Abstract

Aim

A desregulamentação dos FOXM1 tem sido documentado em vários cancros. O objetivo deste estudo foi avaliar o papel da FOXM1 na tumorigênese do câncer de ovário e resistência paclitaxel.

Experimental Design by

A expressão de FOXM1 foi examinada em 119 amostras clínicas por imunohistoquímica e correlação com os parâmetros clínico . Efeitos de FOXM1 knockdown sobre a migração de células de cancro do ovário, invasão e catástrofe mitótica também foram estudados. qPCR e chip-qPCR foram utilizados para estabelecer KIF2C como um gene alvo FOXM1 romance implicado em chemoresistance.

Resultados

expressão FOXM1 nuclear alta em amostras de pacientes com câncer de ovário foi significativamente associada com estágios avançados (

P

= 0,035), mais curto global (

P

= 0,019) e (

P

= 0,014) sobrevida livre de doença. A análise multivariada confirmou expressão FOXM1 como um fator prognóstico independente para o câncer de ovário. FOXM1 knockdown migração significativamente inibida e a invasão de células de cancro do ovário e da morte celular mediada pelo paclitaxel melhorada e catástrofe mitótica de uma maneira independente de p53. análise bioinformática sugeriu uma série de alvos de transcrição potenciais de FOXM1. Um dos alvos potenciais, KIF2C, exibiu padrão de expressão semelhante à FOXM1 em células quimiossensíveis e quimiorresistentes em resposta ao tratamento paclitaxel. FOXM1 poderia ser detectado no promotor de KIF2C e FOXM1 silenciar KIF2C significativamente regulada para baixo.

Conclusão

Nossas descobertas sugerem que FOXM1 está associada a um mau prognóstico do paciente e contribui para a resistência paclitaxel através do bloqueio mitótico catástrofe. KIF2C é identificado como um novo alvo transcricional FOXM1 que podem estar implicados na aquisição de quimioresistência. FOXM1 deve ser investigado como um potencial marcador de prognóstico e alvo terapêutico para o câncer de ovário

Citation:. Zhao F, Siu MKY, Jiang L, Tam KF, Ngan HYS, Le XF, et al. (2014) sobre-expressão de forkhead Box proteína M1 (FOXM1) no cancro do ovário se correlaciona com pior sobrevida do paciente e contribui para a resistência Paclitaxel. PLoS ONE 9 (11): e113478. doi: 10.1371 /journal.pone.0113478

editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de fevereiro, 2014; Aceito: 28 de outubro de 2014; Publicação: 20 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Zhao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Fung Zhao é um beneficiário de uma bolsa de estudo conjunta HKU-ICL. Ana Gomes é um companheiro de pós-doutorado apoiado pelo Cancer Research UK. Laura Bella é apoiado por uma bolsa de estudo da Campanha cancro da mama. Pasarat Khongkow é apoiado por bolsas do Royal Thai Goverment. O trabalho de Eric Lam é apoiada por doações da Campanha cancro da mama e Cancer Research UK. O trabalho de Annie Cheung é suportado pelo financiamento do Conselho Bolsas de Investigação da RAEHK. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é o câncer ginecológico mais letal em todo o mundo como a maioria dos pacientes, quando diagnosticados, são apresentados com doença avançada [1]. Apesar de melhora na sobrevida média foi observada nas últimas décadas, as taxas de recaída e mortalidade continuam elevadas, devido em parte à aquisição de chemoresistance [2]. Uma combinação de paclitaxel e carboplatina tem sido amplamente utilizado como a quimioterapia de primeira linha para doentes com cancro do ovário. O Paclitaxel actua especificamente na fase G2-M do ciclo celular através da indução de fusos anormais e perturbação da dinâmica dos microtúbulos, bloqueando assim a progressão do ciclo celular. Apesar de sua eficácia inicial como um agente terapêutico do cancro, na maioria dos casos, os doentes tornam-se, eventualmente, insensível a quimioterapia baseada em paclitaxel e recaída. Portanto, é vital para identificar novos marcadores prognósticos e alvos terapêuticos, particularmente genes relacionados a metástases e resistência aos medicamentos.

