Abstract

Estudos têm sugerido que a corepressor receptor nuclear 1 (NCOR1) poderia desempenhar um papel importante em cancros humanos. No entanto, os mecanismos moleculares detalhados pelo qual ele funciona

in vivo

para afetar a progressão do câncer não são claras. O presente estudo elucidou o

in vivo

ações de NCOR1 na carcinogênese, utilizando um modelo de rato (

Thrb

PV /PV

ratos) que se desenvolve espontaneamente cancro da tiróide.

Thrb

PV /PV

ratos abrigar um mutante β do receptor da hormona da tiróide predominantemente negativo (HT), (denotado como PV). Adotamos a abordagem de perda de função cruzando

Thrb

PV

camundongos com ratos que expressam globalmente uma proteína mutante NCOR1 (NCOR1ΔID) em que os domínios de interação com receptor foram modificados de modo que não pode interagir com a TRp, ou PV, em ratinhos. Notavelmente, a expressão do crescimento proteína NCOR1ΔID reduzida tumor da tireóide, a progressão do tumor marcadamente atrasada, e sobrevivência prolongada de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos. proliferação de células de tumor foi inibido pelo aumento da expressão de ciclina-dependente inibidor da quinase 1 (p21

WAF1 /cip1;

CDKN1A

), e a apoptose foi activado por expressão elevada de pró-apoptótico de BCL-Associated X (

Bax

). Outras análises mostraram que p53 foi recrutado para o site p53 de ligação no promotor proximal do

CDKN1A

e

gene Bax

como um complexo co-repressor com PV /NCOR1 /deacetylas- histona 3 (HDAC-3), levando a repressão da

CDKN1A

, bem como o

gene Bax

em thyroids de

Thrb

PV /PV

ratos. Em thyroids de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos, o complexo p53 /PV não poderia recrutar NCOR1ΔID e HDAC-3, levando a des-repressão da ambos os genes para inibir a progressão de cancro. Os presentes estudos forneceram provas directas

in vivo

que NCOR1 poderia funcionar como um oncogene via regulação da transcrição em um mouse modelo de cancro da tiróide

Citation:. Fozzatti L, Parque JW, Zhao L, Willingham MC, Cheng Sy (2013) ações oncogênicos do Nuclear Receptor corepressor (NCOR1) em um mouse modelo de cancro de tiróide. PLoS ONE 8 (6): e67954. doi: 10.1371 /journal.pone.0067954

editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 28 Março, 2013; Aceito: 23 de maio de 2013; Publicação: 26 de junho de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. A presente pesquisa foi apoiada pelo Programa de Pesquisa Intramural do Centro de Pesquisa do Câncer, National Cancer Institute, National Institutes of Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

receptores de hormônios da tiróide (TRs) são fundamentais para mediar as ações genômicas da hormona da tiróide (T3) em crescimento, o desenvolvimento, diferenciação e manutenção da homeostase metabólica. Dois genes, TR α e β, localizados em dois cromossomas diferentes, codificar três principais isoformas de ligação de T3 (TR α1, β1, e p2). Estudos utilizando ratos geneticamente modificados mostrou que,

in vivo

, isoformas TR têm funções comuns, mas também pode exercer acções dependente de isoformas em tecidos-alvo [1], [2]. A atividade de transcrição de TR é regulado em vários níveis. Além da regulamentação por T3 e tipos de elementos nos promotores de genes alvo de ligação ao ADN, a atividade transcricional de TR é aperfeiçoá-lo por uma série de coactivators e co-repressores nucleares [3], [4]. Na ausência de T3, o TR unliganded recruta o co-repressor um receptor nuclear (NCOR1) e o co-repressor mediador receptor nuclear 2 /silenciamento para receptores de hormonas retinóide e da tiróide (NCOR2 /SMRT) para a repressão transcricional. A ligação de T3 conduz a uma alteração conformacional no TR que liberta o NCOR1 /NCOR2 complexo e permite o recrutamento de um complexo multiproteico coativador para activação da transcrição [5].

