Abstract
Fundo
Twist2 foi mostrado para promover a invasão do tumor humano como no cancro da mama e câncer cervical. No entanto, se Twist2 promove a progressão do câncer de ovário humano continua a ser elucidado. Aqui, nós investigamos o papel de Twist2 na invasão de cancro do ovário e metástases, bem como os mecanismos moleculares subjacentes.
Métodos
Twist2 expressão foi detectada por imuno-histoquímica (IHQ) em tissue microarray de ovário humano cancros com procedimento de pontuação de acordo com a intensidade de coloração e padrão. gene Twist2 foi introduzido de forma estável no SKOV 3 células de cancro do ovário para examinar as alterações da morfologia celular, motilidade, invasão e EMT marcadores moleculares.
Resultados
Twist2 expressão é significativamente aumentada em cancros do ovário juntamente com o estádio da doença FIGO, indicando que Twist2 pode ser associado com a metástase do cancro do ovário. A sobre-expressão de Twist2 induziu o fenótipo EMT incluindo a regulação negativa da E-caderina, e supra-regulação de N-caderina e β-catenina em células de cancro humano do ovário, o que sugere que Twist2 pode promover a libertação β-catenina do complexo E-caderina /β-catenina através inibição da E-caderina. Assim, a degradação β-catenina foi inibida devido à inibição da APC, e a via /β-catenina Wnt foi, em seguida, activado pela acumulação β-catenina nuclear, que podem activar a transcrição de genes alvo a jusante para promover a invasão pelo tumor e metástases. Colectivamente, estes dados indicam que a β-catenina está envolvido na EMT-induzida Twist2 no câncer de ovário.
Conclusão
Nossos dados indicam que a regulação positiva de Twist2 está correlacionada com o estágio FIGO em cancros do ovário humanos . Neste relatório, nós demonstramos que nuclear β-catenina é acumulado nas células EMT para facilita a invasão de câncer de ovário e metástase Twist2 induzida
Citation:. Mao Y, Xu J, Li Z, Zhang N, Yin H, Liu Z (2013) o papel da β-catenina Nuclear Acumulação na Twist2 Induzida Ovarian Cancer EMT. PLoS ONE 8 (11): e78200. doi: 10.1371 /journal.pone.0078200
editor: Mechthild Hatzfeld, Martin-Luther-University Halle, Alemanha |
Recebido: 15 Janeiro, 2013; Aceito: 10 de setembro de 2013; Publicação: 11 de novembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Mao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela National Science Foundation Natural da China (https://www.nsfc.gov.cn, No. 30.872.515, YB Mao) e os Fundos investigação fundamental para as universidades Central da China (n.º 2011121062, YB Mao), e da Fundação de Ciência Natural da Província de Fujian da China (No. 2012J01417, YB Mao). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Apesar do recente avanço na compreensão do desenvolvimento de cancro do ovário e progressão, câncer de ovário permanece tem a maior taxa de mortalidade associada de malignidade ginecológica em países ocidentais principalmente devido ao estágio avançado da doença ao diagnóstico (fases III-IV) . A grande maioria das mulheres são diagnosticadas com carcinomatose intraperitoneal disseminada [1], [2]. Estudos recentes sugerem que o epitelial para mesenquimal (EMT) desempenha um papel fundamental na progressão de carcinomas do ovário [3], [4]. EMT é definida por um programa molecular e celular complexa, através da qual as células epiteliais perder as suas características diferenciadas, tais como a adesão célula-célula, a polaridade apical-basal, falta de motilidade celular e ganho de características mesenquimais incluindo a motilidade, capacidade de invasão e aumento da resistência à apoptose [5 ]. As redes de remodelação celular e sinalização semelhantes parecem ser ativo durante a metástase do câncer [6], [7]. Tem sido sugerido que a AOE primária pode ser submetido a um processo de EMT durante a invasão local no peritoneu e reter características mesenquimais em tumores mais avançados.
