Abstract

Em uma estratégia de duas etapas, uma intraperitoneal (IP) A injecção de poli (etileno glicol) –

bloquear

poli (ε-caprolactona) (PEG

b

-PCL) contendo micelas de paclitaxel (PTX), ciclopamina (CYP), e gossipol (SPG) com 30, 30, e 30 mg /kg, respectivamente, debulked tecidos tumorais cerca de 1,3 vezes, com base na perda de bioluminescência com 10% de mudança de peso corporal, e a apoptose induzida em tumores peritoneais quando usado como quimioterapia neoadjuvante (nact) num modelo de xenoenxerto de ES-2-Luc-rolamento para o cancro do ovário. Em uma segunda etapa, uma única intravenosa (IV) A injecção de-segmentação apoptose GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-

b

micelas -PCL contendo um (NIR) sonda fluorescente no infravermelho próximo, dir (indotricarbocyanine 1,1 ‘dioctadecyltetramethyl iodeto), resultou em aumento da acumulação diR peritoneal em induzida por apoptose ES-2-luc tecidos tumorais (

ex vivo

) em 1,5 vezes em comparação com moléculas dir entregues por metoxi PEG-

b

micelas -PCL (não segmentados) às 48 h após a injecção IV, em uma segunda etapa. Como resultado, um conjunto de PEG-

b

micelas -PCL permitiu a detecção de alta resolução do

ca. 1 mm tumores de diâmetro, o ressecção de aproximadamente 90% dos tumores, e um baixo índice de câncer de peritoneal (PCI) do

Ca

. 7. Assim, um conjunto de PEG-

b

micelas -PCL utilizados para NCAT NIR e imagens de fluorescência da apoptose induzida pela terapêutica cirúrgica para orientação intraoperatória pode ser uma estratégia promissora para o tratamento de cancro metastático do ovário.

Citation: Cho H, Cho CS, Indig GL, Lavasanifar a, Vakili MR, Kwon GS (2014) polimérica micelas para a apoptose segmentadas imagens ópticas de Câncer e intra-operatória de Orientação cirúrgica. PLoS ONE 9 (2): e89968. doi: 10.1371 /journal.pone.0089968

editor: Sung Wan Kim, da Universidade de Utah, Estados Unidos da América

Recebido: 07 de novembro de 2013; Aceito: 23 de janeiro de 2014; Publicação: 26 de fevereiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Cho et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health (R21 CA-161537) e Carbone Cancer Center da Universidade de Wisconsin-Madison. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é retratado como a doença que sussurra devido aos sintomas indolentes em estágios iniciais [1]. Infelizmente, não existem testes de rastreio eficazes: triagem geral do antígeno do câncer de soro 125 (CA 125) ou ultra-sonografia transvaginal não permitem a detecção precoce do câncer de ovário. Em parte devido às dificuldades no diagnóstico, o câncer de ovário é a neoplasia maligna ginecológica mais letal [2]. A estratégia de tratamento convencional para o câncer de ovário envolve uma abordagem combinada utilizando cytoreductive cirurgia agressiva e intravenosa (IV) a quimioterapia (platina e taxanos análogos) [3].

Na última década, um benefício potencial da quimioterapia dada pela intraperitoneal (IP) rota para câncer de ovário tem sido visto em vários ensaios clínicos, e tem sido destaque que a quimioterapia IP pode dar altas taxas de resposta dentro do abdómen devido à barreira de plasma peritoneal limitando a exposição de quimioterapia para superfície peritoneal, resultando em maior droga concentração na cavidade peritoneal [3].

a cirurgia é crítica para pacientes com cancros colo-rectais e dos ovários que se espalharam amplamente para a cavidade peritoneal. Existem três tipos de citorredução cirúrgica que têm sido tentadas para tratar pacientes com cancro do ovário: (1) a cirurgia citorredução primária (cirurgia inicial), que tem sido largamente adoptado o método standard; (2) a cirurgia debulking intervalo após quimioterapia neoadjuvante (Nact), reservado para os pacientes que são medicamente inapto para operação imediata ou cuja metástases extensa não pode ser inicialmente ressecado; e (3) a cirurgia secundária debulking (cirurgia adicional), para pacientes que desenvolvem câncer de ovário resistente à quimioterapia recorrente [1]. Embora a abordagem cirúrgica ideal permanece controversa, é muito claro que a melhoria dos sistemas de imagem câncer intra-operatórias trará benefícios significativos para debulking cirúrgico com sucesso de câncer de ovário. Embora as abordagens radiológicos, como a tomografia computadorizada (TC) e ressonância magnética (RM) têm sido de grande ajuda na caracterização de doenças malignas dentro da cavidade peritoneal, eles não são úteis para a avaliação intra-operatória. Em contraste, imagiologia de fluorescência tem sido mostrado para ser bem sucedido em ensaios pré-clínicos e clínicos como um técnica óptica que oferecem imagens em tempo real de alvos cirúrgicos (carcinomatose peritoneal e cancro da mama) com resolução de imagem adequada e elevada sensibilidade intra-operatório [4] – [8] . Coll e seus colegas relataram que a cirurgia intra-operatória do infravermelho próximo (NIR) de fluorescência guiada por imagem usando um de metas de tumor peptídeo, JANGADA-c (RGDfK)