O papel regulador importante da NCOR1 acções em receptores é evidente na sua interacção com os receptores aberrantes subjacentes doenças humanas, tais como a resistência ao hormônio tireoidiano (RHT) [6], [7] e lipodistrófica severa resistência à insulina [8]. RTH é causada por mutações no

THRB

gene [9], [10]. Mutações dos γ PPAR (

PPAR)

levar a lipodistróficos resistência grave à insulina [8]. Além disso, a interação aberrante de NCOR1 /SMRT com os produtos fundidos gene do receptor de ácido retinóico alfa gene (

RARa)

ou com o gene da leucemia promielocítica (

PML

) (PML-RAR- α) ou com o gene de dedo de zinco promielocítica leucemia (

PLZF

) (PLZF-RAR-α) resulta no bloqueio de diferenciação mielóide [11]. O envolvimento de NCOR1 em outros cancros humanos, tais como cancros da mama e da bexiga foi demonstrada por uma estreita associação da expressão anormal NCOR1 com o desenvolvimento de câncer [12], [13], [14], [15]. Estudos recentes do Cancer Genome Atlas (TCGA) Rede de Investigação também descobriu deleção do gene homozigoto de NCOR1 em alguns pacientes com cólon e reto adenocarcinoma [16], adenocarcinoma da próstata [17], carcinoma do ovário [18] ou carcinoma hepatocelular do fígado (inédito-Provisória na base de dados TCGA). Além disso, mutações nonsense e variantes de splicing de

NCOR1

também foram encontrados em pacientes com câncer de mama [19]. Embora esses estudos de associação levantou a possibilidade de que NCOR1 poderia agir para afetar a progressão do câncer, evidência direta de seus papéis na carcinogênese

in vivo

ainda está faltando.

A disponibilidade de um modelo de rato que se desenvolve espontaneamente metastático carcinoma folicular (FTC) forneceu-nos com uma ferramenta poderosa para avaliar o papel do NCOR1 no desenvolvimento e progressão do câncer. O

Thrb

PV /PV

rato abriga uma mutação negativa batendo dominante, conhecido como PV, no

Thrb

locus do gene [20]. A mutação PV foi identificada em um paciente que sofre de resistência ao hormônio da tireóide [21]. Como

Thrb

PV /PV

idade ratos, suas thyroids sofrer alterações patológicas de hiperplasia para capsular e vascular, a anaplasia, e eventual metástase para o pulmão [22]. O patológico progressão, via e frequência de metástase em

Thrb

PV /PV

ratos são semelhantes aos que, em FTC humano. análises moleculares extensas de vias de sinalização alterados mostram que, como encontrado em FTC humana,

Thrb

PV /PV

ratos exibem vias de sinalização aberrantes que incluem ativação constitutiva de fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /Akt [ ,,,0],23], [24] e integrina-Src-MAPK sinalização [25] e da acumulação aberrante do tumor na hipófise oncogênico transformando proteína do gene (PTTG) [26], [27] e ß-catenina [28]. Assim, o

Thrb

PV /PV

modelo do rato recapitula fielmente as aberrações moleculares encontradas em carcinoma da tiróide humana e é de fato um modelo de rato pré-clínico da FTC.

Nos presentes estudos, adoptado o método de perda de função cruzando

Thrb

PV

com camundongos que expressam globalmente uma proteína mutante NCOR1 (NCOR1ΔID). Neste proteína mutante NCOR1ΔID, dois domínios de interação com receptor terminal mais aminoácidos denominado RID 3 e rid2, estão em falta. Este mutante não pode associar com TR, como RID3 é absolutamente necessária para a interacção NCOR1-TR [29], [30], [31]. Consistentemente, nós também mostrou que a proteína mutante NCOR1ΔID não pode interagir com TRβPV

in vivo

[32]. A falta de interação de TRβPV com NCOR1ΔID resulta na melhoria dos sintomas de resistência ao hormônio tireoidiano no

Thrb

PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos, indicativo de que NCOR1 regula a ação negativa dominante de mutantes TRp

in vivo

[32].

os presentes estudos mostram que a expressão de NCOR1ΔID na tiróide de

Thrb

PV /PV

ratos inibiu o crescimento do tumor, prolongada sobrevivência e progressão do câncer atrasado. proliferação de células de tumor foi inibido pelo aumento da expressão de ciclina-dependente inibidor da quinase 1 (p21 /WAF1;

CDKN1A

), e a apoptose foi induzida pela expressão activada da proteína Bcl-2 X-associado (

BAX

). Tanto o

CDKN1A

e

BAX

genes são genes alvo a jusante diretos do supressor de tumor, p53. As análises moleculares detalhada mostrou que a falta de domínio de interacção com o receptor em NCOR1ΔID levou a uma incapacidade do complexo p53 /PV para recrutar o desacetilase-3 complexo repressor NCOR1 /histona para os promotores destes genes alvo, resultando em aumento da repressão destes genes inibir a progressão do câncer. O presente estudo forneceu evidência direta

in vivo

para demonstrar que o NCOR1 poderia funcionar como um oncogene via regulação da transcrição na carcinogênese de tireóide em um modelo de mouse.

