwil1

expressão. A análise Western blot utilizando anticorpo anti-mostras PIWIL1 reduziu os níveis de proteína em células PIWIL1 shRNA-PIWIL1 em ​​comparação com células shRNA-cont. O silenciamento de

piwil1

expressão do gene resultou numa redução nos níveis de proteína β-catenina como determinado utilizando anticorpo β-catenina. Os níveis de proteína PIWIL1 normalizado para actina (controlo de carga) também são mostrados, os dados representam os três borrões independentes. (B)

Piwil1

e

β-catenina

níveis de mRNA também foram avaliadas em shRNA-cont e shRNA-

piwil1

células e os dados de RT-PCR mostram a infra-regulação de ambos

piwil1

e

β-catenina

níveis de mRNA que é consistente com a análise de Western blot. experiências de RT-PCR foram realizadas pelo menos 3 vezes independentes.

intracelular IGFBP-5 parece modular a função RASSF1C em células de câncer de pulmão

Um trabalho recente mostra que PIWIL1 sobre-expressão para baixo -regulates um número de genes supressores de tumores, incluindo a IGFBP-5, em células estaminais mesenquimais humanas [18]. trabalho anterior no nosso laboratório mostrou que RASSF1C se liga a IGFBP-5 e podem regular a proliferação de células de osteosarcoma e apoptose [20]. Assim, quisemos investigar o efeito da RASSF1C /IGFBP-5 interação na expressão do gene PIWIL1 em ​​células de câncer de pulmão. Curiosamente, verificou-se que a co-expressão de RASSF1C e IGFBP-5 reduzida ARNm PIWIL1 e os níveis de proteína em linhas celulares de cancro de pulmão, enquanto que a co-expressão de RASSF1A-RASSF1C não têm um efeito importante sobre os níveis de mRNA PIWIL1 em ​​comparação com as células que sobre-expressam RASSF1C (Figura 7). Os níveis de proteína PIWIL1 foram igualmente reduzidas em células de cancro do pulmão que co-expressam RASSF1C-IGFBP-5 em comparação com as células que sobre-expressam RASSF1C (Figura 8). Além disso, verificou-se que as células de cancro do pulmão de células que co-expressam RASSF1C e IGFBP-5, mas não os co-expressam RASSF1A e RASSF1C, como foram sensibilizados para a inibição BA como as células de controlo (Figura 9). Devemos não sobre-expressão que RASSF1A sozinho não aumentou os efeitos inibidores do crescimento de BA (dados não mostrados). Estes achados sugerem que intracelular IGFBP-5, mas não RASSF1A, afeta negativamente as funções RASSF1C. Ligando RASSF1C /IGFBP-5 interacção com a modulação da expressão do gene PIWIL1 e proliferação celular é um novo achado que requer uma investigação mais aprofundada.

Piwil1

expressão de mRNA foi avaliada em células H1299 estavelmente transduzidas com MLV osso -HA-volta (BB), MLV-HA-RASSF1C (1C), MLV-HA-RASSF1A e 1C (1A-1C) e MLV-HA-1C e a IGFBP-5 (1C-BP5). dados mostram RT-PCR que

piwil1

expressão de mRNA em células co-expressando 1C e BP5 foi reduzido em comparação com células sobre-expressando 1C e 1A and1C. Os dados são representativos de pelo menos 3 experiências independentes, e os valores representam a média ± SEM. * P 0,05; porque 1C em comparação com BB

(A) Análise de Western blot de células NCI-H1299 e A549 estavelmente transduzidas com MLV-backbone (BB), MLV-HA-RASSF1C (1C. ), MLV-HA-IGFBP-5 (BP5), e co-transduzido com os dois MLV-HA-RASSF1C e -IGFBP-5 (1C-BP5) e tratou-se com 1 ug /ml de doxiciclina durante 48 h. O anticorpo anti-tag de HA detectada uma HA-RASSF1C e proteína de fusão HA-IGFBP-5 em células que sobre-expressa cada sozinho e aqueles que co-expressa ambos. A proteína de fusão foi visualizada utilizando anticorpos secundários marcados com fluorescência. (B) Análise de Western blot de células de câncer de pulmão A549 e H1299 estavelmente transduzidas com MLV-backbone (A549-BB e H1299-BB), MLV-HA-RASSF1C (A549-1C e H1299-1C), MLV-HA-IGFBP- 5 (A549-BP5 e H1299-BP5), e MLV-HA-RASSF1C /MLV-HA-IGFBP-5-A549-1C BP5 e H1299-1C-BP5). O anticorpo anti-PIWIL1 foi utilizado para sondar Western blot. PIWIL1 é sobre-regulada em células A549 e NCI-H1299 que sobre-expressam RASSF1C, mas não em células que expressem a IGFBP-5 ou co-expressam tanto a IGFBP-5 e RASSF1C. (C) Mostra os níveis de proteína PIWIL1 normalizados para actina (controle de carga) com desvios-padrão, os dados representam os três borrões independentes.

