Abstract

expressão Lin28 Superior está associada a piores respostas tumorais patológicas em localmente pacientes com câncer gástrico avançado submetidos à quimioterapia neoadjuvante. No entanto, as características de Lin28 e o seu mecanismo de acção na resistência à quimioterapia é ainda pouco claro. Neste estudo, verificou-se que a transfecção de Lin28 em células cancerosas gástricas (MKN45 e MKN28) aumentou sua resistência aos quimio-drogas oxaliplatina (OXA), paclitaxel (PTX), doxorrubicina (ADM), e fluorouracil (5-FU) em comparação com células de cancro gástrico transfectadas com um vector de controlo. Quando a expressão Lin28 knockdown por Lin28 pequeno ARN interferente (siRNA) foi avaliada in vitro, verificou-se que a resistência a quimio-drogas foi reduzida. Além disso, descobrimos que Lin28 up-regula C-myc e P-gp e para baixo-regula CYLIN D1. Finalmente, descobrimos que o miR-107 é um alvo de microARN Lin28 e que participa no mecanismo de resistência à quimioterapia. Nossos resultados sugerem que a via Lin28 /miR-107 pode ser uma das muitas vias de sinalização regulados por Lin28 e associados com câncer gástrico quimio-resistência

Citation:. Teng R, Hu Y, Zhou J, Seifer B, Chen Y, Shen J, et al. (2015) sobre-expressão de Lin28 Diminui o Chemosensitivity de células de câncer gástrico de oxaliplatina, paclitaxel, doxorrubicina, e fluorouracil na parte via microRNA-107. PLoS ONE 10 (12): e0143716. doi: 10.1371 /journal.pone.0143716

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, United States |

Recebido: 23 de junho de 2015; Aceito: 08 de novembro de 2015; Publicação: 04 de dezembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Teng et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. o apoio foi fornecido pelo Provincial de Zhejiang Natural Science Foundation da China: LQ13H160014 [https://www.zjnsf.gov.cn/b/home.aspx] .

competir interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer gástrico é um tumor maligno comum clínica sistema digestivo com uma taxa de mortalidade que ocupa a terceira posição no mundo [1]. Nosso país é uma área que é propensa ao câncer gástrico. Nos últimos anos, a quimioterapia neo- adjuvante tem sido administrada a doentes com cancro gástrico para prolongar a sobrevivência. No entanto, a taxa de sobrevida em 5 anos dos pacientes com câncer gástrico avançado ainda é inferior a 30% [2]. resistência à quimioterapia é a principal causa da falha do cancro gástrico e outros tratamentos tumorais. Por conseguinte, o mecanismo de resistência à quimioterapia do cancro gástrico é actualmente uma das principais preocupações em estudos do cancro gástrico.

Lin28 é uma proteína de ligação a ARN altamente conservado que se tem mostrado participar na indução de células estaminais pluripotentes e na manutenção da haste células semelhantes a células no câncer. Estudos recentes relataram que a activação aberrante de Lin28 correlaciona-se bem com o prognóstico de diferentes cancros, incluindo cancro da mama, ovário, pulmão, cólon, cancro do fígado e [3-6]. O nosso estudo anterior mostrou que a expressão Lin28 também está associada com a má sobrevivência em doentes com cancro gástrico [7], e um outro estudo demonstrou que a expressão de Lin28 está correlacionada com a resistência ao paclitaxel em células de cancro da mama humano [8]. Além disso, a expressão Lin28 está associada com a resposta do tumor patológico em pacientes com câncer gástrico localmente avançados submetidos à quimioterapia neo-adjuvante. No entanto, o mecanismo molecular subjacente a estas descobertas permanece incerto [9].