Os factores de transcrição da família da torção (TWIST1, Twist2), família caracol (SNAI1 /caracol , SNAI2 /lesma), bem como a família ZEB (ZEB1, ZEB2), controlar o processo de EMT no cancro [5], [8], [9]. Twist2 foi mostrado para promover a progressão tumoral através de EMT no cancro da mama [10]. Twist2 é um potencial marcador de prognóstico para o câncer cervical [11], carcinoma adenóide cístico [12], e carcinoma de células escamosas de língua [13]. Twist2 também está correlacionada com a classe pobre diferenciação e sobrevivência curta na cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas [14]. No entanto, se Twist2 promove a progressão do câncer de ovário humano continua a ser mal compreendida. Aqui, nós investigamos o papel de Twist2 na progressão do cancro do ovário e os mecanismos moleculares subjacentes potenciais a invasão de câncer induzido Twist2 e metástase. Mostrámos Twist2 é altamente expresso em tecidos de cancro do ovário. A expressão ectópica de Twist2 em células de cancro do ovário confere um fenótipo de EMT. Além disso, a ativação β-catenina podem participar nestas propriedades EMT induzidas Twist2.
Resultados
1. A expressão aumentada Twist2 foi correlacionada com a fase do cancro do ovário na FIGO primária
IHC as análises indicaram a presença de níveis elevados de Twist2 em células de cancro de tumores ovarianos primários sobre a matriz de tecido (Figura 1). Twist2 expressão foi significativamente aumentada no cancro do ovário (70,24%, 59 em 84 casos) em relação ao tecido normal do ovário (P 0,05, Figura 1, Tabela 1). A coloração positiva de Twist2 foi detectada tanto no núcleo e no citoplasma.
As secções de tecido de carcinomas do ovário e ovários normais foram analisados por coloração IHC com um anticorpo monoclonal específico contra Twist2 humano. A coloração positiva de Twist2 foi mostrado na cor marrom. As secções foram contra-coradas com hemotoxilina para mostrar núcleos. Imagens representativas de coloração Twist2 em carcinomas ovarianos ovário e epiteliais normais emparelhados são mostrados. Nenhuma expressão de Twist2 poderia sido visto em adultos tecidos ovário normal, enquanto expressões positivas de Twist2 foram localizadas principalmente no citoplasma ou no núcleo do adenocarcinoma seroso e as células do tumor dos ovários de adenocarcinoma mucinoso. Magnitude × 200, 400 ×.
De acordo com a classificação do tipo histológico, forte expressão de Twist2 foi encontrada em 19 de 69 carcinomas serosos (27,54%), 1 de 8 carcinomas mucinosos (12,5% ), nenhum dos 4 carcinomas endometriod (0%), e 2 de 5 carcinomas de células claras (40%). Não houve diferença significativa pode ser detectada no tumor diferente tipo histológico (P 0,05). A expressão de Twist2 foi aumentada juntamente com a fase Figo (P 0,05), como exemplificado a seguir: 22,73% na fase I (10 em 44 casos), enquanto 53,85% no estágio IV (7 em 13 casos). Em geral, na fase I, 31,82% (14/44) dos casos apresentaram expressão negativa Twist2, 45,45% (20/44) dos casos mostrou fraca expressão, e 22,73% (10/44) dos casos exibido forte expressão; na fase II, Twist2 negativa de 7,69% (1/13); fraca expressão: 61,54% (8/13), e forte positivo: 30,77% (4/13); na fase III, Twist2 expressão negativa: 57,14% (8/14), fraca expressão: 35,71% (5/14), e expressão forte: 7,14% (1/14); na fase IV, expressão negativa: 15,38% (2/13), fraca expressão: 30,77% (4/13), expressão forte:. 53,85% (7/13)
Estes dados demonstram que a proteína Twist2 é significativamente aumentada em tecidos de cancro do ovário e do elevado nível de Twist2 foi correlacionada com a fase da doença FIGO, sugerindo que Twist2 pode ser usado como um indicador de alto grau de malignidade e mau prognóstico no cancro do ovário humanos. Entretanto, não há correlação entre a expressão Twist2 e o tipo histológico do tumor.
2. Twist2 morfologia celular expressão afetada, mas não a proliferação celular de células SKOV-3
in vitro
Para verificar se Twist2 é um mediador crucial de câncer de ovário, progressão, nós estabelecemos linhas de células que sobreexpressam estavelmente Twist2 (Fig. 2A). Em seguida, analisamos /SKOV-3 células Twist2 e suas células parentais através da observação morfológica celular, citometria de fluxo (FCM), e ensaio de MTT.