4-Alex Fluor 700 (via IV), em um-pGL3-bearing TSA modelo do rato do adenocarcinoma peritoneal poderia melhorar a qualidade de debulking cirúrgico, duplicando o número de nódulos tumorais detectadas e encurtando o tempo de operação [5]. Ntziachristos e colegas realizaram com sucesso o primeiro teste em humanos de imagens de fluorescência específica do tumor intra-operatória no estadiamento e cirurgia debulking para câncer de ovário usando IV folato-FITC, e provou que o número de tumores detectados por cirurgiões sob a orientação de imagens de fluorescência específicas do tumor aumentou de 5,3 vezes (34

vs.

7), em comparação com a luz branca observação visual por si só [7]. Frangioni e colegas de trabalho também demonstrou a utilidade do FLARE (ressecção Assistida por Fluorescência e Exploração) dispositivo para cirurgia oncológica guiada por imagem no primeiro ensaio clínico em humanos de nó de câncer de mama linfonodo sentinela (SLN) mapeamento após a injecção intratumoral /subcutânea de 1 :1 mistura de indocianina albumina sérica verde e humana (ICG: HAS) [6]. Neste ensaio, SLNs identificados pela linfocintilografia e NIR fluorescência de imagem eram idênticos em 4 dos pacientes com câncer de mama 6

A aplicação de nanomateriais como agentes de imagem de fluorescência óptica usando pontos quânticos, nanopartículas de ouro, e de fluorescência sonda contendo ou. – nanopartículas conjugado tem chamado a atenção para fins de diagnóstico em estudos pré-clínicos [9] – [13]. As micelas poliméricas pertencem a uma classe importante de nanomateriais que entraram vários ensaios clínicos para a entrega da droga,

por exemplo

. SP-1049C (doxorrubicina, fase II), Genexol-PM (paclitaxel, fase II) e NC-6004 (cisplatina, fase I) [14]. As micelas poliméricas oferecem várias vantagens, não só como transportadores de drogas, mas também como agentes de imagem óptica em oncologia:-partículas de pequeno porte com distribuição estreita de tamanho, estabilidade estrutural, de alta solubilidade em água, baixa efeito colateral tóxico sobre surfactantes convencionais (

por exemplo

. Cremophor EL), a acumulação preferencial em tumores sólidos através de permeabilidade aumentada e retenção de efeito (EPR), fugindo filtração renal e multifuncionalidade pela decoração de superfície.

tem sido discutido que a entrega de drogas específicas-apoptose e imagiologia do cancro ( especialmente para imagiologia de capacidade de resposta do tumor à quimioterapia) [15], [16] pode ser superior ao antígeno associado a um cancro ou uma estratégia de direccionamento de proteínas numa vasta gama de doenças malignas, devido heterogeneidade significativa nas populações de células de cancro não garante a presença exclusiva de antigénio e proteína biomarcadores em tecidos-alvo [17]. oncologistas cirúrgicos poderia tirar proveito de imagiologia tumor segmentadas por apoptose (independente do tipo de célula e gatilhos de indução de morte celular) após Nact com maior precisão e exatidão [18]. Assim, tumor cirúrgica debulking usando orientação visual intra-operatório com em tempo real imagens NIR de fluorescência poderia resultar em maior precisão cirúrgica e resultado. Uma das características mais proeminentes da morte celular programada, apoptose, é a externalização de fosfatidilserina (PS), que normalmente reside predominantemente no folheto interno da membrana plasmática [18].