. H1299-BB, H1299-1C, H1299-1A-1c, e H1299-1C-BP5 células foram tratadas com ácido betulínico (BA) durante 24 h. As células foram então ensaiadas quanto à viabilidade celular /proliferação. As células que co-expressam RASSF1C-IGFBP-5 foram mais sensíveis à BA comparação com as células que sobre-expressam RASSF1C ou que co-expressam RASSF1A-RASSF1C. Os dados são representativos de pelo menos 3 experiências independentes, e os valores representam a média ± SEM. * P 0,05; porque 1C em comparação com BB

A inibição da ATM-AMPK via induz a expressão do gene RASSF1C

Atualmente, nada se sabe sobre as cascatas de sinalização a montante envolvidos na regulação do gene RASSF1C. expressão. Por isso, foi realizado um estudo conjunto PCR transcriptoma para identificar inibidores químicos e via de sinalização associado (s) que modulam a expressão RASSF1C. A matriz de PCR consistiu de cDNA a partir da linha celular MCF7 do cancro da mama tratado com 90 inibidores químicos diferentes que regulam várias vias de sinalização. A matriz foi rastreada com os iniciadores específicos do gene RASSF1C e vários inibidores químicos que aparecem para regular e regular negativamente a expressão RASSF1C por ≥ 1,5 vezes foram identificados. Os reagentes mais notáveis ​​são Dorsopmorphin (inibidor da AMPK) e KU60019 (inibidor da ATM), que up-regular a expressão RASSF1C de 2,8 e 2,4 vezes, respectivamente; e tricostatina A (inibidor de HDAC e activador de AMPK) regula negativamente a expressão RASSF1C por duas vezes (Tabela 1). Nós posteriormente confirmado o efeito de Dorsomorphin e Trichostatin na expressão RASSF1C em H1299 células do cancro do pulmão (Figura 10). Estes achados são novos e sugerem que a via da ATM-AMPK podem modular a expressão RASSF1C /função em células de cancro do pulmão.

células de cancro do pulmão H1299 foram tratados com Dorsomorphin e Tricostatina A a uma concentração de 10 uM para validar a PCR dados da matriz. A análise de RT-PCR demonstra que Dorsomorphin significativamente regulada para cima, enquanto a expressão do gene RASSF1C ligeiramente para cima-regulação da expressão do gene PIWIL1. Tricostatina Um tratamento RASSF1C significativamente regulada para baixo e os níveis de mRNA PIWIL1. Os dados apresentados são uma média de três experiências de RT-PCR independentes feitos em triplicado, * = P . 0,05

Discussão

RASSF1 parece ser um gene com dual funcionalidade, tanto como uma proteína supressora de tumor (RASSF1A isoforma), e como uma oncoproteína (isoforma RASSF1C) [11] – [16]. Neste artigo, relatamos que a sobre-expressão de RASSF1C não só aumenta a proliferação de células do cancro do pulmão, mas também promove a migração celular. Isto é consistente com nossas descobertas anteriores em células de cancro da mama [13]. Além disso, a sobre-expressão RASSF1C também reduz os efeitos do agente anti-cancro, o ácido betulínico, o qual é conhecido por diminuir a proliferação de células de cancro do pulmão [22]. Isto apoia ainda mais a promoção do crescimento e apoptose atenuando ações de RASSF1C.