Materiais e Métodos

rato Cepas

o estudo animal foi realizada de acordo com o protocolo aprovado pela Comissão Nacional de animal Care Cancer Institute e Uso. Camundongos portadores do

Thrb

PV

gene (

Thrb

PV

ratos) foram preparados e genotipados como descrito anteriormente [20].

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

camundongos foram criados pela primeira travessia

Thrb

+ /+ Ncor1

ΔID /+

ratos [29] com o

Thrb

PV /+

camundongos e depois cruzando

Thrb

PV /+ Ncor1

ΔID /ΔID

ratos com

Thrb

PV /+ Ncor1

ΔID /ΔID

ratos [32]. Os ratos com diferentes genótipos utilizados no presente estudo foram entrecruzados várias gerações, e irmãos com um fundo genético similar foram usadas em todos os experimentos. Os ratinhos foram monitorizados até ficarem moribundos e, por conseguinte, sacrificados. Tireóide e outros tecidos foram coletadas de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos e

Thrb

PVPVNcor1

ΔID /ΔID

ratos para a pesagem, histológica análise, e os estudos moleculares e bioquímicos.

Isolamento de ARN e quantitativa em tempo real de RT-PCR

o ARN total foi extraído a partir de ratinhos tiróides utilizando TRIzol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Quantitativa em tempo real de RT-PCR foi realizada com um kit de Quantitect SYBR Green RT-PCR (Qiagen, Valencia, CA), de acordo com as instruções do fabricante e utilizando um aparelho de ciclos térmicos do LightCycler (Roche Diagnostics). O ARN total (200 ng) foi utilizado nas determinações de RT-PCR como descrito previamente [33]. Os iniciadores específicos foram como se segue:

mp21

para a frente, 5′-CGCCGCGGTGTCAGAGTC-3 ‘e inverso, 5′-GCAGCAGGGCAGAGGAAG-3’;

mBax

para a frente, “-CCACCAGCTCTGAACAGATC-3 ‘e inverso, 5′-CAGCTTCTTGGTGGACGCAT-3’;

mp53

frente, 5′-AGAGACCGCCGTACAGAAGA-3 ‘e reverter, 5′-CTGTAGCATGGGCATCCTTT-3’.

Western Blot Analysis and Co-imunoprecipitação

Os extractos nucleares de thyroids foram preparadas como previamente descrito [32]. As amostras de proteína (25 ug) foram analisados ​​por Western blot, conforme descrito anteriormente [28]. Anti-fosforilada da proteína do retinoblastoma (pRb) (Ser780, # 9307) e PUMA (# 7467) foram de Cell Signaling Technologies (Beverly, MA) (1:500 diluição), anti-ciclina D1 (SC-450), a BAX (SC -7480), Rb (SC-50), p21 (sc-6246) e P27 (sc-1641) Os anticorpos foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA) e usado numa diluição 1:200. Os anticorpos anti-p53 (OP03) eram da Calbiochem (1:500 diluição). intensidades das bandas foram quantificados usando software NIH Image (ImageJ 1,34 s; Wayne Rasband, NIH).

Para co-imunoprecipitação, mostrar a interação física de p53 com PV, 0,5 mg de extratos totais da tiróide foi incubada primeira noite com anticorpo de coelho anti-TR (Código 600-401-A96, Rockland) em Tris-tamponada salina, 0,6% de NP-40 com inibidores de protease (Roche) a 4 ° C. As amostras foram depois misturadas com 20 ul de proteína A-agarose (Roche) a 4 ° C durante 2 horas, e os grânulos foram lavados cinco vezes com inibidores de protease TBS-0,6% de NP-40 contendo. As proteínas ligadas foram analisadas por análise de mancha de Western utilizando anticorpos para p53 (OP03; Millipore, Inc.,) a uma diluição 1:500 e anti-NCOR1 (PHQQ; 2 ug /mL). [32]

histológica análise

glândula tiróide, pulmão e coração foram dissecados, fixados em 10% de formalina neutra tamponada (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), e, subsequentemente, embebidos em parafina. Secções de espessura de 5 mm foram preparadas e coradas com hematoxilina e eosina (H E). Para cada animal, foram examinadas secções aleatórias individuais através da tiróide, através do pulmão, e através do coração.

