Abstract

ácido polissiálico (PSA), um homopolímero ligada ao α2,8 de ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac), é regulada pelo desenvolvimento e sua expressão é pensado para ser restrita a alguns tecidos adultos. Recentemente, mostrámos que dois agentes patogénicos humanos expressa um derivado de PSA contendo resíduos de ácido siálico N-acetil-des (NeuPSA). Aqui mostra-se que um epitopo identificado pelo NeuPSA anti-anticorpo monoclonal, SEAM 3 (SEAM antigénio 3-reactivo ou S3RA), é expresso em melanomas humanos, e também intracelularmente em uma linha de células de melanoma humano (SK-MEL-28), uma linha de células T humanas de leucemia de células (Jurkat), e duas linhas celulares de neuroblastoma (CHP-134 e SH-SY5Y). SEAM 3 de ligação induzido apoptose nas quatro linhas celulares testadas. A distribuição intracelular anormal de S3RA foi semelhante ao descrito para os polysialyltransferases PSA, STX e PST, que também são expressos nas quatro linhas celulares utilizadas aqui. Curiosamente, a supressão da expressão de ARNm de PST por transfecção de células SK-MEL-28 com PST específica de ARN interferente curto (siARN) resultou numa diminuição da ligação de costura 3. Os resultados sugerem que novos estudos da utilidade dos anticorpos, tais como costura 3 como agentes terapêuticos para certas malignidades

citação:. Steirer LM, Moe GR (2011) um anticorpo de De-N-acetil contendo ácido siálico-polissiálico ácido Identifica uma intracelular Antigen e induz a apoptose em linhas celulares de cancro humano. PLoS ONE 6 (11): e27249. doi: 10.1371 /journal.pone.0027249

Edição: Roger Chammas, Faculdade de Medicina, Universidade de São Paulo, Brasil

Recebido: 18 Agosto, 2011; Aceite: 12 de outubro de 2011; Publicação: 09 de novembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Steirer, Moe. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento foi fornecida pelo número de concessão NIH NIAID AI064314 (www.niaid.nih.gov/Pages/default.aspx), NIH NCRR números de subvenção CO6 RR-16226 e S10RR025472 (www.ncrr.nih.gov), infantis Ramos Hospital, Inc. ( www.childrenshospitalbranches.org), NIH NHLBI T-32 5T32DK078514-09 (grants.nih.gov/training/nrsa.htm), Swim Across America San Francisco Bay Area (www.swimacrossamerica.org), e da Família Jennifer Leigh Wells (www.moonlight4meningitis.com/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

modificação PSA parece estar limitada a algumas proteínas animais e os polissacarídeos capsulares de bactérias neuroinvasive

Neisseria meningitidis

grupo B (NMB) e

e. coli

K1 [1]. Nos seres humanos, a PSA tem sido demonstrado estar presente na molécula de adesão de células neurais (NCAM) [2], sináptica molécula de adesão celular 1 [3], a subunidade alfa do canal de sódio sensível à tensão [4], a integrina alfa 5 da subunidade [ ,,,0],5], o receptor de limpeza CD36 [6], neuropilina-2 [7], e os polysialyltransferases PSA ST8Sia2 e ST8Sia4, também conhecido como STX e PST, respectivamente [8]. NCAM é a proteína mais abundante polissialilados, especialmente durante o desenvolvimento fetal, e o papel da NCAM polysialylation em função é o mais cuidadosamente investigado [9]. blocos polysialylation NCAM as propriedades adesivas da MACN para permitir a migração celular e modulam outras funções NCAM [9]. Em ratos adultos, a expressão de PSA é limitada a alguns tecidos no cérebro, que exibem plasticidade sináptica, tais como o bolbo olfactivo e no hipotálamo [9] e pode ter um papel no desenvolvimento da célula T [10]. Alguns tumores humanos, incluindo astrocitoma [11], de células pequenas e carcinoma do pulmão de células não pequenas [12], mieloma múltiplo [13], neuroblastoma [14], rabdomiossarcoma [15] e do tumor de Wilms [16] PSA expresso e a relativa nível de expressão do PSA em alguns cancros tem sido associado com prognóstico pobre [12], [17].