caixa de forkhead (Fox) proteínas pertencem a uma superfamília de fatores de transcrição evolutivamente conservadas responsável pela multa espaço-temporal -tuning de um repertório amplo de programas de transcrição, que são necessárias para o desenvolvimento normal e a homeostase [3]. Entre as quais, forkhead caixa de proteína M1 (FOXM1) participa numa grande variedade de processos biológicos incluindo a proliferação celular, a progressão do ciclo celular, diferenciação celular, reparação de danos do ADN, a homeostase dos tecidos, angiogénese e apoptose [4], [5]. Portanto, não é surpreendente que a desregulamentação dos FOXM1 pode resultar em condições patológicas graves, incluindo o cancro. Com efeito, FOXM1 sobre-expressão tem sido documentada em cancros do pulmão, da mama, do fígado, da próstata e do cólon, etc FOXM1 sugerindo que desempenha um papel fundamental na tumorigénese [3], [6]. Recentemente, tem sido demonstrado que a expressão desregulada FOXM1 pode conferir resistência a fármacos quimioterapêuticos, tais como cisplatina e epirrubicina, protegendo as células contra danos induzidos ADN-morte celular e perturbando o ponto de controlo mitótico [7] – [9].

neste estudo, nós investigamos o padrão de FOXM1 expressão no câncer de ovário. Os efeitos de expressão FOXM1 sobre a migração de células de cancro, invasão e resistência ao paclitaxel também foram estudados numa tentativa de avaliar FOXM1 como um potencial marcador de prognóstico molecular e alvo terapêutico para o cancro do ovário. Outras análises foram realizadas para identificar KIF2C como um alvo transcricional romance FOXM1 que poderia estar implicado na aquisição de chemoresistance.

Materiais e Métodos

As amostras clínicas e linhas celulares

Arquivo parafina blocos de tecido embebidos em relação ao ano de 1987 a 2004, foram obtidos a partir do Departamento de Patologia, Hospital queen Mary, Universidade de Hong Kong. As amostras incluiu 2 cystadenomas benignos, 2 tumores borderline, 94 carcinomas primários e 21 focos metastáticos de câncer (no ligamento, intestino, linfonodo e serosa). Todos os pacientes com carcinoma passou por uma cirurgia seguida de quimioterapia de primeira linha padrão, incluindo platina /paclitaxel. O período de seguimento variou de 5 a 209 meses (mediana 63 meses). O uso destas amostras foi aprovado pelo Ethical Review Board Institucional. Cada amostra do paciente foi avaliada por patologistas e garantiu para conter mais de 70% de células tumorais.

linhas de células de cancro do ovário SKOV-3 e OVCAR-3 foram adquiridos da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). células SKOV3-TR foram uma oferta generosa do Dr. Lawrence XF Le (Division of Cancer Medicine, University of Texas M.D. Anderson Cancer Center, em Houston, Texas, EUA) [10]. PEO1 e PEO1-TaxR foram recentemente desenvolvidas linhas celulares e foram autenticados nas instalações Cancer Research UK. O uso de PEO1 e PEO1-TaxR em vez de SKOV-3 e SKOV3-TR para algumas experiências oferece meios adicionais para assegurar que os mecanismos de resistência identificados em células SKOV-3 e SKOV3-TR são comuns a todas as células de cancro do ovário resistentes a paclitaxel e não exclusivo a SKOV-3 e SKOV3-TR. Importante, tanto PEO1 e PEO1-TaxR são mantidos para passagens inferiores para evitar desvios na resistência e na aquisição de mutações secundárias [10] [11]. OVCAR-3 foi cultivada em Meio 199 01:01 (Invitrogen, CA, EUA): MCDB105 (Sigma, MO, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 100 unidades /ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen). SKOV3, SKOV3-TR, PEO1 e PEO1-TaxR foram cultivadas em RPMI 1640 (Sigma) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 100 unidades /ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen). PEO1-TaxR foi suplementado com 50 nM de paclitaxel. Todas as linhas celulares foram mantidas a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO

2. meio de cultura de células foi trocado a cada 3 a 5 dias, dependendo da densidade celular. Para passagem de rotina, quando as células atingiram 85% a 90% de confluência, elas foram divididas numa proporção de 01:04.