A. A expressão ectópica da Bandeira-taggedTwist2 em SKOV-3 (Twist2 /SKOV-3) as células de cancro do ovário foram verificadas por transferência de Western. células Twist2 /SKOV-3 expressa tanto Twist2 e bandeira-tag em comparação com células de controlo de vector. B. Twist2 coloração foi observada usando microscopia confocal de varrimento laser (Olympus) nas células SKOV-3. Os núcleos foram contrastadas com DAPI (em azul). coloração de imunofluorescência de Twist2 em células Twist2 /SKOV-3 mostrando células com Twist2 (em verde) nos núcleos celulares em comparação com o controle vetorial células SKOV-3. As células foram a partir das amostras transfectadas de forma estável. formas morfológicas C. celulares foram observadas utilizando microscopia de fase (Olympus). Twist2 /SKOV-3 células tomou a forma morfológica de fibroblastos-like, enquanto as células de controle do vetor /SKOV-3 apareceu a forma da célula epitelial.
Na primeira caracterização destas células, observou-se uma nítida alterações morfológicas nas células que sobre-expressam Twist2 (Fig. 2B). As células SKOV-3 que expressam Twist2 sofreu uma mudança fenotípica e aparecem forma morfológica mesenquimais do tipo fibroblastos, enquanto as células SKOV-3 de controlo (vector /SKOV-3) aparece a forma morfológica de células epiteliais plana (Fig. 2B). a coloração imuno-fluorescente mostrou que Twist2 está localizada nos núcleos, o que foi consistente com o facto de Twist2 é um factor de transcrição (Fig. 2C).
, em seguida, avaliada a proliferação de células SKOV-3 expressando Twist2through análises de a distribuição do ciclo celular e taxa de crescimento celular. Os resultados mostraram nenhum efeito óbvio da expressão Twist2 sobre a proliferação celular (Fig. 3A, 3B). Como Akt e ERK1 /2 são indicadores importantes envolvidos na proliferação celular, as expressões destas proteínas e a sua fosforilação foram examinados por análise de mancha de Western. Consistentemente, nós não detectar mudanças na Akt, ERK1 /2, e as suas formas de fosforilação em células Twist2 /SKOV-3 realtive para as células de controle do vetor /SKOV-3 (Fig. 3C).
A. A citometria de fluxo análise não mostrou diferença da distribuição do ciclo celular entre as células cancerosas SKOV-3 com ou sem a expressão ectópica Twist2. B. A taxa de proliferação das células transfectadas foi detectada e comparada com a do controlo de vector através da contagem de células viáveis utilizando a coloração de tripano azul. Os ensaios foram realizados em triplicado, em cada grupo de células. Os dados foram expressos como média ± SD. Sem influência de óbvio Twist2 foi observada na velocidade de crescimento celular. C. Expressão da Akt, ERK1 /2, e as suas formas phosphoralation indicado Twist2 não teve efeitos sobre a proliferação por Western Blot. Comparado com /SKOV-3 células do vetor, sem mudanças óbvias de Akt, ERK1 /2, e as suas formas de fosforilação foram encontrados em células Twist2 /SKOV-3.
3. Twist2 expressão aumentada de Migração e Invasão de SKOV-3 do cancro do ovário células
Twist2 tem se mostrado um importante indutor da EMT na mama e câncer cervical. processo EMT promove células epiteliais apareça forma de fibroblastos, caracterizada pelo aumento da motilidade e invasividade [15]. Para determinar se as células Twist2 /SKOV-3 foram adquiridos a maior capacidade para migrar, foi realizada uma ferida ensaio em que a motilidade de células localizadas na borda da ferida foi avaliada com base na sua capacidade de colonizar a área ferida cura. Na presença de soro (FBS a 10%), reparação de feridas mais rápida foi observada nos /SKOV-3 de células do que o grupo Twist2 células de controlo às 24 h (Fig. 4a). Como não houve um aumento na proliferação induzida por Twist2 (Fig. 3C), os /as células SKOV-3 Twist2 pode ter o maior potencial de migração de células
In vitro
no ensaio de “a cicatrização de feridas” (Fig. 4A, 4B ). Estes resultados foram confirmados por um ensaio de câmara de Transwell contendo uma camada de matriz extracelular (matrigel). Tal como mostrado na Figura 4C, o número de /SKOV-3 Twist2 células migraram através dos poros é mais do que as células de controlo fizeram.
