Abstract

A alta morbidade e mortalidade de pacientes com esôfago (E) e câncer da junção gastro-esofágica (JGE), mandados de novos modelos pré-clínicos para o teste de drogas. A utilidade dos xenoenxertos do tumor primário (PTXGs) como modelos pré-clínicos foi avaliada. Clinicopatológicas, marcadores imuno-histoquímica (p53, p16, Ki-67, Her-2 /

neu Comprar e EGFR), e os perfis globais de abundância de mRNA foram avaliados para determinar vieses de seleção de amostras implantadas ou enxertadas, em comparação com a população subjacente . Nove primária E /Gej linhas de adenocarcinoma de xenotransplante foram ainda caracterizados para o espectro e estabilidade da expressão do gene /proteína sobre passagens. Sete linhas de xenotransplante de adenocarcinoma de esôfago primários foram tratados com quimioterapia individual ou combinação. Os tumores que foram implantados (n = 55) em ratinhos NOD /SCID tinha características sugestivas de biologia mais agressivos do que os tumores que nunca foram implantados (n = 32). Daqueles implantado, 21/55 enxertados; o enxerto foi associada com tumores pouco diferenciados (p = 0,04) e pacientes mais velhos (p = 0,01). Expressão de marcadores imuno-histoquímica foram semelhantes entre a amostra do paciente e xenoenxerto correspondente. diferenças de ARNm observados entre tumores de doentes e primeiros xenoenxertos de passagem eram, em grande parte, devido à perda de estroma humano em xenoenxertos. padrões de mRNA de início vs xenotransplantes passagem final e de pequena vs grandes tumores da mesma passagem foram semelhantes. resistência completa estava presente em 2/7 xenotransplantes enquanto os tumores restantes mostraram diferentes graus de sensibilidade, que permaneceu constante em passagens. Devido à sua capacidade de recapitular as características do tumor primário durante o enxerto e através de passagens em série, PTXGs pode ser sistemas clínicos úteis para avaliação da sensibilidade droga de E humano /cânceres Gej

Citation:. Dodbiba L, Teichman J, Fleet A , Thai H, Starmans MHW, Navab R, et al. (2015) adequação do uso modelos de xenotransplante paciente-derivado para farmacológico Avaliação de novas terapêuticas para o câncer de esôfago /gastro-esofágico Junction. PLoS ONE 10 (3): e0121872. doi: 10.1371 /journal.pone.0121872

Editor do Academic: Wayne A. Phillips, Peter MacCallum Cancer Centre, AUSTRÁLIA

Recebido: 13 Julho, 2014; Aceito: 17 de fevereiro de 2015; Publicação: 31 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Dodbiba et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos expressão de mRNA arquivos estão disponíveis no banco de dados GEO (número de acesso: GSE58870).

Financiamento: GL foi apoiado pelo Alan B. cadeira de Brown em Molecular Genomics, Família do fundo Posluns e Presidente CCO na Terapêutica Experimental e Estudos populacionais. Este estudo foi realizado com o apoio do Instituto Ontário de Câncer Research para PCB através de financiamento concedido pelo Governo de Ontário. LEA foi apoiada por um Instituto Ontário de Câncer Research Award New Investigator. PCB foi apoiado por uma concessão Instituto de Pesquisa Terry Fox New Investigator. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

nas últimas décadas, esôfago (e) e gastro-esofágico junção câncer (JGE) tem visto um aumento dramático na incidência nos países desenvolvidos, enquanto a sobrevivência de cinco anos permanece baixa em 19% [1]. Identificar métodos para selecionar drogas terapêuticas adequadas são, portanto, necessários. Tradicionalmente, os painéis de linhas de células foram usadas para testar rapidamente agentes anti-cancro [2,3]. Além disso, as injeções de linhas celulares em ratinhos imunocomprometidos são comuns

in vivo

modelos de eficácia da droga [4,5]. Embora as abordagens de linhas celulares têm contribuído grandemente para o desenvolvimento de drogas e biologia do câncer, são modelos imperfeitos para testes de drogas [6]. Além disso, três linhas celulares de cancro E /Gej amplamente usados ​​foram encontrados recentemente para ter sido contaminado por outras linhas de células no início da cultura [7]. Assim, idetifying modelos de testes de droga pré-clínicos apropriados deste tipo de câncer é um desafio.