durante o desenvolvimento de vacinas para a prevenção da doença causada pela NMB, descobrimos que um anticorpo monoclonal de murino (mAb ) SEAM 3, que foi produzido por imunização com um derivado N-propionilo NmB polissacárido capsular (n-Pr Mbps) com base na vacina [18], os antigénios PSA reconhecidos que continham de-N-acetilado de ácido neuramínico (Neu) resíduos [19] , [20], [21]. A presença de Neu resíduos no N-Pr vacina toxóide MBPS-tétano era um produto colateral não intencional resultante incompleta re-N-acilação. Subsequentemente, mostrámos que a PSA contendo ácido neuramínico (NeuPSA), incluindo o PSA totalmente des-N-acetilada, foi imunogénica e induziu anticorpos que eram protectores contra NmB e NmC estirpes [19].

Embora não tinha NeuPSA foi descrita previamente em seres humanos, mais curto Neu-antigénios contendo ácido siálico (NeuSia), tais como gangliósidos tinha sido relatados para estar presente em alguns tumores humanos e linhas celulares de cancro [22], [23], [24]. NeuSia antigénios expressos em tumores humanos incluem variantes NeuSia de monoésteres e disialylogangliosides GM3 GD3 e [22], [23], [24], [25], [26], respectivamente. Hakomori e colaboradores mostraram que NeuSia GD3 expresso na epitelial A431 linha celular de carcinoma humano era um forte activador de crescimento epidérmico quinase do receptor do factor de células tratadas com Triton X-100 [27], [28]. O resultado sugere que o derivado NeuSia GM3 pode ter um papel na activação de vias de receptores que promovem a proliferação celular. Usando experiências de marcação radioactivos em linhas celulares de melanoma, Varki e colaboradores mostraram que os grupos N-acetilo em gangliósidos GD3 e GM3 entregue mais rapidamente do que as moléculas-mãe, o que sugere a existência de NeuSia contendo gangliósidos nestas células [25]. Recentemente, popa et ai isolado e caracterizado estruturalmente NeuSia contendo GD3 a partir de tumores primários de melanoma humano [26]. Uma vez que algumas células cancerosas expressam antígenos NeuSia, ele levantou a questão de saber se os antígenos mais NeuPSA modificados também são expressas por células cancerosas humanas. No que se segue, foi investigada a reactividade de SEAM 3 com a pele humana normal, tumores de melanoma humano primário e várias linhas de células de cancro humanas, incluindo a leucemia, melanoma, e células de neuroblastoma, e a actividade funcional de SEAM 3 contra estas linhas celulares de cancro.

resultados

Especificidade de mAb SEAM 3

Temos anteriormente mostraram que SEAM 3 é reativo com uma variedade de Neu contendo ácido oligosialic (OSA) /derivados de PSA [18], [19], [20]. Para definir a especificidade de SEAM 3 em relação a antigénios NeuOSA /PSA susceptível de ser expresso de forma natural (ou seja,. N-acetil contendo derivados), que prepararam derivados parcialmente des-N-acetilada de OSA por tratamento com base suave de oligossacarídeos purificados que têm uma grau de polimerização (DP) de 2, 3, e 4. o valor médio de Neu foi determinada utilizando um ensaio de resorcinol modificado que pode medir a quantidade de ácido neuramínico (Neu) e ácido N-acetilneuramínico (Neu5Ac) em PSA [19] . Após o tratamento com base suave, os oligossacáridos continha ~ 25% Neu e houve alguma degradação dos oligossacáridos mais longos de modo a que o trímero contidos ambos os dímeros e trímeros e o tetrâmero contidos dímeros, trímeros e tetrâmeros. A capacidade relativa dos oligossacáridos para inibir a ligação de costura 3 para o antigénio nominal n-Pr AMPA foi determinada por ELISA. Os resultados encontram-se resumidos na Tabela 1. As concentrações de oligossacárido necessárias para inibir a ligação de costura 3 representam limites superiores uma vez que as preparações contêm uma mistura de oligossacáridos mais curtas, para além do mais longo indicado pela DP. Além disso, o número dado para o DP não toma em consideração o possível efeito de redução do grupo carbonilo C2 do resíduo da extremidade redutora, a qual é necessária para impedir a degradação durante o tratamento com base. Dadas estas considerações, oligossacarídeos com um DP de 4 foram os melhores inibidores de SEAM 3 vinculativo. A capacidade dos oligossacáridos para inibir a ligação de costura 3 não foi afectada, incubando-as a pH 5 com ou sem exoneuraminidase a 37 ° C durante 48 horas (dados não mostrados). Os tratamentos enriquecer os oligossacáridos para as cadeias que têm Neu na extremidade não redutora [19]. SEAM 3 A ligação não foi inibida por MCPS (isto é. Α2,9 poli ácido N-acetilneuramínico) intimamente relacionado, quer quando totalmente N-acetilado ou contendo resíduos des-N-acetilados (Tabela 1). Tomados em conjunto, conclui-se que a costura 3 reconhece oligo ou ácido polissiálico derivados possuindo um DP de 4 ou superior, onde aproximadamente a cada quarto resíduo é Neu, que pode estar localizado na extremidade não redutora ou em posições internas do polímero (Figura 1 ).