Lin28 promove a tumorigénese através da repressão miARNs supressores de tumor, tais como o deixar-7 família, que está associada com resistência à droga [8]. No entanto, como um miRNA alvo de Lin28, miR-107 raramente é mencionado como um fator de resistência a drogas em câncer gástrico. expressão de miR-107 é diminuída em uma variedade de doenças malignas, como câncer de cólon, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pâncreas e câncer gástrico [10-13]. MiR-107 regula os genes a jusante que estão envolvidos na diferenciação e proliferação celular, metabolismo, respostas ao stress e a formação de vasos sanguíneos [10-14]. Neste estudo, investigou-se a Lin28 /miR-107 via e o seu papel na resistência de células de cancro gástrico à quimioterapia. Podemos ter identificado um novo alvo potencial para câncer gástrico quimioterapia-resistente.

Materiais e Métodos

1. cultura de células e plasmídeo transfecção

As linhas celulares de cancro gástrico humano MKN-28 e MKN-45 foram obtidos como um presente do Professor Sung Hoon Noh (Yonsei University College of Medicine, Seoul, Coreia do Sul). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (MP Biomedicals, Costa Mesa, CA, EUA), numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2 a 37 ° C. A oxaliplatina, paclitaxel, doxorrubicina, e fluorouracilo foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO). O plasmídeo pcDNA3.1-Lin28 foi transfectado com ADN Xtreme GENE HP Transfection Reagent (Roche Applied Science, Mannheim, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. Os clones que expressam Lin28 estáveis ​​foram posteriormente seleccionadas e cultivadas com o meio RPMI 1640 contendo neomicina apropriado.

2. -PCR quantitativo em tempo real

em tempo real Q-PCR foram realizadas análises com o sistema de detecção de sequência ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Resumidamente, uma mistura reaccional de 20 ul contendo 2 ul de molde de ADNc e 1 uL de cada um dos iniciadores com sentido e anti-sentido (sistema Promega PCR® Q-Master Mix Gotaq, Madison, WI, EUA) foi amplificada como se segue: desnaturação a 95 ° C durante 10 min e 40 ciclos de 95 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s, e 72 ° C durante 40 s. reacções de Q-PCR em tempo real foram efectuadas em triplicado para cada amostra, e o valor médio foi utilizado para calcular os níveis de mRNA. A análise quantitativa foi realizada usando o método CT comparativo. Os números de cópias Lin28 e miR-107 em tecidos tumorais foram normalizados para os ARNm copiar números de arrumação do gene da gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) para se obter o valor 2

-Δ CT. As sequências dos iniciadores são como segue na Tabela 1.

3. Célula de droga-resistência Ensaio

A viabilidade celular foi medida utilizando um MTT [brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio] ensaio (Amresco, Solon, OH, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. As células foram semeadas em placas de 96 poços a uma densidade de 5 * 10

3 células por poço. Após o tratamento, as células foram incubadas com 5 mg /ml de MTT durante 4 h. Em seguida, o meio foi removido e 150 ml de solução em DMSO esterilizada foi adicionado, seguido de incubação a 37 ° C durante 4 h. O valor de OD foi obtido no comprimento de onda de 570 nm e 630 nm. O valor de DO (570 nm a 630 nm) pode indirectamente reflecte o número de células e actividade de acordo com a seguinte fórmula: Taxa de sobrevivência = grupo doseado OD570-630 /grupo de dose não OD570-630. A curva de concentração sobrevivência celular /droga foi então gerada.

4. Análise de mancha ocidental

Os lisados ​​celulares foram separados por electroforese num mini-gel de 4-15% de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida de gradiente (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) e transferidas electroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose (Amersham Pharmacia , Piscataway, NJ). As transferências de Western foram sondadas com anticorpos contra Lin28, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), as caspases e caspases clivados, ciclina D1, o NF-kB (Cell Signaling, Beverly, MA), CDK6, C-myc (Abcam Negociação ( Shanghai) Company, Xangai, China), P-gp, e Bcl-2 (Huan Biotecnologia, Beijing, China). As bandas proteicas foram detectadas por quimioluminescência aumentada (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).