xenoenxertos tumor primário (PTXGs) mostram a promessa como modelos pré-clínicos alternativos para teste de sensibilidade às drogas. PTXGs são criados através da implantação de um pedaço de tumor directamente a partir de um paciente em ratinhos imunocomprometidos e utilizando o xenoenxerto resultante para a experimentação. modelos de xenotransplante de tumor primário de pulmão [8], peito [9], cólon [10], cabeça e pescoço [11] e os cancros E /Gej [12] têm sido mostrados para recapitular a histologia do tumor e morfologia das células do paciente em diferentes graus. condições fisiológicas, como temperatura, níveis de oxigênio, teor de nutrientes

etc

. mais parecida com aquelas presentes em pacientes com câncer [6]. Além disso, PTXGs não tenham sido submetidos às pressões de seleção e alterações moleculares importantes envolvidos na criação de linha celular e crescimento a longo prazo [6], [13,14]. Assim, PTXGs pode ser mais propensos a prever respostas drogas do que linhas de células cultivadas tanto

in vitro

ou

in vivo

. No entanto, enquanto PTXGs foram mostrados para imitar a resposta do tumor ao tratamento inicial com bastante precisão [15-17], ainda que eles são expostos a forças de selecção relacionados com diferenças entre microambientes humano e do rato [18]. Assim, é importante para avaliar o grau em que PTXGs divergem dos tumores de pacientes primários no nível genômico e proteínas antes de iniciar estudos de drogas extensas. Modelo PTXG

Temos anteriormente descrito o desenvolvimento [12]. O próximo passo lógico é o objectivo principal do presente estudo: avaliar a utilidade e as limitações do uso de modelos PTXG para testes de drogas. Especificamente, para o que são E grau /GEJ tumores representante dos tumores dos pacientes, no âmbito da avaliação farmacológica? Nossas próprias experiências em vários tipos de câncer identificaram questões PTXG comuns, tais como: (i) falta de enxerto de muitos tumores; (Ii) morte inesperada do rato, conduz à necessidade de alterar e fazer experiências em diferentes passagens; (Iii) razões técnicas, tais como a necessidade de ampliar xenoenxertos em grandes grupos e congelar para baixo passagens anteriores para garantir a acessibilidade para futuros estudos, resultando em ter que usar passagens posteriores para experimentos com drogas; e (iv) uma incapacidade ocasional de identificar modelos específicos PTXG com as mesmas características moleculares observados em um paciente

Estas questões técnicas levantar quatro questões importantes relacionadas com o modelo, que pode ser declarado como hipóteses testáveis:. (a) modelos PTXG são representativos da população subjacente dos cancros gastro-esofágico (ou seja, avaliar viés enxerto), e se não totalmente representativa, somos capazes de descrever o que preconceitos estão presentes e como elas podem afetar conclusões; (B) modelos PTXG são úteis em geral, mesmo em passagens posteriores, como os seus padrões de expressão gênica /proteína permanecer estável; esta hipótese mede o grau de confusão por pressões de seleção durante passaging; (C) PTXGs pode recapitular o amplo espectro de características representante molecular de seus cânceres primários subjacentes; este aborda as preocupações de não encontrar a heterogeneidade inter-tumor necessário desenvolver abordagens de medicina personalizada para a terapia; e (d) PTXGs responder à terapia farmacológica de forma estável através de múltiplas passagens. Assim, avaliamos o potencial de E /JGE PTXGs para replicar o que é encontrado clinicamente em tumores E humano /Gej, e as condições em que estes PTXGs são apropriados para usar como modelos de teste de drogas pré-clínicos.

Materiais e Métodos

Informações do paciente clínico e patológico

Todos os pacientes foram recrutados através de consentimento por escrito. As informações do paciente, incluindo o tratamento e os resultados (

i

.

e

. sobrevida global) foi obtido através do sistema de fichas clínicas electrónicas na Rede Universitária de Saúde (UHN), Toronto, Canadá, por gastro oncologistas Intestinais. O Conselho UHN Ética em Pesquisa (REB #: 06-0982-CE). Aprovou o estudo

Animais e Tissue Processing

Non-Obese Diabetic-Severe Combined Imune Deficiência (/SCID NOD) ratinhos foram criados internamente na instalação (OCI) animal Care Ontario Cancer Institute. Todos os animais foram mantidos em um ambiente patógeno livre em um /ciclo 12hr-noite padrão 12hr-dia e foram alimentados com uma dieta padrão esterilizado sedimento e água

ad libitum

. Os animais foram sacrificados utilizando dióxido de carbono, seguido por deslocação cervical. Todos os procedimentos foram aprovados pelas diretrizes éticas do Comitê Animal Care da OCI (protocolo de animais #: 1293,16).

tecidos de cancro humano E /Gej foram obtidas de pacientes submetidos à ressecção cirúrgica na UHN, Toronto, Ontário e foram processados como previamente descrito [12]. Em resumo, o tecido fresco foi armazenado em meio RPMI 1640 (sem FBS adicionado) até que foi cortado em pedaços de dimensões aproximadamente 5 mm e implantadas subcutaneamente no flanco de ratinhos NOD /SCID (dentro de 24 horas após a ressecção; no entanto, tecidos de cancro foram colocados em meios de cultura de tecidos dentro de uma mediana de 45 minutos após a ressecção, e mantida em meio até à implantação). Duas peças representativas foram salvos na Optimal Corte Temperatura composto (OCT) (congeladas a -80 ° C para o trabalho molecular) e formalina parafina fixo incorporado blocos (FFPE) para análise molecular e patológica, respectivamente.