A imuno-histoquímica

A imuno-histoquímica foi realizada como descrito anteriormente [12], [13 ]. Resumidamente, secções de parafina fixado em formalina e foram incubadas com anticorpo anti-FOXM1 (NBP1-30961, 01:40, Novus Biologicals, CO, EUA) durante a noite à temperatura ambiente e coradas utilizando EnVision + Dual Link System (K4061; Dako, CA, EUA) . A recuperação de antígenos foi realizada utilizando tampão de EDTA, pH 8,0, numa panela de pressão durante 30 minutos. Todas as secções foram avaliadas por dois investigadores independentes. A imunorreactividade do anticorpo FOXM1, a intensidade de células coradas e as suas percentagens foram medidos em termos de intensidade e contagens percentuais, respectivamente. A pontuação percentagem variou de 0 a 4: 0 = 5% de células coradas positivamente, 1 = 5-25% de células coradas positivamente, 2 = 26-60% de células coradas positivamente, 3 = 61-85% de positivamente de células marcadas, e 4 = 86-100% de células marcadas positivamente. Imuno-histoquímica (IHQ) pontuação (de 0 a 16) foi calculada multiplicando a pontuação de intensidade (0-4) e a porcentagem da pontuação (0-4), com uma pontuação máxima de 16 [12], [13]. FOXM1 imunorreactividades nucleares e citoplasmáticos foram pontuadas separadamente.

Western blot

As células foram recolhidas com tamp de lise [Tris 0,125 M, pH 6,8 a 22 ° C, contendo 1% de NP-40 (v /v ), 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), N-etilmaleimida 2 mM, fluoreto de fenilmetanossulfonilo 2 mM (PMSF), ortovanadato de sódio 1 mM e 0,1 uM okadate de sódio] e centrifugadas a 4 ° C durante 10 min. A concentração de proteína foi determinada por (CC) ensaio de proteína compatíveis com detergentes (Bio-Rad). Vinte microgramas de proteína foram separados por electroforese em dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida gel (SDS-PAGE), transferidos para membrana de difluoreto de polivinilideno e hibridado com os seguintes anti-corpos: anti-FOXM1 (sc-502, Santa Cruz Biotechnology, CA, EUA) , anti-caspase 9 (9502, Cell Signaling Technology, MA, EUA), anti-KIF2C (WH0011004M1, Sigma), anti-caspase 7 (9492, Cell Signaling) e anti-β-tubulina (sc-9104, Santa Cruz Biotechnology ).

quantitativo em tempo real PCR

quantitativo em tempo real PCR (qPCR) foi realizada utilizando Poder SYBR Green PCR master Mix (Applied Biosystems) e analisados ​​por ABI7900 Sequence Detection System (Applied Biosystems ). L19 (RPL19), um gene de manutenção não regulada ribossomal foi utilizado como um controlo interno para normalização usando o método de delta-Ct Delta. Foram utilizados os seguintes iniciadores:

KIF2C directo 5 ‘para 3’: CATGATTGCCACGATCTCAC

KIF2C reverso 5 ‘para 3’: CGTTAGAGCAGGCTTCCATC

L19 directo 5 ‘para 3’: GCGGAAGGGTACAGCCAAT

L19 reversa 5 ‘para 3’: GCAGCCGGCGCAAA

knockdown Transient de FOXM1

ON-Target Plus Humano FOXM1 siRNA e não-alvo Controle de siRNAs (Thermo Scientific, CO , EUA) foram empregados para silenciamento transitória de FOXM1 usando Oligofectamine reagente de transfecção (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

In Vitro

migração e invasão ensaios

In Vitro

ensaios de migração e invasão foram realizados como descrito anteriormente [12], [13]. Resumidamente, 1,25 × 10

5 as células foram plaqueadas no compartimento superior de uma câmara de Transwell (Corning Life Sciences, MA, EUA). Para os ensaios de migração, as células foram deixadas migrar através de uma membrana revestida de gelatina. Para os ensaios de invasão, as células foram deixadas a invadir através de uma membrana revestida de Matrigel. Após 24 h, as células no lado superior da membrana foram removidos e as células que migraram ou invadidas foram fixadas, coradas e contadas.

marcação terminal dUTP nick mediada por TdT (TUNEL) e ensaio de avaliação do índice de catástrofe mitótica

Seguindo FOXM1 knockdown durante 48 h e o tratamento com paclitaxel (50 nM) durante 24 h, ensaio de TUNEL foi realizado utilizando In Situ Morte Detecção Kit (Roche Biochemical, IN, EUA) seguindo o protocolo do fabricante [14]. Apoptótica e figuras catástrofe mitóticas foram avaliados sob microscopia de fluorescência. figuras catástrofe mitóticas foram observados por alterações morfológicas nos núcleos (coloração DAPI) [10]. Mais do que 1000 células viáveis ​​em cada experiência foram examinadas e o índice de catástrofe mitótica foi avaliada como percentagens das células contadas. Cada ensaio foi executado em triplicado.