5. Citometria de Fluxo Ensaio

As células (2 * 10

5 por cavidade) foram plaqueadas numa placa de seis poços e tratadas com paclitaxel. Após 72 h, as células foram fixadas em etanol a 70% e coradas com iodeto de propídio (PI). O teor de ADN foi analisado com um perfil Epics II citómetro de fluxo (Beckman Coulter, Fullerton, CA) com software Multicycle (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). Todas as experiências foram repetidas pelo menos duas vezes. PI também foi usado em conjunto com Anexina V (BD Biosciences, San Jose, CA) para determinar se as células eram viáveis, apoptóticas ou necróticas.

6. MiARN transfecção e Detecção

As células foram plaqueadas em placas de cultura de seis poços e transfectadas com 50 nM de pré-miR-107 adquirido a Applied Biosystems (Carlsbad, CA) ou controlar pré-miARN de acordo com o protocolo do fabricante. Quantitativo em tempo real de Reacção em Cadeia da Polimerase (PCR) foi realizada usando o TaqMan MicroRNA Transcrição Reversa Kit e o rápido sistema de PCR em tempo real (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) de acordo com os protocolos do fabricante. A mudança vezes nos níveis de miR-107 microRNA foi calculado e normalizado a um controle de carga HSA-mir-423.

7. Animais

BALB /c com idades entre 3-4 semanas pesando 18-22 g foram adquiridos da empresa animais de laboratório SLAC (SCXK-2007-004, Xangai, China) e alojados cinco por gaiola em um livre de patógenos específicos (SPF) meio ambiente. Os animais foram deixados a aclimatar às instalações de alojamento, durante 7 dias antes das experiências começou. procedimentos de manuseio de animais foram realizados de acordo com a legislação P. R. China sobre a utilização e cuidados de animais de laboratório e aprovada pela Comissão de Ética Experimental animal da Universidade de Zhejiang (Zhejiang, China).

8. Xenoenxerto Ensaio e Tratamento

Resumidamente, grupos de seis ratinhos BALB /c foram injectados por via subcutânea com 1 * 10

6 MKN45 /Lin28, MKN45 /Vector, ou células MKN45 no flanco direito. O volume do tumor foi calculado pela fórmula: V = 1/2 *

a

*

b

2, onde

a

e

b

são as mais longas e as mais curtas diâmetros da massa tumoral (em milímetros), respectivamente. Quando os tumores atingiram cerca de 80 milímetros

3, os ratinhos foram tratados com injecção de ADM (50 mg /kg) e OXA (5uM /kg) a cada semana durante 2 semanas. Alterações quantitativas do peso e volume tumoral corporal foram medidos a cada três dias por um único indivíduo com uma balança e compassos de calibre de Vernier. Não anestésicos foram utilizados nos experimentos do mouse.

9. A análise estatística

Todos os experimentos foram realizados três vezes com amostras em triplicado. A análise da variância e do teste t de Student foi utilizado para comparar os valores das amostras de teste e de controlo. Um valor de P inferior a 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Statistica 6,1 software foi utilizado para todas as análises estatísticas. A significância foi avaliada pelo teste t de Student.

Resultados

1. Os testes in vitro das alterações de sensibilidade quimioterapia em células cancerosas gástricas expressam de forma estável Lin28

Duas linhagens de células de câncer gástrico com expressão Lin28 negativo (MKN45 e MKN28) foram seleccionadas e cultivadas. Foram identificadas as células de cancro gástrico com expressão estável Lin28 a partir de clones transfectados resistentes (MKN45 /Lin28 /C2 e MKN28 /Lin28 /C3), utilizando transferência de Western e Q-PCR (Figura 1).

(A). A linha celular de cancro gástrico MKN45 e MKN 28 Lin28 com sobreexpressão foram estabelecidas através de transfecção Lin28 plasmídeo, a expressão Lin28 foi detectado por Western-blot. (B). nível de ARNm de Lin28 foi detectada por qRT-PCR, cada ponto de dados representa a média ± DP de três experiências independentes. (** P 0,01). (C). MKN45 com Lin28 superexpressão mostraram um aumento da resistência à OXA, a PTX, a ADM, 5-FU. (D). MKN28 com Lin28 superexpressão mostraram aumento da resistência a OXA, PTX, ADM, 5-FU.