Tratamento

coortes de 10 camundongos implantados por braço de tratamento foram monitorados durante o crescimento do tumor. Uma vez visível, os tumores foram medidos com paquímetro de métricas (Scienceware, gato: 134160001) duas vezes por semana. Os ratinhos foram sacrificados quando os tumores atingiram 15-20 mm na dimensão mais longa, considerado um ponto final humano pelo Comité de Cuidados Animais. Uma vez que os tumores atingiram cerca de 300-750 mm

3, os ratos foram randomizados em controle e quimioterapia braços. Para as experiências de tratamento individuais, coortes de rato foram injectados uma vez por via intraperitoneal com 6 mg /kg de cisplatina (1 mg /mL, a Hospira, DIN: 02126613), 9 mg /kg de paclitaxel (2 mg /mL, a Hospira, DIN: 02296624) ou 100 mg /kg de 5-fluorouracilo (15 mg /mL, a Hospira, DIN: 021827420), enquanto o grupo de controlo foi injectado com soro fisiológico. Para as experiências de tratamento combinado, o grupo de quimioterapia foi tratada uma vez com 5,4 mg /kg de cisplatina (1 mg /mL, a Hospira, DIN: 02126613) e 9 mg /kg de paclitaxel (2 mg /mL, a Hospira, DIN: 02296624), com base em rato experiências de toxicidade. Os ratinhos foram sacrificados 24 horas após o tratamento inicial (rotulado como tumores pequenos) e no final da experiência (tumores grandes). A mediana de dois ratos (1-3) por braço foram sacrificados para comparações. Os tumores foram colhidos e guardados em blocos do PTU e FFPE para a caracterização molecular /patológico.

A imuno-histoquímica de marcadores moleculares

Nós avaliamos um painel de marcadores moleculares por imuno-histoquímica (IHQ) para estudar a sua estabilidade dentro de cada xenotransplante. Os marcadores foram escolhidos com base em sua importância para câncer de E /JGE. secções de tecido FFPE foram coradas com anticorpos contra p53 (clone DO-7, Vector Laboratories, Burlington, Canadá, diluição: 1: 250), p16

INK4a (laboratórios mtm AG, Heidelberg, Alemanha; não- diluído), Ki- 67 (clone SP6, NeoMarkers, Rockford, EUA, diluição: 1: 500), EGFR (clone 31G7, Zymed, San Francisco, EUA, diluição: 1: 100), HER-2 /

neu

(clone A0485, Dako, Burlington, Canadá, diluição: 1: 25), HIF-1α (clone 54, BD Biosciences, Franklin Lakes, EUA, diluição: 1: 50) e CD31 (clone PECAM1, Santa Cruz, EUA, diluição: 1 : 1000). Um índice de coloração foi utilizada para avaliar CD31 e HIF-1α expressão usando Aperio ImageScope espectador. Todos os outros marcadores moleculares foram avaliados por uma equipe cego de patologistas. Utilizou-se uma combinação de uma pontuação proporção e uma pontuação de intensidade. A pontuação proporção (proporção de células tumorais positivas) foi: 0: Nenhum, 1: 1-24%, 2: 25-49%, 3: 50-74, 4: ≥75%. A pontuação intensidade (intensidade da coloração por células tumorais) foi: 0: nenhum, 1: fraco, 2: moderado, 3: forte. A pontuação total foi obtida combinando ambos os escores. Resumidamente, p53 e p16 foram considerados positivos se a coloração apareceu enquanto o Ki-67 foi avaliada com base na percentagem de células tumorais positivas. expressão de EGFR membrana determinada EGFR-positivo. Her-2 /

neu

pontuação padrão foi utilizada; As amostras foram consideradas como tendo expressão similar se eles diferiam em menos de uma pontuação de intensidade da coloração (por exemplo. 2+ vs 3+). Dois testes t lados foram utilizados para avaliar diferenças na expressão para esses parâmetros.