imuno-histoquímica (IHQ) coloração da pele humana normal e tumores de melanoma primário

Em tecidos normais, de N-acetil-GD3 foi relatado para ser expresso “no níveis baixos em alguns vasos sanguíneos, que se infiltram células mononucleares da pele e do cólon e em níveis moderados em melanócitos da pele “[22]. Os níveis mais elevados foram expressos em melanomas [22]. PSA-NCAM é amplamente expressa em endoderme, mesoderme, e neuro-ectodérmica ectodérmica tecidos derivados em vários estágios de desenvolvimento fetal, mas a expressão em adultos está limitada a algumas áreas do cérebro exibindo neuro-plasticidade [29]. Para determinar se os antigénios reactivos com SEAM 3 foram expressas em pele humana e melanomas primários normais, foi realizada IHC em espécimes embebidos em parafina de tecido congelados e fixados em formalina. O mAB R24 foi utilizado para marcar GD3. Chammas et ai., Relataram que o tratamento com formalina, de amostras de tecido pode resultar na modificação de grupos amino des-N-acetilo GD3 com formaldeído, resultando em perda de reactividade com anti-des-N-acetilo GD3 mAbs [22]. Além disso, a coloração IHC para a presença de GD3 em espécimes embebidos em parafina tecidos fixados em formalina foi descrito como sendo sensível a perda de reactividade anti-GD3 como um resultado dos processos de recuperação de antigénio [30]. Achamos que os respectivos padrões de coloração observada para cada mAb testados foram semelhantes, independentemente de qual o método foi usado para preparar as amostras, excepto que a coloração foi diminuído até certo ponto em espécimes congelados, móvel em relação ao embebido em parafina, os tecidos fixados com formalina. Além disso, era mais difícil de obter grandes seções, ininterruptas de tecido nas amostras não fixadas. Desde que fixa os espécimes resultou na preservação da estrutura superior de tecido e uma maior sensibilidade da coloração, somente os resultados obtidos com tecidos fixos são mostrados.

IHC coloração da pele humana normal fixa mostra que SEAM 3 valores de células escamosas do epitélio e linfócitos infiltrantes (Figura 2A), enquanto que o controlo negativo irrelevante IgG2b e IgG3 de murino mAb mostrou nenhuma reactividade. Em contraste, o mAb anti-GD3 foi reactivo apenas com antigénios presentes em poucos melanócitos na pele normal (Figura 2A, o exemplo indicado pela seta). SEAM 3 coloração parece ser em grande parte citoplasmática com um aspecto granular distinto. SEAM 3 de ligação a antigénios presentes na pele normal pode ser inibida em mais de 90% quando o mAb foi pré-incubada com N-Pr Mbps (50 ug /ml). N-Pr Mbps é o antigénio polissacárido utilizado para produzir costura 3 [18]. O resultado mostra que SEAM-3 de ligação foi mediada pelo local de combinação de anticorpo.

análise IHC de SEAM 3 e anti-GD3 se ligar a pele humana normal (A) e um melanoma primário (B). -Fixadas com formalina a pele humana normal (A) e melanoma primário (B) foram incubadas com IgG2b irrelevante, SEAM 3, SEAM 3 com um inibidor de polissacarídeo N-Pr Mbps, IgG3 irrelevante, anti-GD3 e o mAb R24, conforme indicado. A ligação foi detectada utilizando DAB, que produz um precipitado castanho. A contracoloração foi realizada utilizando hemotoxilina. A seta na micrografia de SEAM 3 se ligar a pele normal mostra um exemplo de SEAM 3 marcando um linfócito infiltrante e para a micrografia anti-GD3, um melanócito. barras de referência = 40 uM.