. In vitro ferida ensaio de SKOV-3 células cancerosas cura com ou sem expressão ectópica Twist2. Imagens representativas de células em locais de “cura”, aos 12 e 24 horas após a raspagem são mostrados aumento da migração celular em células Twist2 /SKOV-3. B. O analisaram os resultados de migração pelo teste ANNOVA uma maneira (software Graphpad Prism5). A P-valor de 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. As células que expressam Twist2-SKOV-3 migrou mais rapidamente do que as células de controlo transfectadas com vector. C. In vitro matrigel ensaio de invasão de SKOV-3 células com ou sem expressão ectópica de Twist2. Quantificação indicaram que as células Twist2 expressam são 8-9 dobras mais invasivo do que as células de controlo de vector no ensaio in vitro de invasão em matrigel. *,
p
. 0,005
4. Nuclear β-catenina foi acumulado em células de carcinoma de ovário quando Twist2 EMT induzida fenótipo
Quando Twist2 sobre-expressa nas células de cancro do ovário, a morfologia células cancerosas foi transformada em forma de fibroblastos-like, juntamente com o aumento da motilidade e invasão, enquanto nenhuma alteração foi encontrada na proliferação celular. Nossos dados indicam que a expressão forçada de Twist2 pode empurrar essas EOCs se submeter a uma transição epitelial-mesenquimal.
EMT geralmente envolve o rompimento de junções apertadas, adherens junções, que contribuem para a separação em células individuais [16], [17]. Para continuar a determinar se a expressão de Twist2 fato promove EMT nestas células de cancro do ovário, examinamos a expressão de E-caderina e N-caderina, dois epitelial bem estabelecida para os tomadores mesenquimais, em Twist2 expressando eo transfectados com vector SKOV-3 células. Nós descobrimos que a expressão de E-caderina (fabricante epitelial) foi notavelmente reduzido em células em relação às células de controlo Twist2-expressar, mas a expressão de N-caderina (fabricante mesenquimais) aumentou nas células que expressam Twist2 por PCR em tempo real ( A Fig. 5A, 5B). Nós confirmamos ainda mais os resultados de E-caderina, N-caderina por Western Blot (Fig. 5C) expressão.
Resultados A e B. PCR em tempo real de Twist2, E-caderina, N-caderina, e APC ARNm que expressa níveis nas células que expressam Twist2 e as células de controlo transfectadas com vector (* P 0,05, ** P 0,01, *** p 0,001). resultados C. Western Blot de Twist2, E-caderina, N-caderina, expressão β-catenina nos Twist2 /SKOV-3 células em comparação com as células de controle do vetor /SKOV-3. D. Distribuição de β-catenina no citoplasma e núcleo detectada pelo método de fraccionamento de células. SKOV-3 células cancerosas P-parental, as células de controlo V-vector-transfectadas, T-Twist2-expressando células SKOV-3.
Como Twist2 células /SKOV-3 exibidas as alterações morfológicas (Fig. 2B), aumentado o potencial de migração (Fig. 4), e marcadores de EMT expressão, concluiu-se que a expressão ectópica de Twist2 promove um fenótipo de EMT em células epiteliais de carcinoma de ovário.
é bem reconhecido que o β-catenina complexo -E-caderina constitui o núcleo estrutural dos contactos aderentes, e impede a transferência de β-catenina para o núcleo e sua actividade de transcrição [18]. β-catenina foi também sobre-regulada em células que expressam Twist2 em relação às células de controlo com diminuição da E-caderina (Fig. 5C). Figura 5D apresentaram distribuição β-catenina pelo método de fracionamento celular. β-catenina nuclear aumentada em células Twist2 /SKOV-3. Além disso, a APC ARNm diminuída (Fig. 5B).