Em nosso trabalho anterior, informamos que poli (etileno glicol) –

bloquear

-poli (ε-caprolactona) (PEG-

b)

-PCL micelas contendo dir (iodeto de 1,1-indotricarbocyanine dioctadecyltetramethyl) pode acumular-se passivamente LS180 em tecidos de tumor sólido humano do cólon por efeito EPR e proporcionar delimitação não invasiva de tecidos tumorais LS180 com uma razão tumor-para-muscular de 30-43 a partir de tecidos recolhidos [19]. Observou-se também melhorada acumulação DiR em tecidos tumorais LS180 “Primer” depois de uma injecção IV de multi-drogas contendo poli (etileno-glicol) –

bloquear

-poli (

D, L-ácido láctico) (PEG –

b

-PLA micelas), sugerindo a existência de um conjunto de micelas poliméricas que possam permitir uma melhor delineação do tumor para utilização em oncologia cirúrgica [20]. Mais recentemente, o PEG-

b

micelas -PCL com paclitaxel (PTX), ciclopamina (CYP), e gossipol (SPG) com 30, 30, e 30 mg /kg, respectivamente (q7d × 3) entregue através IP, impedida a propagação metastática do cancro do ovário e extensa formação de ascites, o que resulta em sobrevivência prolongada em peritonealmente metastático ES-2-Luc (adenocarcinoma indiferenciado, subtipo agressivo) e SKOV-3-Luc (adenocarcinoma seroso, subtipo moderado grau) de xenotransplante murino modelos de câncer de ovário [21].

Nós propor uma estratégia de duas etapas da novela para nact, imageamento óptico segmentada por apoptose e orientação cirúrgica intra-operatório (Figura 1). No passo um, PEG-

b

micelas -PCL contendo PTX, CYP, e GSP são usados ​​para IP Nact e indução de apoptose em tecidos tumorais. Num segundo passo, a apoptose de direccionamento PEG-

b

-PCL micelas contendo dir pode acumular activamente em tecidos tumorais apoptose, permitindo imagens de fluorescência óptica de apoptose de um modo em tempo real (Figura 1). Dir moléculas, as sondas de fluorescência NIR emissores de luz na janela de comprimento de onda do infravermelho próximo, pode ser útil como um agente de imagiologia óptica de fluorescência, evitando forte autofluorescência da pele e do sangue e permitindo que os sinais detectáveis ​​para ser medido através de vários milímetros de tecidos [22]. Neste trabalho, nós mostramos que este em duas etapas estratégia de delimitação do tumor reforçada em imagens ópticas NIR fluorescência e forneceu orientação útil para a cirurgia debulking intervalo em um modelo de xenotransplante IP ES-2-luc-bearing de câncer de ovário, acoplamento de duas aplicações de micelas poliméricas na entrega de drogas e de imagem óptico para tratamento oncológico cirúrgico do câncer de ovário.

Materiais e Métodos

Preparação de PEG

b

-PCL micelas Carrying PTX, CYP e GSP

PEG-carregado com a droga

b

micelas -PCL foram preparados por um método de evaporação de solvente como descrito anterior [21]. Resumidamente, 4,0 mg de PTX, CYP, e GSP cada um e 120 mg de PEG-

b

-PCL (M

n de PEG = 5,000 g /mol, M

n de PCL = 10.000 g /mol, e M

W /m

N = 1,26) (Advanced Polymer Materials Inc., Montreal, Canadá) foram completamente dissolvidos em 1,0 ml de acetona seguindo-se a rápida adição de 1,0 mL de pré-aquecido 0,9% de solução salina a 60 ° C com mistura vigorosa. A acetona foi evaporada sob pressão reduzida a 60 ° C. A solução micelar aquosa foi centrifugada durante 5 min a 10.000 ×

g

e passada através de um filtro de seringa estéril de 0,2 um de celulose regenerada (RC) (Corning, Tewksbury, MA) para remover fármacos insolúveis. O teor de PTX, CYP, e em SPG PEG-

b

micelas -PCL foi quantificado por HPLC-fase sistema (RP-HPLC) reversa utilizando um sistema Shimadzu de HPLC proeminência (Himadzu, Japão) tal como previamente descrito [ ,,,0],21]. A separação de PTX, CYP, e SPG foi feito num modo isocrático com fase móvel de 55% acetonitrilo, 45% de água destilada, e 0,1% de ácido trif luoroacético. PTX, CYP, e SPG foram monitorizadas a 227, 204, e 373 nm, respectivamente, e eluiu a 2,7 min, 1,9 min e 10,6 min, respectivamente.