A coloração escura do espécime de melanoma resultantes de SEAM 3 de ligação (Figura 2B) mostra que os antigénios S3RA foram expressas no tumor. Tal como acontece com a pele normal, SEAM 3 de ligação a antigénios presentes na amostra de melanoma foi inibida com solúvel em n-Pr Mbps (Figura 2B). A coloração intensa do espécime de melanoma sugere que S3RA foi expresso em níveis elevados no tumor em comparação com as células epiteliais normais. Todas as células tumorais dentro da secção, que tinha as dimensões de aproximadamente 1 cm x 2 cm, foram coradas. Em contraste, o mAb anti-GD3 exibiu heterogénea de ligação ao tecido tumoral com algumas células marcadas pelo mAb enquanto outros não apresentaram coloração (Figura 2B).

Além do exemplo melanoma humano primário mostrado na Figura 2B , uma matriz de 12 espécimes de melanoma humano menores primárias retiradas da pele, esófago, parótida, e tumores rectais foram avaliados quanto à reactividade SEAM 3 e IgG2b irrelevante por IHQ. Todos os espécimes de melanoma na matriz foram reactivos com costura 3, enquanto o mAb irrelevante IgG2b não mostrou nenhuma reactividade (dados não mostrados). A intensidade da coloração resultante do SEAM 3 de ligação na matriz de tumor de melanoma foi semelhante ao exemplo mostrado na Figura 2B. As amostras de pele normal tiradas de áreas adjacentes a alguns dos melanomas que foram incluídos na matriz de espécime exibiu o mesmo padrão de reactividade SEAM 3 como mostrado na Figura 2A com a pele normal (dados não mostrados).

Expressão S3RA de cancro em linhas celulares

Uma vez que a des-N-acetil siálico derivado do disialyloganglioside GD3 foi relatado para estar presente em linhas celulares de melanoma que contêm ácido [24], bem como em tumores humanos primários [26 ] e verificou-se que SEAM 3 foi reactivo com melanomas primários (Figura 2B), foi realizada a citometria de fluxo para medir a ligação de costura 3 com quatro linhas de células de cancro humano que expressam diferentes antigénios-Sia contendo (Tabela 2).

a Figura 3 mostra a ligação da correspondência subclasse mAb irrelevante IgG2b comparação com costura 3, o anti-GD3 o mAb R24 e anti-MACN (CD56) mAb se ligar a SK-MEL-28 de melanoma e células de neuroblastoma SH-SY5Y na ausência e na presença de tratamento de Triton X-100, como indicado. Gates, como células positivas para ligação foram ajustados utilizando subclasses de isotipo controlos correspondentes e são indicados em cada histograma mostrado na Figura 3. Na ausência de detergente, 29% da SK MEL-28 definindo células foram positivas para SEAM-3 de ligação em comparação com 80% para anti-GD3 e de 3% para o mAb irrelevante. No entanto, quando as células foram feitas permeável aos mAbs por tratamento com detergente, 82% das células SK-MEL-28 foram positivas para a ligação de costura 3 e a fluorescência relativa aumentou mais de 10 vezes. A percentagem de células positivas anti-GD3 aumentou ligeiramente de 92%. A ligação do mAb anti-MACN foi comparável ao mAb IgG1 irrelevante na presença ou ausência de detergente e, por conseguinte, N-CAM não foi expressa em células SK-MEL-28. Para a linha celular SH-SY5Y, 20% das células tratadas com detergente não foram positivos para a ligação SEAM 3, que aumentou para 96% na presença de detergentes (Figura 3). Além disso, a fluorescência relativa aumentou mais de 10 vezes. Mais do que 85% de células SH-SY5Y foram positivos para anti-MACN e inferior a 21% para anti-GD3 de ligação em ambas as células intactas ou permeabilizadas. Os resultados resumidos na Tabela 3 para as quatro linhas celulares mostra que a percentagem de células positivas para ligação de costura 3 e a fluorescência média das células foi variável entre as linhas de células testadas. No entanto, as células intactas de cada linha celular foram em grande parte negativa para SEAM 3 vinculativo. Em contraste, praticamente todas as células de cada linha celular continha SEAM 3-antigénios reactivos intracelulares (S3RA). A distribuição intracelular predominante de S3RAs não correspondem à distribuição de GD3 ou PSA-NCAM, que estavam localizados principalmente na superfície da célula. O resultado sugere que S3RAs não foram derivados de Sia, quer GD3 ou PSA-NCAM-N-acetil DE ou que os homólogos intracelulares destas moléculas não eram reactivas com os respectivos Acms.