análise do ciclo celular

análise do ciclo celular foi realizada por coloração com iodeto de propidio tal como descrito anteriormente [15]. Resumidamente, as células aderentes e em suspensão tanto foram colhidas e coradas com iodeto de propídio (1 mg /ml) na presença de ARNase isenta de ADNase para a análise de citometria de fluxo. perfil do ciclo celular foi analisada utilizando o software celular Diva (Becton Dickinson UK Ltd.).

Cromatina imunoprecipitação

40 ul de Dynabeads Proteína A (10002D, Invitrogen) foi lavada com 200 mL de EET I de tampão três vezes e diluiu-se com 40 mL de TSE eu tampão. Anti-FOXM1 (sc502, Santa Cruz Biotechnology) (4 ng) e controlo de IgG de coelho (X0903, Dako) (4 ug) foram primeiro diluídos separadamente em tampão D, misturado com Dynabeads diluído e, em seguida, rodado O /N a 4 ° C. células PEO1 e PEO1-TaxR a 90% de confluência em placa de cultura de 100 milímetros foram reticuladas com formaldeído a 1% durante 10 min, lavadas com PBS arrefecido em gelo e incubadas com 2,5 M de glicina durante 5 min. As células foram então colhidas com 2 ml de tampão de demolição. Depois de uma lavagem sequencial com PBS, tampão de I e tampão II, sedimento de células foi ressuspenso em 300 ul de tampão de lise e sujeita a ultra-sons sob condições optimizadas (20 min, com 30 s de 30 e s desligado). O sobrenadante foi, em seguida, diluiu-se em 300 uL de tampão D a partir da qual 100 ul foi tomada como controlo ENTRADA. 200 ul de lisado celular foi misturado com Dynabeads preparados e rodado O /N a 4 ° C. Depois de uma lavagem sequencial com EET I, TSE II, III e tampão de tampão TE, 100 ul de tampão de eluição foi adicionado às Dynabeads e a mistura foi rodada a temperatura ambiente durante 1 h. amostra eluida foi recolhida em Eppendorf e as Dynabeads foi re-eluiu-se com mais 100 ul de tampão de eluição. 200 ul de amostra foi de-reticulada por incubação a 65 ° C O /N. PCR Purification Kit (Qiagen) foi então usado para purificar ADN. Quantitative PCR em tempo real foi realizado com os seguintes iniciadores: KIF2C (Forward 5 ‘para 3’: GCCAAGTCTCCAACTTGCTC; reverso 5 ‘para 3’: TTCCCAACCATCTTCCTACG)

ChIP-qPCR dados foram normalizados para controlo de IgG e representados graficamente. como entrada por cento. Composição dos buffers foi listado na Tabela 1.

A análise estatística

A análise estatística foi realizada pelo programa Statistical Package for Social Science versão 19.0 para Windows (IBM). Comparação entre dois grupos de dados não paramétricos foi realizada por Mann-Whitney

U

-teste. Probabilidade de sobrevivência foi analisada utilizando a abordagem de Kaplan-Meier. A análise multivariada de fatores prognósticos foi realizada utilizando modelo de regressão de Cox.

P

-Valores de 0,05 foram considerados estatisticamente significativa

Resultados

FOXM1 superexpressão correlaciona-se com a sobrevivência pobre

A expressão de FOXM1 nuclear. em tumores benignos e borderline de ovário, assim como cânceres invasivos foi avaliada por imuno-histoquímica. cancros do ovário exibido forte coloração FOXM1 nuclear do que os tumores benignos e limítrofes. No entanto, não houve diferença significativa na expressão FOXM1 entre carcinomas primários e os seus focos metastáticos (

P

= 0,6). Maior expressão FOXM1 nuclear foi significativamente associada com estágios avançados de câncer de ovário (

P

= 0,035) (Fig. 1A). Embora não atingiu significância estatística, FOXM1 superexpressão exibido uma tendência relacionada com o tipo serosa histológico (