Preparações de apoptose de direccionamento PEG-

b

-PCL e metoxi-PEG

b

-PCL micelas Carrying DiR

Preparação de-segmentação apoptose PEG-

b

-PCL (GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-

b)

-PCL micelas transportando DiR foi iniciado com a conversão de grupos acetal na superfície de PEG-

b

micelas -PCL para grupos aldeído (Figura S1). Acetal-PEG-

b

-PCL (M

n de PEG = 5,000 g /mol, M

n de PCL = 5,000 g /mol, e M

w /M

n = 1,13) foi gentilmente cedido pelo Dr. Afsaneh Lavasanifar, Universidade de Alberta (Edmonton, Canadá). O método de conversão foi ligeiramente modificação da literatura [23]. Acetal-PEG-

b

-PCL copolímero foi dissolvido em acetona a uma concentração de 20 mg /mL. A água destilada foi depois adicionada rapidamente à solução de polímero com agitação vigorosa à temperatura ambiente seguido de evaporação da acetona sob pressão reduzida à temperatura ambiente. A solução micelar foi centrifugada durante 5 min a 10.000 ×

g

e passada através de um filtro de seringa estéril de 0,2 um RC. A conversão de grupos acetal em acetal-PEG-

b

micelas -PCL foi realizada a pH 2,0 por adição de 0,5 N de HCl. Após 4 h de agitação moderada à temperatura ambiente, a reacção foi neutralizada com 0,5 N de NaOH para parar a reacção. A solução micelar neutralizada foi depois dialisada contra água com uma membrana de diálise (MWCO 6000 g /mol) para remover o sal durante a noite e liofilizada durante 48 h para o uso futuro. amostra liofilizada foi dissolvida em CDCl

3 (6 mg /mL) para se estimar a taxa de conversão do acetal para o grupo aldeído na PEG-

b

-PCL por

1H RMN. péptido livre, GFNFRLKAGAKIRFGS (UW Biotechnology Center, Madison, WI) em Mw = 1.769 g /mol (Figura 2A), foi dissolvido em tampão HEPES (10 mM, pH 6,4) e misturou-se com o liofilizado PEG-aldeído

b micelas

-PCL para se obter 4 mg /mL de polímero e 0,35 mg /mL de concentração de péptido, a razão molar de 02:01 (aldeído-PEG

b

-PCL: GFNFRLKAGAKIRFGS). Após 2 h de agitação moderada, NaBH

3CN (10 equiv) foi adicionado à mistura para reduzir a base de Schiff. Após 4 dias, a solução micelar foi novamente dialisadas contra água com uma membrana de diálise (MWCO 6000 g /mol) durante a noite e, em seguida, GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-

b

solução micelar -PCL foi liofilizada durante 48 h. A eficiência da conjugação do péptido em aldeído-PEG

b

-PCL foi determinada por análise de RP-HPLC. Resumidamente, as amostras (10 ul) foram injectados numa coluna Zorbax 300SB-C18 (4,6 × 15 mm, 3,5 mm, Agilent) mantida a 40 ° C e o caudal foi de 0,8 mL /min. O gradiente de eluição foi realizada com a fase móvel de ácido trif luoroacético a 0,1% em água destilada e 0,1% de ácido trifluoroacético em 90/10 (v /v) de acetonitrilo /água destilada. A fase móvel foi programado como se segue: 0 min 85% de solvente A e 15% de solvente B; 35 min, 50% de solvente A e 50% de solvente B. péptido livre foi monitorizada a 215 nm e eluiu a 16 min. A quantidade de péptido conjugado em PEG-

b

micelas -PCL foi calculada subtraindo-se a quantidade de péptido livre a partir da quantidade de péptido inicialmente adicionado à reacção. Em paralelo, conjugado péptido liofilizado em PEG-

b

-PCL foi dissolvido em DMSO

d

6 (6 mg /mL) para calcular a taxa de conjugação de PEG-péptido em

b

-PCL por

1H NMR a 80 ° C.