Temos anteriormente demonstrado que RASSF1C modula a expressão do gene PIWIL1, um gene auto-renovação das células-tronco. Por isso, é possível que RASSF1C pode contribuir para o desenvolvimento de células-tronco e progressão do cancro do pulmão. Coerente com isso, descobrimos que CD133

+ células do cancro do pulmão (que exibem características semelhantes a células-tronco do câncer [24], [25] sobre-expressar RASSF1C parecem formar maiores e mais numerosas esferas de tumor em relação ao controle CD133

+ células. PIWIL1 é elevado em muitas células de cancro humanas, e tem sido sugerido que PIWIL1 pode estar envolvido na tumorigénese [17], [18], [26]. recentemente, SH-RNA

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gene knock-down em células estaminais cancro do pulmão (SSCloAldebr) foi mostrado para reduzir significativamente o crescimento do tumor em ratinhos nus, implicando ainda mais o papel da proteína PIWIL1 na manutenção da proliferação de células estaminais do cancro [28].

BA foi previamente mostrado para reduzir a proliferação de células de cancro humano e para baixo-regular

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expressão de mRNA em células de adenocarcinoma gástrico [22], [26]. foram avaliados os efeitos da BA no

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gene expressão em células de cancro de pulmão utilizando RT-PCR e análise de Western blot. Embora o tratamento de células de cancro do pulmão com BA resultou numa redução na proliferação das células (Figura 4) e na regulação negativa do

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ARNm que é consistente com a literatura. O

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gene é sobre-expressos em vários cancros humanos, e knock-down de

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diminui (e sobre-expressão de

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gene aumenta) o crescimento do tumor

in vivo

[18], [19], [28]. No entanto, muito pouco se sabe sobre o seu papel no crescimento de células de câncer de pulmão e progressão. Nós derrubado

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expressão do gene para aprender mais sobre suas funções em células de câncer de pulmão. Descobrimos que

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gene knock-down resultou em uma diminuição nos níveis de proteína β-catenina endógenos. Mostrámos que RASSF1C-se-regula a expressão PIWIL1 [12], e outros mostraram que RASSF1C aumenta a acumulação de níveis de proteína β-catenina em células de cancro do pulmão A549 [15]. Nossos resultados apontam para uma ligação potencial entre RASSF1C e PIWIL1 e da via canônica de sinalização Wnt, um caminho que desempenha um papel fundamental, não só manter as células-tronco em um estado de auto-renovação e indiferenciada, mas também na promoção tumorigênese [19], [ ,,,0],28].

PIWIL1 foi recentemente demonstrado inibir a diferenciação de sarcoma precursores

in vitro

e induzem sarcomas

in vivo

(19). PIWIL1 induz sarcomagenesis através de infra-regulação de supressores tumorais e inibidores da quinase dependente da ciclina via hipermetilação [19]. Um dos supressores de tumor down-regulados por PIWIL1 é IGFBP-5, o que temos mostrado previamente para ser um parceiro interagindo de RASSF1C [19]. Por isso, queríamos estudar o efeito da RASSF1C /IGFBP-5 interação na expressão do gene PIWIL1 em ​​células de câncer de pulmão. Curiosamente, a co-expressão de RASSF1C e IGFBP-5 RASSF1C significativamente negada a sobre-regulação da expressão do gene PIWIL1 e também aumentou os efeitos inibidores de BA em comparação com células que expressa tanto RASSF1C ou co-expressa e RASSF1A RASSF1C (Figura 9). Juntos, estes resultados sugerem que a IGFBP-5 se pode ligar e sequestrar RASSF1C, evitando assim a sobre-regulação da expressão do gene por PIWIL1 RASSF1C. Esta ligação de interação IGFBP-5 /RASSF1C com modulação da expressão PIWIL1 é uma nova descoberta e merece um estudo mais aprofundado e validação.

Atualmente, nada se sabe sobre como a expressão gênica RASSF1C é regulamentada e, portanto, foi realizado um transcriptoma PCR tela de matriz e identificados vários inibidores químicos que parecem modular a expressão do gene RASSF1C. Entre estes inibidores químicos, observou-se que o inibidor químico Dorsomorphin (também conhecido como Composto C) e KU60019 sobre-regular RASSF1C Duas vezes, enquanto o produto químico Tricostatina A sub-regula a expressão do gene RASSF1C por duas vezes em células da mama e cancro do pulmão (Tabela 1). Dorsomorphin foi mostrado para inibir os efeitos da radiação ionizante (IR) na paragem do ciclo celular e a proliferação celular através da inactivação da ATM-AMPK-p21

via WAF /CIP [29]. A activação do MTA-AMPK-p21

WAF /via CIP com Metformina tem sido recentemente demonstrado que inibem o crescimento e para aumentar os efeitos de IR em células NSCLC [30].