P

= 0,142), cânceres de alto grau (pobre diferenciação) (

P

= 0,235) e chemoresistance (

P

= 0,282) (Tabela 2). A fim de estudar a associação de expressão FOXM1 com a evolução dos pacientes, os pacientes foram classificados em dois grupos utilizando o ponto de corte de pontuação IHC 0. Como mostrado na trama sobrevida global de Kaplan-Meier (Fig. 1B), pacientes com coloração FOXM1 negativa teve um significativamente mais tempo no geral (

P

= 0,019) e sobrevida livre de doença (

P

= 0,014) do que aqueles com expressão positiva FOXM1. análise de progressão multivariada mostrou alta expressão de FOXM1, estágios de câncer avançado e diferenciação histológica mau (alto grau) foram encontrados para ser fatores prognósticos independentes para a sobrevivência curta geral (95% CI, 0,906-5,754, HR 2.283,

P

= 0,08; 95% CI, 0,953-5,963, HR 2.384,

P

= 0,06; 95% CI, 2,137-40,638, HR 9,318,

P

= 0,003, respectivamente) e doença- sobrevida livre (95% CI, 1,025-6,631, HR 2.607,

P

= 0,04; 95% CI, 1,039-6,555, HR 2,61,

P

= 0,04; IC de 95%, 1.821 -35,091, HR 7,993,

P

= 0,006, respectivamente). Curiosamente, coloração citoplasmática de FOXM1 foi também detectada, além de expressão nuclear, mas não foi observada nenhuma correlação significativa com os parâmetros clínico (dados não mostrados).

A, Imagens representativas de imunorreactividade do FOXM1 nuclear em (I) benigna cystadenoma, (II) de tumor borderline (III) a fase I cancro invasivo, (IV) estágio II de câncer invasivo, (V) fase III do câncer invasivo e câncer invasivo (VI) em estágio IV. Ampliações X400. Inserir: Regiões com ampliações de coloração FOXM1 nuclear. B, lotes de sobrevida global e livre de doença acumulados usando a abordagem de Kaplan-Meier.

knockdown Transient de FOXM1 inibe-3 SKOV migração e invasão celular

A seguir, estudou o papel de FOXM1 na progressão do cancro do ovário.

In Vitro

Transwell ensaios foram utilizados para estudar os efeitos de silenciamento de FOXM1 transiente sobre a motilidade celular e a invasão do cancro do ovário. Diminuiu significativamente a migração e invasão (

P

0,05) foi observada em células SKOV-3 transfectadas com ON-Target Plus humano FOXM1 siRNA (siFOXM1) em comparação com células transfectadas com ARNsi de controlo (siControl), indicando que knockdown de FOXM1 foi capaz de inibir a migração e a invasão de células SKOV3 (Fig. 2).

. Imagens representativas que mostram as células migraram (membrana revestida de gelatina) ou (membrana revestida de matrigel) invadido após 24 h. B. Representante Western Blot análise demonstrando a eficácia da FOXM1 knockdown transitória em SKOV-3. C. representação gráfica de migração (painel da esquerda) e invasão (painel da direita) como resultados de mudança de dobragem de células que migraram e invadido em relação ao controlo, respectivamente, em cinco campos de poços em triplicado a partir de três experiências independentes; * P 0,05, significativa; Mann-Whitney

U

-teste.

tratamento Paclitaxel regula negativamente a expressão de FOXM1 em SKOV-3, mas não no paclitaxel-resistentes SKOV3-TR

vista da coloração mostrando IHC que elevada expressão FOXM1 está associado com prognóstico pobre e, portanto, quimiorresistência, um par de linha de células de cancro do ovário estabelecida sensível e resistente ao paclitaxel, a saber, SKOV-3 e SKOV3-TR, respectivamente, foram utilizados para estudar o efeito de o tratamento com paclitaxel na expressão de FOXM1. As células foram tratadas com paclitaxel (100 nM) e colhidas em vários pontos 0, 8, 16, 24, 48 e 72 h de tempo. Curiosamente, imunotransferência mostrou expressão FOXM1 de ser diminuída em 48 h e 72 h em SKOV-3. No entanto, a expressão FOXM1 manteve-se relativamente constante em níveis elevados em células SKOV3-TR em cima do tratamento com paclitaxel (Fig. 3), sugerindo um papel na mediação de FOXM1 resistência paclitaxel em células de cancro do ovário. Notavelmente, há também pareceu ser apenas aumentos marginais na expressão de caspase-9 clivada e caspase-7 em ambos SKOV-3 e SKOV3-TR mediante o tratamento com paclitaxel, sugerindo que a apoptose pode não ser o mecanismo predominante de induzir a morte celular nessas células de carcinoma de ovário.