SK-MEL-28 e SH -SY5Y células eram ou não tratados para detectar a ligação de superfície (painel superior de cada conjunto de dois painéis), ou tratadas com Triton X-100 para detectar a ligação intracelular (painel inferior) por citometria de fluxo. As células foram incubadas com 5 ug /ml de cada anticorpo primário, seguido de incubação com 2? G de anticorpo secundário /mL de Alexa Fluor 488 conjugado. murino irrelevante IgG2b, IgG3, IgG1 e os mAbs foram usados ​​como controlos negativos para a costura 3, anti-GD3 e anti-MACN, respectivamente, e foram utilizadas para determinar a fluorescência basal. A ligação foi detectada utilizando goiaba EasyCyte citómetro de fluxo. Gates usou para definir células positivas para a ligação está indicado na parte superior de cada histograma.

Para demonstrar a especificidade de ligação, fixa e permabolized Jurkat ou SK-MEL-28 células foram incubadas com SEAM 3, na ausência e presença do inibidor n-Pr Mbps. Ao contrário as amostras de tecido fixadas no entanto, as concentrações relativamente elevadas de SEAM 3 (5 ug /ml) em combinação com o solúvel em n-Pr Mbps inibidor produzido resultados ambíguos. Nalgumas experiências foi observado inibição parcial, mas em outros, o inibidor de polissacarídeo tinha quer nenhum efeito ou resultou em um aumento na ligação. É possível que os efeitos das variáveis ​​de adição de n-Pr Mbps para a reacção de ligação resultante da propensão de derivados NeuPSA presentes na preparação de N-Pr Mbps a formar agregados que são demasiado grandes para escapar das células permeabilizadas ou que as células têm receptores para NeuPSA que também se ligam ao N-Pr Mbps.

a microscopia de fluorescência.

microscopia de imuno-fluorescência (MFI) foi utilizado para investigar a localização celular de SEAM 3 epitopos reactivos em detergente não tratada e tratou-se SK-MEL-28 e células CHP-134 (Figura 4). Os resultados de citometria de fluxo experiências de ligação com SK-MEL-28 de células não tratadas ou tratadas com detergente (Figura 3) sugeriu que epítopos reactivos SEAM 3 tinha uma localização celular diferente da que foi GD3 e PSA-NCAM. Consistente com estes resultados, apenas um subconjunto de SK-MEL-28 e células CHP-134 não tratadas com detergente foram reactivos com SEAM 3 por MFI (fluorescência vermelha na Figura 4). Como mostrado na Figura 4, SK-MEL-28 de células que foram mais reactivos com SEAM 3 foram “arredondado” células com ADN nuclear relativamente condensado como mostrado por coloração com DAPI. células alongadas eram menos reactivos com SEAM 3 (comparar as células SK-MEL-28 na fotomicrografia leve mostrada na Figura 4 com MFI). Em contraste, anti-GD3 marcado todas as células (fluorescência verde, tal como indicado na Figura 4). No entanto, quando as células SK-MEL-28 foram tratadas com detergente, todas as células foram positivas para a ligação de SEAM 3 (Figura 4). Nas células tratadas com detergente, SEAM 3 reactividade foi dispersa por todo o citoplasma em estruturas granulares semelhantes (Figura 4, o exemplo indicado por uma seta). reactividade anti-GD3 foi caracterizada por um padrão difuso de coloração com manchas de reactividade concentrada em ambas as células não tratadas e tratadas com detergente (Figura 4). Houve algum grau de co-localização evidente em imagens compostas de SEAM 3 e células anti-GD3-rotulado (amarelas na Figura 4), mas diferenças claras bem. Assim, SEAM 3 reactividade não estava directamente correlacionada com GD3 diferente localização incidental à membrana na ausência ou na presença de detergente e expressão de S3RAs foi limitado a um subconjunto de células.

micrografias de luz de SK-mel- 28 e CHP-134 mostram a forma geral das células com ADN nuclear indicou no azul. Anti-NeuPSA mAb costura 3 de ligação (a vermelho) para SK-MEL-28 e células CHP-134 não tratadas ou tratadas com Triton X-100 a permeablize as células, foi comparado ao anti-GD3 e -PSA em verde, como indicado . Localização subcelular de S3RA em células SK-MEL-28 com Golgi (Giantin, golgin 97 e tuba) e ER (calnexina) marcadores são mostrados no painel inferior em amarelo. As setas indicam estruturas vesiculares-like granulares com relativamente intensa SEAM 3 coloração. barras de referência = 20 mm.