5. TOPflash transcricional análise da 293FT células
A fim de detectar o efeito de translocação nuclear induzida Twist2 de β-catenina na expressão do gene, nós verificados genes alvo a jusante, como c-Myc, ciclina D1 na via de sinalização Wnt . Ambos c-myc e Ciclina D1 foram aumentados com Twist2 superexpressão (Figura 6). Em seguida, mediram a atividade transcricional TCF /LEF-dependente usando TOP /FOP plasmídeos repórter de flash. Depois de genes repórter foram introduzidos 293FT células durante 48 h, a actividade de transcrição foi avaliada pela luciferase e a actividade de Renilla. 293FT células mostraram significativamente elevadas LEF TCF transcrição /dependente com a co-transfecção Twist2 (em relação ao controlo de vector; N = 3; P 0,001; Figura 7).
como c-myc e Ciclina D1 são na maior parte consideradas como alvo genes Wnt, examinámos ainda as suas expressões por western blot repetido por três vezes. A análise de imunotransferência que mostra que tanto c-Myc e ciclina D1 aumentado no grupo Twist2 /SKOV-3, em comparação com o grupo do vetor /SKOV-3 na figura representativa.
A fim de medir TCF4 /actividade de transcrição LEF1-dependente de 293FT linhas de células, as células foram transfectadas com TOP /FOP plasmídeos repórter de flash. Depois de genes transfecção durante 48 h, a actividade de transcrição foi medida usando duplo de Luciferase Reporter Assay System. As células em grupos de flash FOP apresentaram níveis negligenciáveis de actividade de transcrição. Em contraste, as células em grupos TOPflash co-transfectadas com Twist2 mostrou aumento significativo do sinal. Os resultados são a DP ± média de três experiências (n = 3; P 0,001).
tomar em conjunto, estes dados demonstram que a sobre-expressão em Twist2 células SKOV-3 perturba aderentes contactos célula-célula e promove a migração de células. Com a diminuição da E-caderina, β-catenina libertado do complexo E-caderina /catenina β-. Enquanto isso, a degradação β-catenina reduziu ainda mais acompanhada pela diminuição da APC, o que resultou na acumulação de β-catenina livre no citoplasma e causou transferência β-catenina para o núcleo para aumentar a sua actividade de transcrição. Estes dados indicam que a energia nuclear β-catenina estava envolvido na EMT-induzida Twist2 de câncer de ovário.
Discussão
O câncer de ovário é uma doença altamente metastático e a identificação de moléculas e /ou vias de sinalização envolvidos na invasão e metástase do cancro é muito importante para que a detecção na fase inicial ainda é uma barreira [4]. células de cancro do ovário são propensos a metástase por toda a cavidade peritoneal, principalmente por disseminação intra-abdominal e pela disseminação linfática. A metástase é um processo complexo que envolve mudanças na matriz e célula-célula junções extracelulares. Epitelial-a-mesenquimal de transição (EMT) é um passo necessário para a progressão do tumor metastático durante desprendimento de células tumorais do local do tumor primário e apego aos sítios metastáticos. Poucos estudos examinaram os fatores que promovem EMT de câncer epitelial de ovário (EOC) células [4], [19].
Vários reguladores de indução de EMT reprimir E-caderina transcrição,
via
interação com o e-caixas específicas do promotor de E-caderina proximal [20]. Mais relevantes são o caracol (SNAI1 e SLUG) [21], [22], ZEB (ZEB1 e ZEB2) [23] e helixloop-hélice básico (bHLH) (TWIST1 [24]) famílias de fatores de transcrição. Só recentemente, a evidência convincente mostrou que Twist2 superexpressão foi significativamente associada ao câncer cervical progressão [25], [26]. Twist2 ativa programas EMT e promove um fenótipo de células-tronco cancerígenas no câncer de mama [10]. No entanto, a função biológica do Twist2 no tumor permaneceu praticamente desconhecido.