O paclitaxel sensível SKOV-3 e células de cancro do ovário SKOV3 TR-resistentes foram tratadas com 100 nM de paclitaxel e recolhidas em momentos indicados para a análise de Western blot. tratamento com paclitaxel regulada para baixo expressão FOXM1 no momento aponta 48 h e 72 h em SKOV-3, mas não em SKOV3-TR como mostrado por immunoblotting. Também não houve mudanças marcantes na expressão da caspase-9 e caspase-7 clivada.

silenciamento Transient de FOXM1 aumenta significativamente mediada pelo paclitaxel catástrofe mitótico

Nós já mostraram que o paclitaxel mata células de cancro do ovário predominantemente por indução de catástrofe mitótica em vez de apoptose em células [10]. Para elucidar o potencial papel de FOXM1 na quimiorresistência cancro do ovário, linhagens de células cancerosas do ovário SKOV-3 e OVCAR3 foram tratadas com paclitaxel durante 24 h após a depleção FOXM1 por ARNsi, corados com DAPI e examinadas por microscopia de fluorescência. O resultado mostrou que havia um aumento do número de células multinucleadas (seta) em células de cancro do ovário com knockdown FOXM1 (

P

= 0,03 e 0,01, respectivamente) (Fig. 4), sugerindo que o paclitaxel depleção FOXM1 significativamente melhorada catástrofe mitótica mediada tanto em células SKOV-3 e OVCAR3. É notável que a apoptose foi dificilmente detectável nestas células tratadas com paclitaxel. Isto foi provavelmente devido ao facto de que tanto SKOV-3 e OVCAR3 abrigar p53 disfuncional, e p53 funcional é necessária para a apoptose induzida por paclitaxel em células de cancro do ovário.

células SKOV-3 e OVCAR3 transfectadas com ARNsi de piscinas contra FOXM1 piscinas ou de ARNip de controlo foram tratados com paclitaxel (100 nM) e corados com DAPI. A. resultados de coloração representativos foram mostradas mostrando que FOXM1 transiente knockdown significativamente melhorada catástrofe mitótica induzida por paclitaxel (seta) em células SKOV-3 e OVCAR3 respectivamente (painel superior). B. Os gráficos representam os resultados de três experiências independentes, mostrando a percentagem de células que sofrem catástrofe mitótica, * P 0,05, significativa; Mann-Whitney

U

-teste.

FOXM1 knockdown induz aumentos modestos no acúmulo de células mortas G2 /M e após o tratamento com paclitaxel na linha de células SKOV3-TR resistentes

análise do ciclo celular foi então realizada para elucidar o papel do FOXM1 na morte celular mediada pelo paclitaxel. Para este fim, as células SKOV-3 e SKOV3-TR foram transientemente transfectadas com ARNsi de controlo e FOXM1 durante 48 horas e cultivadas na presença ou na ausência de tratamento com paclitaxel (100 nM) durante 48 h. As células resultantes foram colhidas, coradas com iodeto de propídio e submetidas a análise citométrica de fluxo. Os resultados mostraram que o paclitaxel induziu níveis significativos de morte celular (população sub-G1) em células SKOV-3 transfectadas com FOXM1 ou controlar piscina siRNA (Fig. 5A, painel superior). Aumento do número de células acumuladas com sub-G1 conteúdo de ADN em células SKOV3-TR com FOXM1 knockdown (8,1%) (Fig. 5A, painel superior) em comparação com SKOV3-TR transfectadas com ARNsi de controlo (4.2%) A Fig. 5A, painel superior ( ), sugerindo FOXM1 contribui para a resistência paclitaxel em células de cancro do ovário e que o silenciamento FOXM1 pode aumentar a morte celular mediada pelo paclitaxel. Após o tratamento com paclitaxel, um aumento modesto em células bloqueadas em fase G2 /M foi também observada em células SKOV3-TR tratadas com ARNsi contra FOXM1, em comparação com o controlo, sugerindo FOXM1 silenciamento pode aumentar a morte celular mediada pelo paclitaxel através de catástrofe mitótica (Fig. 5A, painel inferior; A Fig. 5B). Depleção de FOXM1 nas células sensíveis SKOV-3 não tem efeito aditivo para o tratamento com paclitaxel. Isto é provavelmente devido ao facto de as funções de paclitaxel através de regular negativamente a expressão FOXM1 como revelado pela análise de mancha de Western (ver Fig. 3).