O selecionado MKN45 /Lin28C2, MKN45 /Vector, MKN45, MKN28 /Lin28C3, MKN28 /Vector, e MKN28 células foram testados para a susceptibilidade de quimioterapia de droga. Nós selecionamos os seguintes quatro comumente usados ​​drogas quimioterápicas clínicos para o tratamento de câncer gástrico: OXA, PTX, ADM, e 5-FU. O tratamento com OXA, PTX, e ADM durou durante 48 horas, enquanto que o tratamento com 5-FU durou 72 horas. Após Lin28 transfecção, as células MKN45 e MKN28 teve uma diminuição da sensibilidade ao OXA, PTX, ADM, e 5-Fu, que foi mais pronunciada para OXA e PTX. Os valores de IC50 eram mais de duas vezes o do grupo de controlo (Figura 1).

Com base no ensaio de MTT, utilizou-se citometria de fluxo para detectar as diferenças entre as células em apoptose Lin28-positivos e negativos-Lin28 após a quimioterapia exposição PTX. O MKN45 /Lin28, MKN45 /vector e células MKN45 grupos receberam 0 uM e 0,1 uM tratamento de PTX durante 24 horas, e coloração dupla foi realizada para detectar a apoptose celular. A taxa de apoptose de células transfectadas Lin28 foi menor do que a de células não-transfectadas (P 0,05). Além disso, as transferências Western de proteína recolhidos a partir de células tratadas com 0,1 uM PTX mostraram que a apoptose foi reduzida em células MKN45 /Lin28 como mostrado por uma diminuição em a activação da caspase 9 e caspase 3 (Fig 2).

( A) e (B). a taxa de apoptose de MKN45 /Lin28, MKN45 /Vector, MKN45 tratada com PTX na 0.1um foi exibida. Os dados mostraram MKN45 /Lin28 tinha menos a taxa de apoptose de MKN45 /Vector e MKN45. Cada ponto de dados representa a média ± DP de três experiências independentes. (* P 0,05). (C). caspase9 Cleaved- e caspase3 foram detectadas por Western Blot. casepase Cleaved- 9 e casepase 3 foram diminuiu em MKN45 /Lin28.

transfecção transiente de siRNA-Lin28 deve inibir os níveis de expressão Lin28 em MKN45 /Lin28 e MKN28 /Lin28 células 48 horas após a transferência de acordo com a orientações experimentais do fabricante do reagente. a expressão da proteína Lin28 foi detectada, e a sensibilidade ao fármaco associado foi testado. Lin28 expressão do RNA em células de cancro gástrico foi detectada por Q-PCR, enquanto que a expressão da proteína foi detectada por Western blot (Figura 3).

(A) .MRNA nível de Lin28 após Lin28 knockdown foram detectados por qRT-PCR às 48h, 72h após a transfecção em MKN45 /Lin28 C2 e MKN28 /Lin28 C3. Cada ponto de dados representa a média ± DP de três experiências independentes. (** P 0,01, * p 0,05). (B). nível de proteína de Lin28 em MKN45 /Lin28 C2 e MKN28 /Lin28 C3 foram detectados por 72h western-blot após Lin28-siRNA transfecção. (C). Quimio-sensibilidade de MKN45 /Lin28 e MKN28 /Lin28 para OXA, PTX e a ADM por ensaio MTT após expressão Lin28 foram knockdown. (D) e mudança (E) .Apoptosis entre MKN45 /Lin28 /si-Lin28, MKN45 //si-control Lin28, MKN28 /Lin28 /si-Lin28, //-control si Lin28 MKN28 em OXA 3.2ug /ml, PTX 1uM.After Lin28 foi knock-down, a apoptose de MKN45 /Lin28 foram diminuídos. Cada ponto de dados representa a média ± DP de três experiências independentes. (* P 0,05)

Q-PCR mostraram que a expressão de mRNA Lin28 em MKN45 /Lin28 /si-Lin28 (48 h) e MKN45 /Lin28 /si-Lin28 células (72 h) foi. muito mais baixa do que em células MKN45 /Lin28 /-controlo Si (p 0,01). Este efeito de transfecção também foi verificada em células MKN28 /Lin28. Western blot revelou que Lin28 SI-ARN inibe significativamente a expressão da proteína em Lin28 MKN45 /Lin28 e células MKN28 /Lin28.