Neste estudo, nós fornecemos a primeira evidência de que a expressão Twist2 está associada a fase de alta FIGO no câncer de ovário. Pode-se esperar que Twist2 desempenha funções semelhantes EMT no câncer de ovário. Para este fim, introduziu
twist2
para a linha celular do cancro do ovário SKOV-3 e células examinados comportamentos biológicos, incluindo a proliferação, migração e invasão. Verificou-se que a sobre-expressão de Twist2 não teve nenhum efeito sobre o crescimento celular e Akt, ERK1 /2 activação. Interessante, as células Twist2 /SKOV-3 aumentou a migração e a invasão de células de cancro do ovário, tal como avaliado por ensaio de feridas-zero e ensaio de invasão. Como resulta EMT na motilidade celular melhorada e invasão, verificamos ainda mais os marcadores EMT. Um interruptor de E-caderina para N-caderina é também uma característica chave de EMT em cancro do ovário [4]. A sobre-expressão de Twist2 diminuiu significativamente a E-caderina e aumento da expressão de N-caderina em ambos os níveis de mRNA e proteína, respectivamente.
E-caderina é uma glicoproteína transmembranar do tipo I caderina superfamília. A sua parte citoplásmica está ligada ao citoesqueleto de actina via as cateninas [27]. Canónica de sinalização /β-catenina Wnt tem um impacto importante na progressão do cancro durante EMT [28], [29]. sinais de Wnt inibir a actividade de quinase GSK3β para parar a degradação e forçar um aumento rápido nos níveis de livre, citosólica β-catenina, e muito pouco tempo depois, transloca-se para o núcleo onde se liga a factores TCF /Lef transcrição [30], [31] . Uma redução nos níveis da E-caderina lança frequentemente β-catenina de junção adheren, resultando na acumulação de β-catenina nuclear, e o consequente transactivação de um painel de genes alvo, entre os quais aqueles que especificam os diversos factores de indução de EMT [18], [28 ].
um estudo publicado recentemente no desenvolvimento dérmica cranial cedo indicaram um papel consistente para sinalização de Wnt /β-catenina via Twist2 na especificação dérmica em diferentes regiões do embrião [32]. Twist2 pode ser um alvo da transcrição directa e pode mediar o papel funcional da sinalização de Wnt na precursores dérmicos. Em nosso experimento, Twist2 aumento nuclear β-catenina. Além disso, as formas solúveis e citossólicos não solúvel de β-catenina são estritamente reguladas pelo sistema de proteossomas /ubiquitinação que consiste em GSK3β, axina, e polipose adenomatosa coli (APC) proteína [25]. Devido à regulação negativa da APC, degradação β-catenina também foi reprimida. Uma vez no núcleo, β-catenina que medeiam a activação de genes específicos do mesênquima. Nós mostrou um aumento de c-Myc e Ciclina D1 na via de sinal /β-catenina Wnt (Fig. 6). Porque β-catenina foi necessário para a expressão dos genes mesenquimais, que verificar se a actividade de transcrição desta proteína foi afectada por Twist2 ectópica. Como mostrado na Fig. 7, a actividade do promotor TCF4 /LEF1-dependente (TOP) foi regulada positivamente (duas dobras) em células transfectadas com Twist2. Portanto, estes resultados indicam que a expressão de genes mesenquimais está sob o controlo de β-catenina através de complexos /LEF1-dependentes TCF4. Confirmada pelo resultado apresentado na Fig. 5D, a distribuição β-catenina nuclear foi aumentada em células Twist2 /SKOV-3. Assim, Twist2 pode aumentar a atividade transcricional β-catenina TCF4 /LEF1-dependente.
Neste estudo, nós fornecemos evidências de que Twist2 afeta comportamentos celulares em Skov-3 células, incluindo alterações na morfologia e motilidade. Ao nível molecular, Twist2 induz alteração significativa dos marcadores EMT. Além disso, Twist2 promovido a migração celular e invasão de células SKOV-3. Portanto, Twist2 promovido libertação β-catenina do complexo E-caderina /catenina β-através da inibição da E-caderina. Com o acúmulo β-catenina nuclear, via Wnt /β-catenina foi então activado para promover um fenótipo de EMT.
Para o melhor de nosso conhecimento, nós mostramos pela primeira vez que a ativação Wnt em Twist2 induzida pelo progresso EMT no câncer de ovário, oferecendo novos insights sobre sua metástase.