Nas células CHP-134, costura 3-reativa epítopos (fluorescência vermelha na Figura 4 células CHP-134 como indicado) foram localizadas principalmente às fronteiras de contato entre células. antígenos de PSA, conforme detectado com o anti-PSA mAb 2-1-B [31] (fluorescência verde na Figura 4 como indicado), também foram localizados principalmente nas regiões de contato célula-célula. Embora a fluorescência resultante do SEAM-3 de ligação foi menor, a intensidade e a distribuição de fluorescência resultante da ligação foi semelhante ao de SEAM 3 em células intactas anti-PSA como é demonstrado pela cor amarela resultante a partir de sobreposição de fluorescência vermelha e verde em relação a imagem composta (Figura 4). Isto foi indicativo de o antigénio SEAM-3 marcado estar localizado na superfície da célula. Além disso, SEAM 3 de marcação foi correlacionada com a rotulagem anti-PSA (Manders coeficiente para verde = 0,998) e, em menor medida, com MACN-anti rotulagem (Manders coeficiente para verde = 0,642; micrografias não mostrado) quer na ausência ou presença de Triton X-100. No entanto, quando as células foram tratadas com detergente não havia menos sobreposição entre SEAM 3 e rotulagem anti-PSA (indicado pelo nível relativamente maior quantidade de fluorescência vermelha no detergente tratada micrografia compósito), sugerindo que houve uma fracção de antigénios reconhecidos pelos mAbs in antígenos comuns e distintos reconhecidos separadamente.

Uma vez que na SK-MEL-28 células a maioria dos antígenos que reagem com SEAM 3 foram localizados em granular como estruturas dentro das células, foi realizada IFM usando marcadores para o Golgi e retículo endoplasmático ( ER) para determinar se SEAM 3 reactividade foi associado com esses organelos subcelulares particulares. marcadores de Golgi incluídos Giantin e golgin-97 para cis /medial e trans Golgi membranas, respectivamente, e tuba, uma proteína multifuncional pensa estar envolvida na regulação da junção célula e tráfico endocítica [32] de vesículas de Golgi derivados no citoplasma [33] . Calnexina, uma proteína de chaperona molecular foi utilizado como um marcador de ER [34]. Tal como mostrado pela presença ou ausência de fluorescência amarelo nas imagens compostas, SEAM 3 foi substancialmente co-localizada com o Golgi e ER (como indicado na Figura 4) marcadores. Co-localização foi analisada ainda mais usando Jacop [35] na imagem J. Todos os marcadores de Golgi e ER foram encontrados para ter alta co-localização para o marcador contra costura 3 (coeficientes Manders ‘para verde todo maior que 0,92) com distribuição óbvia de S3RAs fora dos organelos bem. A co-localização global mais próximo foi entre 3 e SEAM tuba como mostrado na Figura 4. Deste modo, os antigénios NeuPSA detectados usando SEAM 3 estavam localizados principalmente no interior das células e relacionado com o Golgi, ER e matriz celular, mas também estavam presentes na superfície das subpopulações de cada linha celular.

a expressão de polysialyltransferases PST e STX em linhas celulares de cancro

as linhas de células de neuroblastoma CHP-134 e SH-SY5Y foram conhecida para expressar níveis elevados de PSA sob a forma de PSA células -NCAM, enquanto Jurkat e SK-MEL-28 não eram conhecidos para expressar PSA ou MACN. Desde NeuPSA é susceptível de ser derivada de PSA, medimos a expressão do polysialyltransferases α2,8 ST8Sia2 (STX) e ST8Sia4 (PST) ARNm nas quatro linhas celulares por PCR quantitativo. As células SH-SY5Y foram mostrados para expressar tanto STX e PST [36], e foram usadas para comparação dos STX e expressão PST nas outras linhas de células. Utilizando a quantificação absoluta, determinou-se a expressão STX foi mais elevada em células SH-SY5Y, com 1,2 × 10