Um ensaio de MTT foi realizado sobre os quatro tipos de células (MKN45 /Lin28 /Si-controlo, MKN45 /Lin28 /Si-Lin28, MKN28 //Si-Lin28 controlo, e MKN28 /Lin28 /Si-Lin28 células) que foram transfectadas com ARNsi Lin28 durante 48 horas para avaliar a sensibilidade quimioterapia. Nós escolhemos usar as drogas quimioterápicas que tiveram os efeitos mais pronunciados no pré-teste: OXA, PTX e ADM. Nós selecionamos um gradiente de concentração de 5-6 de acordo com os resultados preliminares de experimentos preliminares. Interferência por siRNA reduziu a expressão de Lin28, e linhas celulares Lin28-positivos tiveram um aumento da sensibilidade a drogas quimioterápicas (Fig 3).

A seguir, detectado a sensibilidade das células a diferentes drogas da quimioterapia após a regulação negativa da Lin28 . As células foram divididas em 4 grupos, MKN45 /Lin28 /Si-controlo, MKN45 /Lin28 /Si-Lin28, /Si de controlo de MKN28 Lin28 /e MKN28 /Lin28 /Si-Lin28, e foram testados com os quimioterapia drogas OXA e PTX respectivamente . As concentrações de droga de quimioterapia (OXA 3,2 ug /ml de PTX e 1 uM) foram seleccionados de acordo com os resultados de experiências preliminares. O número de apoptótica MKN45 /Lin28 e células MKN28 /Lin28 era menos do que a de MKN45 /Lin28 /Si-Lin28 e células MKN28 /Lin28 /Si-Lin28 (p 0,05). Este resultado indica que a regulação negativa da expressão Lin28 pode aumentar a apoptose celular (Figura 3).

2. Os mecanismos moleculares pelos quais as mudanças Lin28 na sensibilidade quimioterapia

Detectamos relacionadas com a resistência aos medicamentos níveis de expressão de genes por q-PCR em MKN45 /Lin28 e MKN45 /vetor cells.P-gp, e os níveis de ARN C-myc estavam aumentou acentuadamente e nível de RNA ciclina D1 foram reduzidos, enquanto outros Bcl-2, CDK6, NF-kB, TOP II não apresentaram diferença significativa entre MKN45 /Lin28 e MKN45 /vetor cells.Also estes relacionados com a resistência aos medicamentos expressões gênicas foram investigados por western blot em MKN45 /Lin28 e células /Vector MKN45, que mostraram tendência consistente de que a P-gp e a expressão de proteína C-myc aumentaram, enquanto Ciclina D1 diminuiu. No entanto, a expressão de Bcl-2 diminuída, a expressão de NF-kB não se alterou, e expressão da Ciclina D1 e CDK6 a proteína quinase foi reduzida (Figura 4).

(A) .Differential expressão de droga-resistência associados proteína entre MKN45 /Lin28 e MKN45 /Vector. (B) e (C) .P-gp e nível de expressão C-myc foram reduzidos em ambas as proteínas e os níveis de ARN após Lin28 knockdown na célula MKN45 /Lin28, enquanto expressão da ciclina D1 foi aumentada. Cada ponto de dados representa a média ± DP de três experiências independentes. (** P 0,01, * p 0,05).