A imuno-histoquímica

O IHC foi realizada como anteriormente descrito, com algumas modificações [25]. secções da tiróide parafina fixadas com formalina foram desparafinizadas, re-hidratadas, aqueceu-se a 98 ° C em anidrido citracónico 0,05%, pH 7,4 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), durante 1 hora e depois bloqueadas durante 1 hora em 2% de cabra normal soro à temperatura ambiente. Após lavagem em solução salina tamponada com fosfato, as lâminas foram incubadas a 4 ° C durante a noite com Ki-67 anticorpo primário (diluição 1:300; Thermo Scientific, Fremont, CA; # RB-9043-P0). Após a lavagem, as lâminas foram incubadas com anticorpo secundário de cabra anti-coelho, durante 1 hora à temperatura ambiente e lavadas em solução salina tamponada com fosfato. As lâminas foram então incubadas em 3,3′-diaminobenzidene (kit de substrato para a peroxidase DAB; Vector Laboratories, Burlingame, CA; SK-4100), e, após coloração desenvolvimento, que foram contrastadas em hematoxilina de Gill, enxaguado e montadas em Permount (Fisher Scientific , Pittsburgh, PA). O índice proliferativo foi calculada como a percentagem de núcleos Ki-67-positivas ao número total de núcleos na secção de tiróide. A contagem foi realizada utilizando Institutos Nacionais de Saúde (NIH) software IMAGE (ImageJ 1,34 s; Wayne Rasband, NIH, Bethesda, MD).

Cromatina imunoprecipitação (CHIP) Ensaio

O ensaio chip foi realizada utilizando DNA cromatina preparada a partir de tumores da tiróide (50 mg /ensaio) do

Thrb1

PV /PVNcor1

+ /+

ratos e

Thrb1

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos, tal como descrito anteriormente [34]. O imunoprecipitado-ADN em 50 ul de TE e PCR quantitativo foi realizado com 7900HT rápido Real-Time PCR System (Applied Biosystems) utilizando o kit QuantiFast SYBR Green RT-PCR (204154, Qiagen). O enriquecimento em sinais foi calculada como sinais de imunoprecipitação contra entradas lisado celular total. As mudanças vezes de tumores da tiróide de

Thrb1

PV /PVNcor1

+ /+

ou

Thrb1

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ChIP foram normalizados pela controle negativo (IgG de rato). Os primers chip usado eram

CDKN1A

frente, 5′- TTTCTATCAGCCCCAGAGGA-3 ‘; e reverso, 5’-TCACCCCACAGCTGGTAGTT-3 ‘e

Bax

para a frente, 5′-GGGGCGCGCGGATCCATTCC-3′; e reverso, 5′- GCTTCTGATGGACAGGGGGC-3 ‘.

Análise Estatística

Todos os dados são expressos como média ± SEM. Diferenças entre os grupos foram examinados para significância estatística usando

t

teste de Student com o uso de GraphPad Prism 4.0a (GraphPad Software); p 0,05 é considerado estatisticamente significativo

Resultados

NCOR1ΔID prolonga a sobrevida e atrasos de tireóide carcinogênese do

Thrb

PV /PV

Mice

Nós. já demonstraram que

Thrb

PV /PV

ratos têm alta mortalidade causada pela FTC [22]. Nós monitorados os efeitos da expressão de NCOR1ΔID na carcinogênese de tireóide comparando primeiro a sobrevivência de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

camundongos com a de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos. Os ratinhos foram monitorizados até que se tornou moribunda com sinais de tumores palpáveis, rápida perda de peso, posturas curvados, e dificuldade para respirar. mostra a Figura 1A que

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos sobreviveram significativamente mais longa (p 0,01; 50% idade sobrevivência: 11,3 meses, n = 29) do que

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos (50% idade sobrevivência: 9,3 meses, n = 58), durante o período de observação de 15 meses. A Figura 1B mostra que a expressão de NCOR1ΔID levou a uma redução significativa de 35% no peso da tiróide em

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos (conjunto de dados 2 vs. 1; p 0,0001 ).

() curvas de sobrevida de Kaplan-Meier A para

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+ Comprar e

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos até 15 meses de idade.