Os resultados são apresentados como% moléculas FLI dir ligados em placas e% FLI de moléculas dir ligados no ovário ES-2-luc esferóides de tumor. BLI a partir de células ES-2-Luc e FLI a partir de moléculas DIR foram quantificados utilizando Xenogen IVIS 200 Series. (A) Ensaio de ligação competitiva de apoptose de direccionamento PEG-

b

-PCL micelas transportando dir (péptido de 1,0 uM e 500 nM dir) para PC- ou PS-revestidas placas de 96 poços (total de 200 uM de fosfolípido ). (B) Ensaio de ligação competitiva de apoptose segmentação-PEG-

b

-PCL micelas transportando dir para induzida por apoptose ES-2-luc esferóides do tumor dos ovários (** 0,01, *** 0,001) .

metoxi-PEG

b

-PCL e apoptose de metas de PEG-

b

micelas -PCL transportando DiR foram preparados por um método de evaporação de solventes: 4.0 mg de polímeros e 0,1 mg de dir (Invitrogen, Carlsbad, CA) foram dissolvidos em 1,0 mL de acetona, seguido de uma adição rápida de PBS (10 mM, pH 7,4) com mistura vigorosa. A acetona foi evaporada sob pressão reduzida à temperatura ambiente. A solução aquosa contendo micela DiR foi centrifugada durante 5 min a 10.000 ×

g

e passada através de um filtro de seringa estéril de 0,2 um RC para remover não incorporada DiR. O teor de DiR em micelas foi quantificada por RP-HPLC, como descrito anteriormente [20]. A eluição de DiR foi feito num modo de gradiente com uma fase móvel de 70% de água destilada e 0,07% de ácido trifluoroacético como solvente A e 30% de acetonitrilo e 0,03% de ácido trifluoroacético como solvente B. DiR foi monitorizada a 745 nm e eluiu aos 16 min.

Caracterização Física de metoxi-PEG-

b

-PCL e apoptose de metas de PEG-

b

-PCL micelas Carrying DiR

Z diâmetros -Média de metoxi-PEG-

b

micelas -PCL e de metas de apoptose PEG-

b

micelas -PCL transportando DiR foram determinadas por espalhamento dinâmico de luz (DLS) medições usando Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Reino Unido) a 25 ° C com um ângulo de detecção de 173 ° e um laser de iões de He-Ne (4 mW, λ = 633 nm) para o feixe incidente. funções de autocorrelação foram criados com base na análise cumulant, calculando o diâmetro hidrodinâmico de micelas a partir da equação de Stokes-Einstein eo índice de polidispersão (PDI). Antes das medições, as soluções micelares foram diluídas com PBS (10 mM, pH 7,4) para dar uma concentração de polímero a ~ 0,4 mg /ml, que representa a concentração de polímero acima da concentração crítica de micelas. DiR eficiência de carregamento foi mostrado como polímero de peso% dir /peso. O

in vitro

DiR cinética de liberação de metoxi-PEG-

b

-PCL e foi estudada a apoptose de metas de PEG-

b

micelas -PCL transportando DIR para estimar o tempo para liberação do fármaco a 50% (t

1/2) com base em um modelo de decaimento de uma fase utilizando GraphPad Prism versão 5.00 para Mac OS X (La Jolla, CA). micelas Dir-carregada, o que representa 100 ug /mL de Dir, foram adicionados em cassetes de diálise (MWCO 20000 g /mol), e cassetes foram colocados em 2,0 L de PBS (10 mM, pH 7,4) a 37 ° C com agitação moderada. As amostras (20 μΛ foram retiradas de cassetes em vários pontos de tempo, 0, 0,5, 1, 2, 3, 8, 12, e 24 h e depois de cada amostragem, cassetes foram reabastecido com 20 μΛ de PBS fresco (10 mM, pH 7,4 ). O conteúdo de DIR no micelas deixadas em cassetes foi analisada por RP-HPLC como descrito acima.

Avaliação de PS-ligação selectiva de apoptose de direccionamento PEG-

b

-PCL micelas transportando DiR

a ligação de apoptose de metas de PEG-

b

micelas -PCL transportando DIR para PS foi avaliada utilizando placas de fosfolipídios-revestido bem [24] e esferóides tumorais 3-D formados a partir de luciferase-expressando células ES-2-luc. PC ou PS solubilizados em etanol foi imobilizada em placas de 96 poços de fundo claro, com uma concentração de cerca de 200 pM em cada poço, e o etanol foi evaporado à temperatura ambiente durante a noite. Alguns dos PC ou PS-revestido poços foram incubados com 1,0 mM de péptido livre por 3 h para saturar PS em poços revestidos com fosfolipídios. a apoptose de metas de PEG-