Após expressão Lin28 foi inibida por transfecção com Lin28 ARNsi, os níveis de ARN de P-gp, C-myc e Ciclina D1 foram reavaliados. Após redução do nível de ARN de Lin28, P-gp e C-myc foram significativamente regulada negativamente, enquanto que os níveis de ciclina D1 aumentou significativamente. Detecção de P-gp, C-myc, e expressão da ciclina D1 por transferência de Western revelou que, após a inibição da expressão Lin28, P-gp e a expressão de proteína C-myc foi significativamente regulada para baixo, enquanto que a expressão da ciclina D1 foi significativamente regulada positivamente ( Fig 4).

3. MiR-107 é o alvo de microARN Lin28

Ao testar a Lin28 ARN e os níveis de miR-107 em linhas celulares de cancro gástrico, encontramos inibição mútua da Lin28 e miR-107 nas linhas de células MKN45 e AGS. Além disso, o miR-107 foi regulada em células MKN45 /Lin28 e MKN28 /Lin28. Knockdown da expressão de Lin28 inverteu esta inibição. Em um experimento de acompanhamento, as células Lin28-positivas, MKN45 /Lin28 e MKN28 /Lin28, foram transfectadas com pré-mir-107 e foram posteriormente referido como MKN45 /Lin28 /pré-miR-107 e MKN28 /Lin28 /pré- células de miR-107. células pré-miR-controle transfectadas foram chamados MKN45 /Lin28 /pré-miR-Control e MKN28 /Lin28 /pré-miR-Control. Anti-miR-107 ou controle transfecções em células Lin28-negativas, MKN45 /Vector, rendeu MKN45 /Vector /células anti-miR-107 e MKN45 /Vector /anti-miR-Control, respectivamente. Quarenta e oito horas após a transfecção, o ARN foi recolhido e submetido a Q-PCR para detectar as diferenças de miR-107 em expressão MKN45 /Lin28, MKN28 /Lin28, MKN45 /vector, e as células /Vector MKN28. O efeito do knockdown de expressão Lin28 por Lin28 siARN foi também avaliada. Após transfecção com Lin28, miR-107 foi significativamente regulada para baixo, enquanto que após knockdown de expressão Lin28, a expressão de miR-107 aumentou. Quarenta e oito horas após a transfecção de pré-miR-107, os níveis de ARN Lin28 foram significativamente diminuída, e 96 horas após a transfecção, a expressão da proteína Lin28 foi ainda menor do que a do grupo de controlo não transfectadas. Esta descoberta indica que o miR-107 pode regular a expressão de Lin28 (Fig 5).

(A) .RNA nível de Lin28 e miR-107 foram detectados por qRT-PCR em linha celular gástrica. (B) Nível de expressão .MiR-107 foram detectados por qRT-PCR após Lin28 superexpressão (em MKN45 e MKN28) ou Lin28 knockdown (em MKN45 /Lin28). (C). Pré-miR-107 transfecção regulada para baixo em Lin28 MKN45 /Lin28 de um modo dependente do tempo. (D). sensibilidade Chemo-droga de MKN45 /Lin28C2 e MKN28 /Lin28C3 aumentou após transfecção de pré-miR-107. (E). taxa de apoptose de MKN45 /Lin28 (tratado com OXA no 3.2ug /ml) aumentou após transfectadas com pré-miR-107. (F). sensibilidade quimio-drogas da célula MKN45 mudou depois transfectadas anti-miR-107. (G) e (H). P-gp, expressão de C-myc foram reduzidos, enquanto que a expressão CyclinD1 foi aumentada em células MKN45 /Lin28 depois transfectadas com o ponto de dados pré-miR-107.Each representa a média ± DP de três experiências independentes. (** P 0,01, * p 0,05).