RNA Extração

RNA foi extraído de xenotransplante de outubro incorporado e tecidos humanos (dez x 10 ^ m fatias grossas criost�icas) usando RNeasy mini-kits (Qiagen, 74104). integridade do RNA foi avaliada usando o Agilent-2100-Bioanalyzer eo RNA Nano-6000-kit (Agilent Technologies, 5067-1511) e quantificadas usando um Nanodrop-ND-1000 Espectrofotômetro (Thermo-Scientific). número de integridade do RNA (NIR) de 7 + 8 + ou eram como pontos de corte de qualidade para pacientes e amostras PTXG, respectivamente.

Rotulagem e Hibridização

As amostras foram rotuladas de acordo com o GeneChip WT Terminal Labeling e hibridação Manual, hibridizado com Gene-1.1-ST Humano matrizes (Affymetrix) e digitalizada com o GeneChip Scanner 3000-7G (Affymetrix). Todas as matrizes de critérios de controle de qualidade passados ​​(software Console Expression, Affymetrix).

Análise Estatística

Para a análise quimio-sensibilidade, o atraso no tempo para um tumor dobrar de volume foi comparado entre as linhas tratados e sua correspondentes controlos não tratados. atrasos foram determinadas através da representação gráfica dos volumes tumorais em uma escala logarítmica y e desenhar uma linha horizontal no volume de duplicação que interceptado as curvas de crescimento de controle e tratamento. O atraso de tempo foi determinado como a diferença no tempo entre os dois intercepta e foi referido como o atraso de tempo de duplicação. O atraso médio tempo de duplicação para resistentes vs. linhas sensíveis foi calculada através da partilha de todos os ratos de controle e comparando-os com os valores combinados de ratinhos tratados.

análises estatísticas adicionais foram realizados em fatores clínico-patológicas para determinar viés na amostra estudada e determinar fatores associados ao enxerto. Dois lados t-testes foram aplicados em todos os casos. Os resultados foram considerados significativos quando

p

-valor 0,05. As análises estatísticas foram realizadas utilizando SAS.v.9.2 (Cary, NC).

Gene Analysis Profiling

Ambos tumorais paciente primário e amostras de xenotransplante pareados foram utilizados para análises transcriptoma (no total, 51 amostras foram analisados ​​para a abundância de ARNm). Vinte e um tumores de adenocarcinoma foram perfilado (12 enxertada /9 não-enxertada). Durante oito adenocarcinomas primários enxertadas, uma passagem uma amostra (P1) xenoenxerto foi perfilado. Além disso, a análise foi realizada em 21 xenoenxertos posteriores passagem (P3 através P12), dos quais nove eram de tumores pequenos (no início da curva de crescimento) e 12 eram de tumores grandes.

Foram avaliadas diferenças nos perfis de mRNA entre (a) tumores de pacientes que enxertados

vs

aqueles que não o fez, (b) xenotransplantes P1

vs

P0 (primário) tumores, (c) posteriores xenoenxertos de passagem

vs

P1, e (d) grande

vs

pequenos tumores de xenoenxerto dentro da mesma passagem. Para cada comparação, um modelo linear gene-wise estava apto para comparar as duas condições, ajustado para o lote de matriz e, quando apropriado, para a passagem. A correção de taxa de falso-descoberta foi realizada para explicar os testes múltiplos [19].

Todas as análises foram realizadas utilizando-R (v2.15.3). A rede pacotes (v0.20-15) e latticeExtra (v0.6-24) foram utilizados para a representação gráfica. Pré-processamento de dados foi realizada utilizando o algoritmo de RMA [20] (pacote Affymetrix, v1.36.0) combinado com anotações atualizadas de sondas (pacote hugene11stv1hsentrezgcdf, v15.0.0) [21]. Um filtro de expressão foi usado para remover o ruído experimental. Um limiar de baixa intensidade foi definida com base nas intensidades de genes cromossoma-Y uma das cinco amostras de pacientes do sexo feminino, como descrito anteriormente [22]. Sondas com uma média logarítmica valor da expressão

2-transformado abaixo cinco foram removidos. No total, ~ 15.500 sondas foram retidos.

A análise foi realizada com potência a função power.t.test (v.2.15.3 pacote estatísticas) para estimar a probabilidade de que diferenças nos níveis de expressão podem ser identificadas entre grupos. Uma vez que os dados de expressão era no registo

2-espaço, uma diferença na expressão média foi equivalente ao log

2-transformado dobra-mudança. O número de observações por grupo foi definido para 10 e o nível de significância foi de 0,05 /15.500 = 3×10

-6 (

i

.

e

., Bonferroni corrigidos). Power foi calculado para uma gama de dobra-muda (