Conclusões
Nossos dados sugerem que a regulação positiva de Twist2 está correlacionada com o estágio FIGO em cancros do ovário humanos. Embora não haja nenhuma correlação entre a expressão Twist2 e o tipo histológico do tumor, Twist2 é um indicador de potencial de alto grau de malignidade e mau prognóstico no cancro do ovário clínica. Superexpressão de Twist2 induziu os fenótipos EMT em células de câncer de ovário humano
in vitro
. Regulação negativa de E-caderina e da APC, bem como a regulação positiva de N-caderina e β-catenina (no núcleo da célula), sugerem que promove a libertação Twist2 β-catenina a partir de E-caderina /catenina β-através da inibição da E-caderina. Além disso, devido à regulação negativa das APC, a degradação β-catenina foi reprimida. Portanto, via canonical /β-catenina Wnt foi, em seguida, activado pela acumulação β-catenina nuclear, assim evocado transcrição de genes alvo a jusante para promover a invasão pelo tumor e metástases. Colectivamente, estes dados indicam que a β-catenina está envolvido na EMT-induzida Twist2 no câncer de ovário.
Materiais e Métodos
Materiais
anticorpo anti-Twist2
Mouse foi comprado de Abnova Biotechnology. De ratinho anti-Flag, anti-β-actina, e os anticorpos anti-Akt foram adquiridos a Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). De coelho anti-E-caderina, de cabra anti-N-caderina, anticorpo de coelho anti-IKB-α, de coelho anti-β-catenina, de ratinho anti-Oct-1, anticorpo de coelho anti-Ciclina D1, de coelho anti-c-Myc, Rato IgG anti-coelho, os anticorpos anti-IgG de ratinho foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA)
de coelho anti-fosfo-AKT (Ser 473) de anticorpo foi adquirido a R .; D Systems Europe . De coelho anti-ERK1 /2, de coelho anti-P-ERK1 /2, de coelho anti-Akt, de coelho anti-P-Akt foram adquiridos a partir de Cell Signaling Companhia. ABC Kits e substrato DAB kit foram comprados da Thermo Scientific e Pierce, respectivamente. -Fixados em formalina e batatas fritas tissue microarray do cancro do ovário embebidos em parafina foram de Alenabio Company. O protocolo de pesquisa e os projetos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade de Xiamen (ID No: 20100602). Todas as nossas investigações clínicas foram realizadas de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki.
imuno coloração
secções de arranjo de tecido em câncer de ovário primário humano fixado em formalina e embebidos em parafina foram examinadas para avaliar a expressão de Twist2, e coloração imuno-histoquímica (IHQ) foi realizada como descrito anteriormente [25], [33]. Twist2 foi demonstrado que reconhecem especificamente as proteínas correspondentes (Fig. 1a). Diaminobenzidina foi utilizada para visualizar a reacção imuno-histoquímica, seguido de contracoloração com hematoxilina. Para preparar o controlo negativo, o anticorpo primário foi substituído com IgG de ratinho normal. A coloração IHC na matriz de tecido foi repetido por 3 vezes, analisados por meio de microscopia de luz padrão. As células positivas mostraram grânulos castanhos em citoplasma ou no núcleo celular
A percentagem de células positivas foi determinada calculando a percentagem de células positivas em células totais observados: Se 10%, 0; 10% -20%, 1. ; 20% -50%, 2; 50%, 3. a intensidade foi decidido comparando a coloração de células tumorais: sem coloração ou coloração ambígua, 0; coloração fraca, 1; coloração média, 2; coloração forte, 3. As duas pontuações foram multiplicados para categorizar a coloração: 0-1, negativo (-); 2-4, positivo (+); ≥5, forte positivo (++)
Generation. de Twist2-superexpressão estável células cancerosas ovarianas
A linha de células de cancro do ovário humano SKOV-3 foi obtido a partir de ATCC. As células foram mantidas em meio de McCoy 5A suplementado com soro fetal bovino a 10% e penicilina /estreptomicina. O plasmídeo Bandeira-Twist2 expressando tinha sido construída em nosso estudo anterior [25]. O plasmídeo Bandeira-Twist2-expressão e o vector pBabe-puromicina foram co-transfectados em células SKOV-3 de células de cancro do ovário usando o lipofectamine2000
reagente de transfecção TM (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os clones estáveis Twist2 expressam e os clones de controlo do vector foram obtidos, respectivamente, através de seleção com puromicina. Os níveis de expressão Twist2 nos clones estáveis selecionados foram então verificada por meio de análise imuno-blot com anticorpos Twist2 e bandeira.
celular Observação morfológica e confocal de imunofluorescência Coloração
formas morfológicas celulares foram observadas utilizando microscopia de fase (Olympus). coloração imuno-histoquímica foi realizada em Twist2 /SKOV-3 e /SKOV-3 de células de cancro do ovário vector, como anteriormente descrito [25]. A coloração de Twist2- e vector-transfectadas foram observadas células SKOV-3 e analisados usando microscopia confocal de varrimento laser (Olympus).