b

micelas -PCL transportando dir, representando 1,0 M de peptídeos e 500 nM de dir, foram adicionados aos poços e incubados durante 1 h a temperatura ambiente no escuro. Cada poço foi lavado com PBS (10 mM, pH 7,4) e a apoptose de direccionamento PEG-

b

micelas transportando -PCL DiR ligada nos poços foi detectada por IVIS da Xenogen série 200 (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA) . ES-2-luc 3-D esferóides tumorais foram gerados por plaqueamento 5.000 ES-2-Luc células /poço em placas de 96 poços e incubadas durante 4 dias revestidos por agarose. ES-2 células de cancro do ovário humano foram transfectadas de forma estável com plasmídeo pGL4.51 que expressam luciferase contendo o gene de resistência à neomicina (Promega, Madison, WI) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) como previamente descrito [21]. ES-2-Luc células foram cultivadas em meio de McCoy 5A suplementado com 1% de L-glutamina, 10% de soro fetal bovino, 1% de penicilina /estreptomicina, e 750 ug /antibióticos ml de G418 e mantida a 37 ° C sob uma atmosfera de 5 % de CO

2 numa incubadora humidificada. PEG-

b

micelas contendo -PCL PTX, CYP, e SPG (3,3, 3,3, e 3,3 nM, respectivamente) foram adicionados a esferóides de tumor ES-2-Luc e incubadas durante 3 dias. Alguns dos esferóides tratados ES-2-luc foram incubadas 3 horas com 200 nM de péptido livre para saturar PS exposta sobre esferóides tumorais. A apoptose de direccionamento PEG-

b

-PCL micelas transportando DiR foram então adicionados a esferóides de tumor ES-2-Luc em uma concentração de péptido final de 200 nM e 100 nM Dir e incubadas durante 30 min a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora humidificada. Como um controlo, a intensidade de bioluminescência de células ES-2-luc foi também monitorizada para assegurar que Es-2-luc esferóides tumorais foram consistentemente formada em cada poço, usando IVIS da Xenogen série 200.

intraperitoneal humana do cancro do ovário de Xenoenxerto e micelas Tratamentos

fêmea 6-8 semanas de idade atímicos nu Foxnl

nu camundongos foram adquiridos de Harlan Laboratories (Madison, WI). Todos os experimentos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health (NIH). O uso ético e humano dos animais foi aconselhado pelo Comitê de Planejamento e Consultoria do All Campus Animal (ACAPAC) eo protocolo foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Universidade de Wisconsin-Madison (número de autorização: M02472) . A anestesia geral foi induzida com 1,5% de isoflurano /oxigênio e mantida com isoflurano a 1% /oxigénio. células ES-2-luc foram tripsinizadas, recolhidas a partir de culturas sub-confluentes, e 1 × 10

6 células /animal de ES-2-luc células foram injectadas na cavidade peritoneal de ratinhos anestesiados. injecção IP de PEG-

b

-PCL micelas transportando 30, 30, e 30 mg /kg de PTX, CYP, e SPG foi realizada 7 dias após a inoculação de células ES IP-2-luc após a observação de bioluminescência sinal em imagens de corpo inteiro de animais por Xenogen IVIS 200 Series. Um dia após a injeção IP de PEG-

b

micelas -PCL contendo PTX, CYP, e GSP, metoxi ou apoptose de metas de PEG-

b

micelas -PCL transportando 250 ug /kg, do DIR foi injectado através da veia da cauda de animais anestesiados. Os pesos corporais dos animais foram medidas por uma balança portátil, e a aparência geral e a mortalidade dos animais foi cuidadosamente monitorizada durante todos os conjuntos de experiências com animais. Todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento dos animais. Os animais foram sacrificados por dióxido de carbono de grau medicinal com a taxa de fluxo de 10-30% do volume da câmara eutanásia por minuto.