4. MiR-107 participa na resistência quimio-drogas Lin28 mediada

A sensibilidade quimioterapia de 4 grupos de células, MKN45 /Lin28 /pré-miR-controle, MKN45 /Lin28 /pré-miR-107, MKN28 /Lin28 /pré-miR-MKN28 de controlo e /Lin28 /pré-miR-107, foi testada utilizando o método de MTT de 48 horas após a transfecção com pré-miR-107. Nós escolhemos drogas quimioterápicas que tiveram os efeitos mais pronunciados durante a pré-testagem, OXA, PTX e ADM, e selecionou um gradiente de concentração de 5-6 de acordo com os resultados preliminares de experimentos preliminares. Os resultados sugerem que a introdução de pré-miR-107 em células Lin28-positivo pode aumentar a sensibilidade das células à quimioterapia. A apoptose testes mostraram que o número de células apoptóticas MKN45 /Lin28 aumentou após a transfecção com pré-miR-107 (p 0,05). teste MTT de MKN45 //anti-miR-Lin28 controlo MKN45 e /Lin28 /anti-miR-107 de sensibilidade quimioterapia demonstraram que a inibição da expressão de miR-107 em MKN45 reduziu a sensibilidade a PTX (Fig 5).

por western blotting e Q-PCR, foram detectados os níveis de expressão de genes e proteínas relacionados com a resistência a drogas em células MKN45 /Lin28 que tinham sido transfectadas com pré-miR-107, incluindo aqueles de C-myc, a P-gp, e Ciclina D1. Os resultados mostraram que 48 horas após a transfecção com o miR-107, a expressão de ARN e proteína de C-myc e da P-gp diminuiu (P 0,01), enquanto que a expressão da ciclina D1 aumentou (P 0,05) (Figura 5).

5. Lin28 associado resistência quimio-drogas in vivo

Depois de 2 ciclos de quimioterapia, descobrimos que os tumores de xenoenxerto de células MKN45 /Lin28 não reduziu em volume e tornou-se maior do que os dos outros grupos (MKN45 /Vector e MKN45 ). Em ambos os grupos MKN45 /Lin28 e MKN45 /vector, um dos murganhos morreu, de modo a quimioterapia foi parado. Os tumores foram excisados ​​e os seus volumes analisados. Descobrimos que os tumores de xenoenxerto MKN45 /Lin28 eram maiores do que os outros tumores após ADM e OXA quimioterapia (p 0,01). (Fig 6)

MKN45 /Lin28, MKN45 /Vector, células MKN45 /parentais foram inoculados por via subcutânea na axila de ratinhos macho BALB /c-nu /nu. O volume do tumor foi medido e curva de crescimento foi construído após a injeção de ADM e OXA

via

veia da cauda. Cada ponto de dados representa a média ± DP de três experiências independentes. (** P 0,01).

Discussão

No presente estudo, foi investigada a associação de expressão Lin28 com quimio-sensibilidade nas células cancerosas gástricas. Verificou-se que a transfecção com Lin28 reduz a sensibilidade das linhas celulares de cancro gástrico MKN45 e MKN28 a quatro tipos de reagentes quimioterapêuticos (OXA, PTX ADM, e 5-FU). Usando a tecnologia de interferência siRNA para knockdown expressão Lin28 poderia reverter quimio-resistência. Também mostrou que o miR-107 pode regular negativamente a expressão Lin28, ao mesmo tempo que é servido como um dos potenciais microARNs alvo que é regulada por Lin28. Superexpressão de Lin28-regulada C-myc e P-gp, enquanto sub-regulada ciclina D1, esta fenômenos poderia reverter por Lin28 siRNA ou transfecção pré-miR-107. Isso pode ser mecanismos críticos pelos quais Lin28 diminuiu quimio-sensibilidade nas células cancerosas gástricas. Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que demonstra Lin28 /miR-107 via de sinalização podem estar envolvidos na resistência quimio-drogas em câncer gástrico.