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

(n = 29) sobreviveram significativamente mais tempo do que

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos (n = 58) (

p Art 0,0001). (B) da tireóide de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+ Comprar e

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos nas idades de 5 -15 meses foram dissecados e pesados. Os dados são apresentados como os rácios de peso de tiróide para o peso corporal. As diferenças entre os pesos da tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+ Comprar e

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos foram significativos (

p Art 0,0001), conforme determinado pelo estudante de

t

análise -test

o efeito da NCOR1ΔID sobre a progressão patológica foi avaliada por análise histopatológica como.

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos envelhecidos. A Figura 2A mostra características patológicas representativos das tireóides e pulmões do 3 a 15 meses de idade,

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+ Comprar e

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos (colunas da direita para a esquerda e, respectivamente). Nos thyroids de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos na idade de 7 meses, invasão vascular avançada e anaplasia focal foram frequentemente observados (setas na figura 2Aa e 2AC, respectivamente) . Além disso, metástases pulmonares (Figura 2AE, setas) foram freqüentes em

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos. Em

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

camundongos, no entanto, invasão vascular foi raramente observada (Figura 2AB), mas sem anaplasia detectável (Figura 2AD) e uma redução acentuada na ocorrência de metástases do pulmão (Figura 2AF). Estas observações fisiopatológicos estão resumidos na Figura 2B. Na idade mais jovem de 3-5 meses, foi observada uma menor ocorrência de invasão capsular (~ 20%) para a

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos do que para

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos (Figura 2BA), mas a frequência de ocorrência semelhante de invasão capsular foi detectada tanto para ratos mutantes em idade mais avançada ( 7 meses de idade). Não há invasão, anaplasia, ou metástases pulmonares vasculares foram encontrados em

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos (Figura 2Bb, c, e d) em idades mais jovens de 3-5 meses. Para os ratos com mais de 7 meses, a frequência de ocorrência de invasão vascular, anaplasia, e metástases pulmonares foram de 80%, 15% e 60%, respectivamente, para

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratinhos (Figura 2Bb, c, e d). No entanto, a ocorrência de invasão vascular e pulmonar metástases eram 14% e 10%, respectivamente, para

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos, sem ocorrência de anaplasia. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a expressão de NCOR1ΔID atrasou a progressão do cancro da tiróide e bloqueou a perda de diferenciação (anaplasia) em

Thrb

PV /PV

ratos.

(A) Hematoxilina e eosina (H e) coloração de secções da tiróide (parte superior e médio linhas) e secções de pulmão (linha inferior) de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

(a, c, e e ) e

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

(b, d, e f) camundongos. Os cortes histológicos de tecidos de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos mostraram evidências de (a) invasão vascular na tireóide (seta), (c) anaplasia na tireóide (setas), e (e) as lesões metastáticas no pulmão (setas). Seções da tireóide e os pulmões de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

mostrou vasos sanguíneos (b), sem invasão vascular (seta), (d), sem anaplasia, e (f) pulmão sem lesões metastáticas. (B) Comparação da dependente da idade ocorrência percentual de invasão capsular (a), invasão vascular (b), anaplasia (c), e de metástases do pulmão (d). Os dados são expressos como a percentagem de ocorrência de ratinhos mutantes total examinada. O símbolo “#” indica ocorrência de 0%.

NCOR1ΔID reduz o crescimento da tiróide através da inibição da proliferação celular em

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

Mice

O facto de o crescimento da tiróide foi reduzida em

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos (Figura 1B) nos levou a perguntar se proliferação de células tumorais da tiróide foi inibida. Estudámos, portanto, a abundância de proteína do marcador de proliferação nuclear, Ki-67, por meio de análise imuno-histoquímica. Figura 3A.I-a e -b mostrar exemplos representativos de coloração nuclear intensivo em thyroids de dois

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos. Em contraste, menos núcleos foram imuno-coradas com Ki-67 marcador de proliferação em thyroids de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratinhos (Figura 3A.Ic e -d, n = 2 ). As células com Ki-67 núcleos corados imunologicamente foram contadas e os dados quantitativos são mostrados na Figura 3A.II. A análise quantitativa mostra que o número de células da tireóide com Ki-67 núcleos corados foi 50% menor em

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos do que em

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos, indicando diminuição da proliferação celular na tireóide de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos.