Ensaio TUNEL

xenoenxerto

ES-2-Luc-rolamento foi doseado através rota IP com PEG-

b

micelas -PCL transportando PTX, CYP, e GSP no dia 7 após a células ES-2-luc foram inoculadas na cavidade peritoneal. Em seguida, os animais (

N

= 4) foram sacrificados às 0, 12, 24, 48, e 72 h pós-tratamento de micelas. Tumor, baço, rim, fígado e os tecidos foram dissecados. fragmentação de ADN induzida por apoptose foi detectada em tecidos pelo método de dUTP mediada por TdT-Nick-End Rotulagem (TUNEL) utilizando um kit de ensaio de TUNEL deadend fluorométrico (Promega, Madison, WI). Os tecidos foram congelados seccionados em fatias de 10 uM, permeabilizadas através de proteinase K, e fixadas com formaldeído a 4%. A mistura reaccional consistindo de TdT e fluoresceína-dUTP marcada foi adicionada a secção fixa de tecidos e incubadas durante 1 h a 37 ° C numa câmara humidif içada no escuro. Os fragmentos de ADN marcado com fluoresceína e os núcleos de células couterstained por DAPI foram visualizados a 520 nm e 460 nm, respectivamente, utilizando um microscópio confocal (Olympus FV1000 FluoView, Minneapolis, MN). células em apoptose e núcleos das células foram mostrados em verde e azul, respectivamente.

bioluminescência e fluorescência Imagings

Xenogen IVIS série 200 foi utilizado para a imagem tanto bioluminescência e fluorescência a partir de objetos

in vitro

,

in vivo

, e

ex vivo

. Xenogen IVIS série 200 foi equipado com uma lâmpada de halogéneo de quartzo de 150 W e um laser de varredura de alimentação 1 mW. As imagens foram ecrã-exibido com a resolução espacial de 60 mm /pixel. imagens bioluminescência foram adquiridos por um dispositivo par cobrado (CCD) com os seguintes parâmetros: tempo de exposição = 1 s, binning = médio, e f /stop = 2.

In vitro

, D-luciferina (Vida Caliper ciência, Hopinton, MA) a 10 ug /poço foi adicionada a ES-2-Luc esferóides tumorais 5 min antes da imagem de bioluminescência, e

in vivo

, D-luciferina a 113 mg /kg foi injectado IP em ES-2-Luc-rolamento modelo de xenoenxerto de 5 min antes da imagem de bioluminescência todo o organismo. A dinâmica do crescimento do tumor ES-2-luc foi recolhido e apresentado como imagens codificadas por cores usando software Imagens ao vivo para a análise quantitativa e BLI de tumores ES-2-luc foi escalado pela contagem total.

As imagens de fluorescência foram também adquiriu por uma câmera carregada dispositivo par (CCD) com os seguintes parâmetros: tempo de exposição = 1 s, binning = médio, e f /stop = 2. um filtro de ajuste para a detecção DiR foi fixado em 745 nm para excitação e em 800 nm para a emissão. Todas as imagens codificadas por cores foram coletados por meio de software Imagens ao vivo para aquisição e análise de imagem. FLI, do DIR foi demonstrada pela eficiência radiante média, os fótons totais por segundo por centímetro quadrado por esterradiano na faixa de irradiância (microwatts por centímetro quadrado): [ps

-1cm

-2sr

-1] /[ ,,,0],mW cm

-2]. A fluorescência da DIR no tecidos tumorais foi determinada a partir da eficiência radiante média no ROI desenhada em torno tecidos tumorais predefinidos pelo imagem de bioluminescência de um animal idêntico.

bioluminescência e fluorescência de imagens de corpo inteiro foram registrados em 6, 12, 24 , e 48 horas após uma injecção IV de PEG-

b

micelas -PCL transportando dir. Os ratinhos foram colocados em posições abdominais para obter imagens de fluorescência de bioluminescência e um código de cores de corpo inteiro. Todas as configurações de equipamentos para bioluminescência e fluorescência imagings eram idênticos no experimento curso de tempo.

em tempo real de fluorescência Imaging Acquisition em Animais

Fluobeam 800 é um sistema de imagem de fluorescência de 2-D NIR composto por CCD câmera e uma fonte integrada NIR de luz (100 mW) com um comprimento de onda de excitação a 780 nm e um comprimento de onda de emissão a 820 nm. Este sistema previsto de 7,5 × 10 cm do campo iluminado homogêneo eo sistema manual, portátil, composto por câmera e laser foi localizado a cerca de 20 cm acima do objeto. imagens de fluorescência foram tela exibida com a resolução espacial de 110 mm /pixel e registrada como imagens em preto-e-branco estáticos (9 imagens /seg) ou vídeos em tempo real (25 imagens /seg).