. A análise de citometria de fluxo foi realizada de acordo com coloração com iodeto de propídio sobre células SKOV-3 e SKOV-3-TR células tratadas com paclitaxel (100 nM) ou permaneceram sem tratamento ap a transfeco com siRNA piscinas contra FOXM1 ou controlar piscinas siRNA. Os dados representativos são mostrados indicando que FOXM1 silenciamento é capaz de aumentar o número de células mortas e as células bloqueadas em fase G2 do ciclo celular /M em SKOV-3-TR, em comparação com as células tratadas com ARNsi de controlo. B. gráficos de barras de diferentes fases do ciclo celular em células SKOV-3 e SKOV3-TR tratados com paclitaxel após a transfecção com controlo ou ARNsi contra FOXM1. Os resultados representam dados de dois experimentos independentes.

KIF2C é identificado como um romance FOXM1 alvo transcricional que podem estar implicados na aquisição de chemoresistance

análise bioinformática revelou KIF2C, um membro da KIF superfamília de proteínas, como um potencial gene alvo de FOXM1 com sítios localizados a montante do local de início da transcrição (Fig. 6D) de ligação consenso forkhead. Usando um par de linha de células (PEO1) e resistente à sensível ao paclitaxel (PEO1-TaxR) do cancro do ovário, tratamento de paclitaxel-regulada a expressão de KIF2C às 48 he 72 h em PEO1. No entanto, a expressão KIF2C manteve-se relativamente constante em PEO1-TaxR após o tratamento com paclitaxel (Fig. 6A), o que sugere um papel na mediação de KIF2C resistência paclitaxel em células de cancro do ovário. Curiosamente, as expressões de FOXM1 alterado em um padrão semelhante (Fig. 6A). Quantitative PCR em tempo real (qPCR) foi então usado para estudar o efeito de silenciamento de FOXM1 transiente sobre o nível de transcrição KIF2C. FOXM1 knockdown resultou na expressão significativamente regulada para baixo de ARNm de KIF2C em ambas as linhas celulares (P 0,05) (Figura 6-B.). Cromatina imunoprecipitação-qPCR (ChIP-qPCR) mostrou ainda FOXM1 era capaz de se ligar à região do promotor de KIF2C (P 0,05). (Fig. 6C), o que implica KIF2C pode servir como um romance FOXM1 alvo transcricional

a, o tratamento com paclitaxel (50 nM) regulada para baixo expressões FoxM1 e KIF2C às 48 he 72 h em PEO1 mas não em PEO1-TaxR. B, FOXM1 knockdown reduziu significativamente o nível de transcrição de KIF2C em PEO1 e PEO1-TaxR. Os dados representam triplicado de três experiências. * P = 0,04, P = 0,0003 ***. siControl: controle não-específica. siFOXM1: knockdown FOXM1. C, Chip-qPCR mostrou FOXM1 puxar significativamente baixo região promotora KIF2C em PEO1 e PEO1-TaxR em comparação com o controlo de IgG negativo. Os dados representam triplicado de três experiências. * P = 0,04, *** P = 0,0001. D, diagrama esquemático, representando locais de elemento forkhead resposta (FHRE) e o sítio de ligação de iniciadores utilizados na ChIP-qPCR a montante do local de início da transcrição de KIF2C.

Discussão

neste estudo, nós mostramos que a alta expressão FOXM1 nuclear é significativamente correlacionada com a fase, a sobrevida global mais curto e sobrevida livre de doença de pacientes com câncer de ovário. A análise multivariada indica que a expressão FOXM1 poderia servir como um fator prognóstico independente. Além disso, a depleção FOXM1 transiente é capaz de inibir a migração de células do cancro do ovário. Estes achados sugerem que FOXM1 pode ter um papel crucial na carcinogênese ovariana e progressão e pode prever o resultado dos pacientes.