( AI) dois microfotografias representativas dos manchado Ki-67 nas secções de tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

(a e b representam dois ratos diferentes) e

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos (C e d representam dois ratos diferentes). Nos thyroids de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos, menos células da tireóide foram corados com Ki-67 do que em thyroids de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratinhos (setas). (Secção II) células da tireóide Positivamente nuclear Ki-manchado-67 a partir de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

e

Thrb

PV /PVNcor1

+ /ratinhos

+ foram contadas e expressas como percentagem das células totais. A porcentagem de células em proliferação foi significativamente menor nas tireóides de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

que

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

camundongos. (BI) extratos de proteínas nucleares foram preparados a partir de tumores da tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

(pistas 1 e 2) ou

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

(pistas 3 e 4) ratos. A análise de Western blot de ciclina D1, Rb fosforilado, o total de Rb, p21, e p27 como são marcados, e a actina (painel F) foi utilizada como controlo de carga. (B. II) A quantificação de intensidades de bandas indicadas em (B.I). A abundância de proteína de ciclina D1 e Rb fosforilada foram menores nas tireóides de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos, enquanto que a abundância de proteínas p21 e p27 foram maiores nas tireóides de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos.

Este achado foi ainda apoiada pela análise bioquímica em que a abundância de proteína de um regulador chave do ciclo celular , ciclina D1, foi significativamente menor nas tireóides de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos (Figura 3B.I, painel a, pistas 3 4) do que em

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos (faixas 1 2). Além disso, a ciclina reduzida D1 levou a uma abundância de proteína inferior da proteína do retinoblastoma fosforilada (PRB) (Figura 3B.I, painel b, comparar as pistas 1 2 com pistas 3 4) sem alterar os níveis de proteína Rb totais (painel c). A redução do Rb fosforilado impedido a progressão do ciclo celular de G1 para a fase S. Consistentemente, a abundância de proteína p21 inibidor da quinase dependente da ciclina e p27 (Figura 3B.I, painéis d e e, respectivamente) também foi menor nas tireóides de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos do que em

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos (comparar as pistas 3-4 para pistas 1-2). Os dados quantitativos das intensidades de banda são mostrados na Figura 3B.II. Colectivamente, estes resultados indicam que a expressão da NCOR1ΔID conduziu à inibição da proliferação de células de tumor, em parte, ao retardar a progressão do ciclo celular G1-S.

se a apoptose contribuiu também para diminuir o crescimento do tumor mostrada na Figura tiróide 1B também foi avaliada examinando os reguladores-chave da apoptose. A abundância de proteína Bcl-2-associado da proteína X (BAX), que promove a apoptose, foi maior em thyroids de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos do que em

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos (Figura 4AA, comparar pistas 3 4 com 1 2). PUMA, que é um BH3 (Bcl-2 domínio de homologia 3) proteína -apenas que induz a apoptose através da via mitocôndria, também foi maior no thyroids de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

camundongos do que em

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos (Figura 4AB, comparar pistas 3 4 com 1 2). As intensidades de banda quantitativos são mostrados na Figura 4BA, indicando um aumento de 2 vezes no nível da proteína BAX e PUMA. Além disso, o aumento da caspase clivada 3 (Figura 4A, painel b, as pistas 3 4) e a diminuição da poli ADP-ribose-polimerase total (PARP), mas aumentou a PARP clivada (painel C, faixa superior e faixa inferior, respectivamente, nas pistas 3 4) em

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos em comparação com

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos foram indicativo da atividade apoptótica elevada em células de tumor da tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos (ver também dados quantitativos na Figura 4bb). Estes resultados indicam que, além de atrasar a progressão do ciclo celular G1-S, o aumento da actividade apoptótica em tiróides de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratinhos também contribuiu para diminuir o crescimento da tiróide.

extractos de proteína nuclear (A) foram preparados a partir de tumores da tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

(pistas 1 e 2) ou

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

(pistas 3 e 4) ratos. Mostram-se análises de Western blot de BAX (painel a), PUMA (painel b), clivado da caspase 3 (painel C), PARP clivada e PARP (painel d), e controlo de carga actina (painel E). (B) A determinação quantitativa das intensidades de banda mostrado em (A). * P 0,05 abundância de proteína de BAX e PUMA (painel a), caspase 3 e PARP clivada (painel b) foi significativamente maior e PARP total (painel b) foi menor nas tireóides de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos.