6 cópias /1 × 10

7 cópias de GAPDH (Figura 5). CHP-134 expressa níveis semelhantes de STX, enquanto que as células SK-MEL-28 expressa quase 100 vezes menos e células Jurkat expressa quase 1000 vezes menos STX. células SH-SY5Y expressou a menor quantidade de PST em comparação com as outras linhas de três células, com 9,0 × 10

2 cópias /1 × 10

7 cópias GAPDH. CHP-134, SK-MEL-28, e Jurkat células expressaram 60, 140, ou 550 vezes mais PST, respectivamente, em comparação com as células SH-SY5Y (Figura 5).

1 ug de ARN total a partir de cada linha celular foi transcritos de modo inverso em ADNc, em seguida, utilizado como molde na reacção de qRT-PCR. Os mRNA número de STX, PST e GAPDH determinada a partir de uma curva padrão de diluir em série padrões cópia é mostrado no gráfico como alvo do mRNA cópias por 10

7 mRNA GAPDH cópias. As barras de erro são a SEM de medições em triplicado de três populações independentes de cada linha de células.

Dependência da SEAM 3 reactividade com SK-MEL-28 células na expressão de polysialyltransferase PST

para estabelecer que SEAM 3 é reactivo com um antigénio que é derivado a partir de PSA, nós investigamos se a inibição da expressão de polysialyltransferase PST ARNm em SK-MEL-28 células com pequeno ARN interferente PST-specific (siARN) resultaria numa diminuição no SEAM células 3-positivos, por citometria de fluxo. O controlo negativo mexidos siRNA ou PST-specific siRNA foi transfectado em células SK-MEL-28 e após 72 horas, a quantidade relativa (RQ) de PST presente diminuiu significativamente (P 0,0001) nas células transfectadas com PST siRNA (RQ = 0,124) em comparação com células transfectadas com ARNsi de controlo negativo (RQ = 1) (Figura 6).

células SK-MEL-28 foram transfectadas transientemente com 50 nM de ARNsi durante 72 horas, em triplicado, em seguida, o ARN total a partir de cada a linha celular foi transcritos de modo inverso em ADNc e utilizado como molde na reacção de qRT-PCR. A quantificação relativa foi determinada usando o método comparativo CT, normalizadas para GAPDH mRNA.

Nesta experiência, seria de esperar que apenas o subconjunto de células transfectadas com o siARN e empobrecido de derivados de pré-existentes de PSA para mostrar falecido reactividade com SEAM 3, se o antigénio reactivo com o mAb era dependente da actividade da PST. Apesar destas limitações, em três experiências separadas com dois realizados em triplicado, a fracção de células positivas SEAM-3 foi significativamente diminuída em células transfectadas com ARNsi de PST em comparação com células transfectadas com ARNsi mexidos (Tabela 4). O resultado mostra claramente que os antígenos reconhecidos pela SEAM 3 em SK MEL-28 células foram dependentes da expressão de PST.