Procedimento cirúrgico

os animais receberam uma injecção IP de D-luciferina (113 mg /kg) 5 min antes da imagem de bioluminescência de corpo inteiro no dia 9 após a injecção IV, ES-2-Luc inoculação das células (24 h de PEG-

b

micelas -PCL transportando dir). Depois de imagem de bioluminescência de corpo inteiro foi realizado, os animais foram sacrificados imediatamente. Todos os animais sacrificados foi submetido a uma laparotomia mediana e bioluminescência imagens de corpo inteiro de animais entalhadas foram obtidas novamente. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados em animais sacrificados e por um oncologista cirúrgico experiente em cirurgia murino. Num conjunto de experiências (

N

= 4), para comparação, a ressecção cirúrgica do tumor tradicional foi realizada ao abrigo da luz branca normal. Quando a ressecção do tumor cirúrgico foi considerado satisfatório, tecidos e carcaça de tumor-like dissecados foram digitalizados por Xenogen IVIS 200 Series para obter imagens bioluminescência. Em outro grupo de animais (

n

= 4), sistema de imagem NIR, o sistema de imagem NIR Fluobeam 800 foi ligado e a ressecção cirúrgica do tumor foi assistido por imagens de fluorescência em tempo real exibidas na tela. Quando a gripe tumor-like

+ tecidos foram excisadas tão completamente quanto possível, dissecados tecidos tumorais-like e as carcaças foram escaneados usando a Série Xenogen IVIS 200 para obter imagens bioluminescência e fluorescência. A duração da cirurgia foi gravado a partir do momento da incisão até à conclusão da citorredução do tumor. precisão cirúrgica foi avaliada através de dois cálculos: (1)% da soma dos BLU

+ tecidos tumorais semelhante à soma dos tecidos total do tumor-like excisadas durante todo o procedimento cirúrgico, e (2) as contagens totais de BLI de [ROI em meados -line incisão animais menos ROI em animais dissecados] sobre as de ROI em meados de linha de incisão animal. precisão cirúrgica também foi medida pelo cálculo de um índice de pós-ressecção cancro peritoneal (PCI), como descrito por Sugarbaker [3]. O PCI baseia-se na distribuição e tamanho das lesões no abdômen do animal. Neste estudo, o PCI foi adaptado aos tamanhos do tumor em ratinhos com as seguintes pontuações: O abdómen foi dividida em 13 regiões e o tamanho da lesão (LS) foi marcado (0 a 3) em cada região, como se segue: nenhum tumor visuais (LS = 0), 0 e 0,5 mm do tumor (LS = 1), 0,6 a 2,0 milímetros de tumor (LS = 2), e tumoral 2,0 milímetros (LS = 3). Pontuação total LS por animal foi somadas como uma pontuação numérica que pode ser variou de 0 (nenhum tumor observado) a 39 (13 áreas × 3).

Análise Estatística

A análise estatística foi feita usando one-way ANOVA com nível de significância de 5% combinado com testes de comparações múltiplas de Tukey por GraphPad Prism VER 5,00 para Mac OS X (La Jolla, CA).

Resultados

Caracterização de apoptose de metas de PEG –

b

-PCL micelas Carrying DiR

A Tabela 1 apresenta os tamanhos e eficiências de carga (peso% dir /polímero de peso) de de metas de apoptose PEG-

b

-PCL ( GFNFRLKAGAKIRFGS-PEG-

b

-PCL) e metoxi-PEG-

b

micelas -PCL alcançados após a formação de micelas Dir-constituídas por uma técnica de evaporação de solvente. A apoptose de metas de PEG-

b

micelas -PCL tinha um diâmetro z-média de 83 ± 2 nm (índice de polidispersidade, PDI 0,1) e metoxi-PEG-

b

micelas -PCL teve um Z-diâmetro médio de 45 ± 2 nm (PDI 0,1). A eficiência de carga de DiR para ambas as micelas foi de aproximadamente 2%. Peptide (GFNFRLKAGAKIRFGS) foi conjugado a PEG-

b

micelas -PCL com a proporção de conjugação molar a 30%

via

uma reação base de Schiff, com base nos resultados de ambos HPLC (quantificação subtrativo de não péptido -conjugated de péptido inicialmente adicionada para a reacção) e

RMN de 1H (quantificação de péptido conjugado) analisa (dados não mostrados). Em

análise de RMN de 1H, a razão de intensidade relativa do pico de protões benzílicos de fenilalanina na δ = 7,2 ppm em péptido para o pico de metileno protão de protões de PEG δ = 3,7 ppm determinou o nível de péptido em PEG-

b

-PCL. Os dados para a quantificação de péptido de HPLC e

1H RMN forneceu valores comparáveis.