inibição do crescimento tumoral por ativação da via de sinalização p53 em as tireóides de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

Mice

a descoberta de que a abundância de proteína de p21 e BAX foram alterados, como mostrado acima nos levou a examinar se a sua expressão ao nível mRNA também foi afetada. Na verdade, descobrimos que

CDKN1A

(

p21

WAF1

) níveis de mRNA foram significativamente maiores na tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos do que em

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos (Figura 5A, bar 2 vs. bar 1). Da mesma forma,

Bax

nível de mRNA foi maior na tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos do que em

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos (Figura 5B, bar 4 vs. bar 3). Estes dois genes são directamente reguladas pelo p53 [35], [36]. Nós, portanto, a hipótese de que a alteração da actividade da p53 em thyroids de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos levaria a ativação da transcrição do

CDKN1A Comprar e

Bax

genes. Em primeiro lugar, examinar se a expressão de mRNA p53 ea proteína foi alterada, alterando assim a atividade na tireóide de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos. Descobrimos que a expressão de NCOR1ΔID não teve efeitos da expressão de p53 ao nível do mRNA (barras 5 e 6, a Figura 5A). Além disso, verificou-se que a abundância de proteína p53 foi igualmente baixa na tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+ Comprar e

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos (Figura 5B, painel superior, pistas 3 e 4, respectivamente). Portanto, quanto maior

CDKN1A

e

Bax

níveis de mRNA não foram devido a ativação da atividade p53 transcrição pela expressão da proteína p53 elevada. Uma vez que foi demonstrado anteriormente que a do tipo selvagem TRs interagir fisicamente com p53 e negativamente regular a actividade transcricional de p53 [37], [38], que próxima explorada a possibilidade de que a actividade de p53 pode ser alterada através da interacção com PV em tiróides ratos mutantes. análise de co-imunoprecipitação mostrou que PV foi associada a p53 na tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos (Figura 5B, painel superior, pista 1). PV também foi igualmente associada a p53 na tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos (Figura 5B, painel superior, pista 2). Importante, co-imunoprecipitação revelou ainda que PV também foi associado com NCOR1 nos extratos nucleares de tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos (Figura 5B, painel inferior, pista 1) , mas não interagir com NCOR1ΔID nos extratos nucleares de tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos (pista 2). Pistas 3 e 4 mostram que uma quantidade semelhante de NCOR1 e NCOR1ΔID, respectivamente, foi detectado por análise de Western blot directa (Figura 5B, painel inferior). Estes dados indicam que PV interagiu com p53 e NCOR1 em um complexo ternário (p53 /PV /NCOR1) na tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos, mas apenas uma formada p53 complexo /PV na tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos.

(a) expressão Activated do

CDKN1A Comprar e

genes Bax

na tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos. Quantitativa em tempo real de RT-PCR foi realizada como descrito em Métodos e Materiais. Cada amostra da tiróide foi executado em triplicado com o número total de ratos com 3-5. As diferenças na expressão são significativas na expressão de

CDKN1A

(pistas 1 e 2) e o

Bax

genes (pistas 3 e 4) entre

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+ Comprar e

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos (pistas 5 e 6). (B) Co-imunoprecipitação de PV com p53 e NCOR1 na tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+

ratos (pista 1), mas não com NCOR1ΔID em extractos de tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos (pista 2). Pistas 3 e 4 mostram a banda p53 (painel superior) e NCOR1 e NCOR1ΔID a partir da análise de Western blot direto dos extractos nucleares de tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1

+ /+ Comprar e

Thrb

PV /PVNcor1

ΔID /ΔID

ratos, respectivamente. (C e D) Recrutamento de PV e NCOR1 aos locais de p53 /ligação a DNA no promotor do

CDKN1A

gene (C) e a

Bax

gene (D). ensaio ChIP foi realizada utilizando IgG (barras 1 e 6) ou anti-p53 (barras 2 e 7) ou anti-PV (barras 3 e 8) ou anti-NCOR1 (barras 4 e 9) ou anti-HDAC-3 ( barras 5 e anticorpos 10), conforme descrito em

Métodos e Materiais

. A ligação foi expressa como vezes de alterações em referência ao controlo negativo em que IgG de ratinho foi usado na imunoprecipitação * p . 0,05 e *** p 0,001. NS, não significativo.

A descoberta de que

CDKN1A

e

Bax

mRNA foram maiores na tiróide de

Thrb

PV /PVNcor1 <