Apesar de a associação de FOXM1 com carcinomas ovarianos alta qualidade tem sido relatada [16], se FOXM1 participa na aquisição de resistência paclitaxel permanece indefinida. Com efeito, FOXM1 expressão desregulada tem sido demonstrado para conferir resistência a fármacos quimioterapêuticos, tais como cisplatina e epirrubicina [8], [9]. Tendo em vista a associação entre constatação sugere imuno-histoquímica e FOXM1 quimiorresistência, um par de paclitaxel-sensíveis e resistentes ao linhas celulares estabelecidas, SKOV-3 e SKOV3-TR [10], foram utilizados para estudar o efeito do paclitaxel na FOXM1. Curiosamente, o tratamento com paclitaxel resultou na sub-regulação de FOXM1 em SKOV-3, mas não na linha celular resistente SKOV3-TR, implicando um papel na mediação de FOXM1 resistência paclitaxel em células de cancro do ovário. Imunofluorescência estudo mostrou ainda transiente knockdown FOXM1 poderia aumentar a morte celular mediada pelo paclitaxel em duas linhas celulares de cancro do ovário, SKOV-3 (p53 deletada) [17] e OVCAR3 (p53 mutante) [18]. Não é de surpreender que as células em apoptose foram mal detectável como ambas as linhas celulares abrigam p53 disfuncional. Recentemente, foi sugerido que a indução de apoptose independente de p53 tem lugar através da activação de caspase-9 [19]. No entanto, imunotransferência revelou a caspase-9 não foi activada mediante tratamento com paclitaxel em células-TR SKOV-3 SKOV-3 e, o que indica que ambos o paclitaxel e FOXM1 silenciamento morte celular efeito principalmente através do aumento catástrofe mitótica em vez de apoptose em células de cancro do ovário, o que vulgarmente têm via p53 disfuncional. Isto é consistente com descobertas anteriores de paclitaxel no cancro da mama [20].

catástrofe mitótica pode ser considerada como um tipo de morte celular que ocorre durante a mitose ou resultantes da falha mitótico [21]. Dois mecanismos têm sido sugeridos como crucial para a catástrofe mitótica, ou seja, a G2 /M e pontos de controlo do fuso mitótico [22]. Para o G2 M checkpoint /, a inativação de genes tais como

p53

,

p21

Cip1

e

14-3-3Sigma

foram relatados para induzir DNA mitótico catástrofe induzida por danos [23], [24]. análise de citometria de fluxo realizada em nosso estudo sugeriu FOXM1 knockdown no resistente à quimioterapia linha de células de cancro do ovário SKOV3-TR poderia induzir a morte celular. o tratamento com paclitaxel e análise de imunofluorescência ainda sugerido FOXM1 silenciamento pode melhorar catástrofe mitótica mediada pelo paclitaxel de um modo independente de p53 e caspase-9-independente. Delineação do mecanismo subjacente pelo qual FOXM1 medeia a resistência paclitaxel vai lançar luz sobre novas abordagens de tratamento.

Cinesina proteínas da superfamília (KIFS) desempenham um papel central no transporte intracelular de organelas e manutenção de montagem do fuso durante a mitose e meiose [ ,,,0],25]. Sendo o membro fundador e melhor caracterizados da família kinesin-13, KIF2C /MCAK é crucial para assegurar a segregação fiel de cromossomos na mitose e de salvaguarda da estabilidade cromossômica [26]. Não surpreendentemente,-se-regulamentos de KIF2C foram documentados em vários cancros humanos e KIF2C tem sido sugerido para desempenhar um papel importante na carcinogénese [27], [28]. No estudo atual, a análise immunoblotting mostraram expressão KIF2C em PEO1 alterada em um padrão semelhante como expressão FOXM1 exibindo uma infra-regulação às 48 h e 72 h após o tratamento com paclitaxel. Em contraste, a expressão KIF2C manteve-se relativamente constante em PEO1-TaxR, implicando KIF2C pode estar envolvido no desenvolvimento de resistência paclitaxel no cancro do ovário. Esta descoberta é consistente com um recente relatório demonstra a perda de KIF2C poderia aumentar a sensibilidade de ovário de hamster chinês (CHO) com paclitaxel [29]. Além disso, KIF2C foi identificado como um novo alvo FOXM1 transcrição que podem desempenhar um papel fundamental na mediação de resistência paclitaxel em células de cancro do ovário.

Em conclusão, a superexpressão de FOXM1 foi encontrado para ser correlacionada com a sobrevida dos pacientes pobres e catástrofe mitótico mediada por paclitaxel em células de cancro do ovário.