atividade funcional citotóxica da SEAM 3 contra células cancerosas

A função de S3RA em células é desconhecida. Para determinar o efeito de interferir com a função de S3RA expressa na superfície da célula pode ter, as células foram incubadas durante a noite com SEAM 3 a concentrações de mAb utilizados nos estudos de ligação descritos acima. Sob exame microscópico, as células exibiram características de sofrer apoptose (dados não apresentados). Com base nesta observação inicial, foram utilizados dois ensaios independentes para medir o efeito de SEAM 3 sobre a viabilidade das quatro linhas celulares: de citometria de fluxo com o reagente ViaCount e um ensaio de libertação de lactato desidrogenase (LDH). A primeira baseia-se na membrana permeável e corantes fluorescentes de ligação ao ADN impermeável e o ensaio de LDH sobre a libertação de LDH resultante da perda da integridade da membrana. Os resultados para o efeito dependente da concentração de SEAM 3 sobre a viabilidade das quatro linhas celulares após 16 horas de incubação utilizando o ensaio de LDH estão apresentados na Figura 7A. SEAM 3 purificada foi citotóxica contra as quatro linhas celulares testadas, mas o efeito foi variável para cada linha celular. As células Jurkat foram os mais sensíveis à costura anticorpo-3 mediada por citotoxicidade dependente (ADC), enquanto as células SK-MEL-28 foram as menos sensíveis. Aproximadamente 45% das células de Jurkat e 25% de células SH-SY5Y SK-MEL-28, CHP-134, e foram mortos na concentração mais elevada testada SEAM 3. citotoxicidade SEAM 3 mediada pareceu estabilizar-se em uma fração fixa de células. Por exemplo, ADC contra células de Jurkat e SH-SY5Y mediadas por costura 3 aproximou-se um máximo a cerca de 10 ug /ml de SEAM 3 com apenas um aumento marginal na morte em 20 ug /ml (Figura 7A). Os resultados podem reflectir o facto de que tanto o número de células e a quantidade de S3RA expressa pelas células foi variável entre as linhas de células (ver Tabela 3) e que a quantidade de antigénio permanece relativamente constante na população de células ao longo de 16 hr período de tempo. Resultados semelhantes aos apresentados na Figura 7A, foram obtidas utilizando o ensaio de goiaba ViaCount (dados não mostrados). Para demonstrar a especificidade da actividade ADC SEAM 3, buscou-se inibir a matar com solúvel N-Pr Mbps. No entanto, a experiência de inibição foi confundida porque solúvel em n-Pr AMPA foi feita pelas células vivas resultando num aumento marcado na expressão de S3RA (BT Hagen e GR Moe, não publicado).

(A), Anticorpo citotoxicidade dependente de SEAM 3 contra células de Jurkat SK-MEL-28, CHP-134, SH-SY5Y, e tal como medido pelo ensaio de libertação de LDH. Cada linha de células foi incubado com concentrações crescentes de SEAM 3 durante 16 horas. libertação de LDH foi medida e a percentagem de citotoxicidade foi determinada utilizando a libertação espontânea e libertação máxima a seguir ao tratamento com Triton X-100. (B), Análise de SEAM 3 apoptose mediada contra SK-MEL-28 de melanoma células por citometria de fluxo. As células SK-MEL-28 foram incubadas com um mAb irrelevante IgG2b (5 ug /ml), DMSO, 0,1 uM estaurosporina, ou 5 ug /ml de SEAM 3 durante 12 ou 24 horas. As células foram então coradas com fluorescente etiquetado anexina V e iodeto de propídio e a fração de vivos (barras abertas), (barras-nascidos de cruz), e mortos células em apoptose (barras pretas) foi medida por citometria de fluxo.

SEAM 3 ligação induz a apoptose em Jurkat e SK-MEL-28 células

Para determinar se SEAM 3 citotoxicidade resultou de apoptose de Jurkat e células SK-MEL-28, que comparou o efeito do SEAM 3 vinculam as células para o efeito de estaurosporina, um inibidor da quinase geral que é um indutor de apoptose clássico [37]. No exemplo mostrado na Figura 7B, as células SK-MEL 28 foram incubadas durante 12 e 24 horas com o mAb irrelevante, DMSO, estaurosporina, ou costura 3, e o número de células vivas, apoptóticas e mortas foi quantificada utilizando um ensaio de citometria de fluxo medida que o aparecimento de fosfatidilserina à superfície da célula através da ligação de anexina V e conteúdo de ADN por coloração com iodeto de propídio. Como mostrado na Figura 7B, o tratamento com estaurosporina SEAM 3 ou aumentou a percentagem de células apoptóticas e mortas após 12 horas e 24 horas em comparação com os controlos de IgG2b e DMSO, respectivamente. Os resultados para as células de Jurkat incubadas com 10 ug /ml de SEAM 3 foram semelhantes aos mostrados para a SK-MEL 28 células na Figura 7B (dados não mostrados).

Discussão

Pouco se sabe sobre a expressão de antigénios que contêm ácido siálico des-N-acetilo em tecidos humanos normais ou doentes. Estudos publicados até à data apresentaram evidência para a expressão de gangliósidos GM3 GD3 e contendo neu em algumas linhas celulares de cancro e Neu contendo GD3 em tumores de melanoma humanos primários [23], [24], [26]. O nosso laboratório mostrou que as estirpes NmB e o parasita protozoário

Leishmania major expressar

NeuPSA [19], [20], [38], [39], que não tinha sido descrita anteriormente para qualquer organismo.