A quimioterapia é um dos principais de tratamento para pacientes com câncer gástrico, mas mais do que 50% dos pacientes irão progredir para a resistência à quimioterapia. Os possíveis mecanismos de quimio-resistência em cancro gástrico são actualmente considerado para incluir o transporte trans-membrana de transportadores ABC, glutationa S-transferase, a actividade da topoisomerase I de ADN, a mutação do gene p53 do cancro e vias relacionadas apoptose. Um estudo recente descobriu que microRNA desempenha um papel importante na resistência aos medicamentos de quimioterapia câncer gástrico [15]. Em um modelo de resistência de células de tumor, foi observado que as células estaminais do cancro também desempenham um papel importante na resistência à quimioterapia. O gene C-myc é um dos marcadores de superfície de células estaminais do cancro, mas também um oncogene relacionado com proliferação indefinida, imortalização infinito, e a promoção da divisão celular [16]. Um estudo relatou que 40% dos pacientes com câncer gástrico tem C-myc superexpressão de genes e que a maior expressão C-myc está associada a um pior prognóstico [16-18]. Estudos também mostraram uma correlação entre o gene C-myc e apoptose. expressão de C-myc pode levar a uma diminuição da apoptose de células tumorais. A taxa de apoptose celular e sensibilidade a factores induzidos são dependente dos níveis de proteína C-myc [19]. Além disso, a sobre-expressão C-myc está associado com resistência a radiação e a quimioterapia. Além disso, C-myc pode-regulada P-gp, que pode induzir effluxing de reagentes quimioterapêuticos levou a resistência à quimioterapia [20]. a paragem do ciclo celular, podem afectar a resposta de células cancerosas para certos fármacos de quimioterapia (como a PTX), que desempenha um papel na fase G2 /S reduzida sensibilidade ao fármaco. A proteína ciclo celular ciclina D tem três subtipos, D1, D2, e D3, e é um factor de iniciação do ciclo celular. A sua supressão por factor de crescimento transformante -β1 (TGF-β1) impede que as células entrem no ciclo celular de tal forma que eles permanecem num estado de repouso [21]. Ciclina D combina especificamente com CDK4 /6 para fosforilar e inactivar a proteína do retinoblastoma (pRb), contribuindo assim para a transição G1 /S e a iniciação da síntese de ADN [21]. No presente estudo, encontramos Lin28 não eram relevantes com Bcl-2, NF-kB e TOPO II em células de câncer gástrico. A parceria entre Lin28 e microRNAs foi bem estabelecida, como deixá-7, miR-200c, miR-143 [4,22]. Lin28 superexpressão down-regula microRNA, enquanto microRNA também pode afetar negativamente a expressão de Lin28. Lin28 juntamente com TUT4 constitui um regulador negativo, o que influencia a maturação e a homeostase de microARNs [4,22]. Regulando genes a jusante, microARN está envolvida na diferenciação e proliferação celular, o metabolismo celular, respostas ao stress e a formação de vasos sanguíneos. Cheng et al [23] verificaram que após a inibição de miR-107, o crescimento das células HeLa de cancro do colo do útero e as células de cancro do pulmão A549 foi promovida. Marijn et al [24] verificaram que a expressão de miR-107 em células de cancro do ovário resistentes aos medicamentos foi regulada para baixo. Nosso estudo descobriu que Lin28 também pode restringir a maturação de miR-107, ea introdução de miR-107 aumenta célula cancerosa quimio-sensibilidade gástrica para OXA, PTX e ADM. Após a transfecção de anti-miR-107, esta sensibilidade diminuída. Pré-miR-107 provocou uma diminuição na expressão de Lin28, que ilustra que a via Lin28 /miR-107 pode ser envolvido nas alterações quimiossensibilidade de cancro gástrico.

Em resumo, mostrou que poderia inibir a Lin28 expressão de miR-107, assim se regulando-C-myc, P-gp e para baixo-regulação da ciclina D1, subsequentemente resultar em quimio-a resistência de células de cancro gástrico. A via Lin28 /miR-107 pode ser servida como uma de muitas vias de sinalização que está associado com o cancro gástrico quimio-resistência. Nosso estudo pode fornecer novos insights sobre o mecanismo chemoresistance câncer gástrico. Lin28 /miR-107 pode ser um novo potenciais alvos terapêuticos para o câncer gástrico quimioterapia-resistente.

Informações de Apoio

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doi: 10.1371. /journal.pone.0143716.s001

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