Crescimento Celular Ensaio
As células foram semeadas em meio normal até colhida. O crescimento celular foi avaliado através de um ensaio MTT como descrito anteriormente [34]. A taxa de proliferação das células transfectadas foi detectada e comparada com a do controlo de vector através da contagem de células viáveis utilizando a coloração de tripano azul. Os ensaios foram realizados em triplicado, em cada grupo de células. Os dados foram expressos como média ± SD. A taxa de proliferação celular (%) foi calculada da seguinte forma: número de células do grupo /número experimental do grupo de controle × 100%
cicatrização de feridas ensaio
As células foram semeadas em seis. bem placas (1 × 10
5 células /prato) e quando alcançaram mais de 90% de confluência, um arranhão foi feita através da monocamada de células com a ponta. As células foram suavemente lavadas com PBS 3 vezes e mantido no meio fresco. As células foram incubadas durante 24 horas e fotografadas utilizando um microscópio invertido de cultura de tecidos em × 100 de ampliação. Os ensaios foram realizados pelo menos três vezes e os dados foram apresentados como médias ± DP. O potencial de migração entre as células Twist2 expressam e as células de controlo foi comparada com a distância diferença relativa. E analisamos os resultados pelo teste ANNOVA uma maneira (software Prism5). A P-valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
celular Invasion Ensaio
Para ensaio de invasão, 5 × 10
3 células foram semeadas em inserções de membrana Matrigel-revestidas (BD. Bioscience). A câmara inferior continha 0,75 ml de McCoy 5A suplementado com soro bovino fetal a 10% como um quimioatractor. As células foram incubadas durante 24 hrs, as células remanescentes no interior do inserto foram removidos com uma cotonete e as células que tinham penetrado no Matrigel para invadir a superfície inferior da membrana foram fixas em metanol e coradas com H E. Depois do ar de secagem da membrana, as células foram contadas em ampliação x 100 em 10 campos aleatórios de vista sob um microscópio. Três experiências independentes foram realizados em cada caso.
Análise
ciclismo celular por citometria de fluxo
o ciclo celular foi identificada por meio de análise de citometria de fluxo, como previamente descrito [34]. Resumidamente, as células foram semeadas durante 24 h, depois foram recolhidas, lavadas duas vezes com PBS e fixadas em 70% de etanol a 4 ° C durante a noite. Os sedimentos celulares foram suspensos em solução de coloração com iodeto de propídio (20 ug iodeto de propídio /ml e 0,2 mg /ml de RNase em PBS) e incubada durante 30 min a 37 ° C. As amostras foram então analisadas através de citometria de fluxo.
Isolamento de Subcelulares Frações, e Análise de Western Blot
fracionamento celular e análise Western blot foram realizados como nossas publicações anteriores [34], [35]. Detalhes de fraccionamento celular é como se segue: extractos celulares totais foram preparado por raspagem células fora dos pratos de Petri, os sedimentos celulares de lavar duas vezes em PBS, e em seguida ressuspensão pelotas em dois-embalado volumes de células de tampão RIPA [NaCl mM Tris 150 mM /50 · HCl, pH 7,5 /0,25% (p /ol) desoxicolato /1% de Nonidet P-40 de sódio /5 mM de ortovanadato de mistura /2 mM de fluoreto de sódio /inibidor de protease]. Os extractos nucleares e citoplasmáticos foram isolados por sedimentos celulares de lavagem em tampão A (HEPES 10 mM, pH 7,5 /10 mM de KCl /Mg 1,5 mM
2Cl /NaF 0,5 mM /1 de glicerol fosfato mM /mistura de protease), seguida de lise em tampão a + B (tampão a mais 0,5% de Nonidet P-40) em uma mistura 02:01.